人类胚胎干细胞诱导型多潜能干细胞向功能成熟嗜酸性粒细胞分化研究（可编辑）

人类胚胎干细胞诱导型多潜能干细胞向功能成熟嗜酸性粒细胞分化研究（可编辑） 人类胚胎干细胞诱导型多潜能干细胞向功能成熟嗜酸 性粒细胞分化研究 同等学历申请博士学位 学校代码: 学 号: 博士研究生学位 人类胚胎干细胞/诱导型多潜能干细胞向功能 成熟嗜酸性粒细胞分化的研究 所院:血液学研究所 专业:内科学血液病 姓名:杨文钰 指导教师:竺晓凡 马峰 导师小组:袁卫平 郑国光 完成日期: 年月 中文摘要.. 英文摘要.. 前言..........................................?.............?. 材料与方法??.. 结果??.. 讨 论.............................................................. 结 论.............................................................. 参考文献.. 综述............................................................. 附录一:常见英文缩写.. 附录二:在学期间发论文及参加会议 致谢:............................................................ \ 人类胚胎干细胞/诱导型多潜能干细胞向功能成熟 嗜酸性粒细胞分化研究 ’ 摘要 目的:人类胚胎干细胞 ,及人类多潜能干细 胞 ,具有无限增殖及多向分化潜能,它 们的建立不仅为再生医学研究提供丰富了的细胞来源,而且为建立疾病特异 性模 型,最终实现个体化治疗提供了可能。目前已有报道在体外条件下从/诱导 分化出成熟血细胞,他们具有与外周血细胞相似的形态和功能。嗜酸性粒细 胞 参与人体多种炎症反应,从/诱导分化出成熟嗜酸性粒细 胞目前尚未报道。本研究从/出发,在体外条件下向功能成熟的嗜酸粒细 胞诱导分化,并对嗜酸性粒细胞形态,表面及内部颗粒蛋白表达水平,趋化游 走及 颗粒释放功能等多方面进行研究。为深入了解嗜酸性粒细胞早期分化,成熟 过程并 ,. 建立嗜酸性粒细胞相关的疾病模型提供实验依据。 射线照射的小鼠主动脉 研究方法:选取和未分化集落分别与经 一性腺一中肾区??,基质细胞共培养周,回收共培 养细胞加入干细胞因子,白细胞介素,白细胞介素, 配体等细胞因子进行悬浮培养周,每周对悬浮培养细胞计数, 染色观察细胞形态,定期采用免疫荧光染色方法观察成熟嗜酸性粒细胞 表面标记:嗜酸性粒细胞过氧化物酶 ,主要碱性蛋 白 及嗜碱性粒细胞标记, 表达水平,通过流式细胞学和方法观察细胞表面及细胞内部特 异性抗原及颗粒蛋白基因表达水平,于悬浮培养第,天行透射电镜检查观察 嗜酸性粒细胞胞浆内部特异性晶体结构,并进行嗜酸性粒细胞功能检测,观 察 来源嗜酸性粒细胞在不同浓度细胞因子作用下脱颗粒及趋化游走功能。 结果:研究结果表明,/共培养周即可产生少量阳性细胞,将此共 培养细胞回收并进行悬浮培养周可以获得大量高纯度嗜酸性粒细胞,且随着 培养时间延长,阳性率表达逐渐升高,从悬浮培养第天.%上升到第天 的.%,而嗜碱性粒细胞表面标记阳性率表达从.%下降至.%,研究证 明来源嗜酸性粒细胞早期发育经历一特定阶段,此阶段细胞同时表达嗜酸性粒 细胞,和嗜碱性粒细胞,表面标记,随着细胞逐渐成熟 嗜酸性粒细胞标记明显增加,而嗜碱性粒细胞标记阳性率逐渐减低。与外周血造血 干细胞来源的嗜酸性粒细胞发育过程极为相似。流式细胞学观察成熟嗜酸性粒细胞 .%上 表面标记一表达水平,呈现时间依赖性模式从液体培养第天 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 升至天.%,与表达水平升高趋势相一致。透射电镜检查分析,悬浮 培养第天透射电镜下可见部分嗜酸性粒细胞特异性晶体结构,尽管此时晶体结 构尚未完全形成。细胞功能检测发现,来源的高纯度成熟嗜酸性粒细胞在 刺激下可释放嗜酸性粒细胞特异性颗粒蛋白 ,且嗜酸性粒细胞在,白细胞介素一,嗜酸性粒细胞趋化 因子作用下具有趋化游走功能。我们采用同样细胞培养方法,对四株正 常人来源细胞与进行共培养一悬浮培养,研究发现四株均可以产 生数量不等的阳性嗜酸性粒细胞,其中产生嗜酸性粒细胞数量与接 近。 结论:我们已成功的从,诱导出大量高纯度功能成熟的嗜酸性粒细胞, 其具有与外周血成熟嗜酸性粒细胞相似的表面标记及功能。在其分化成熟过 程中经 历一特定阶段同时携带嗜酸性和嗜碱性粒细胞特征,与外周血及脐带血干细 胞来源 嗜酸性粒细胞相同。是一成熟嗜酸性粒细胞表面标记可以用来观察 /来源嗜酸性粒细胞早期发生、发育及分化成熟过程。 关键词:嗜酸性粒细胞,人类胚胎干细胞,人类诱导型多潜能干细胞 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 . :, . . 。 . . ., % . ./ . ,.: / . / ..... ? ? . , ../??. . ?, . 。, . . /?: ? ? ? , 【,.% .% .%, .% 。 ,北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 :, ,北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 人类胚胎干细胞/诱导型多潜能干细胞向功能 成熟嗜酸性粒细胞分化研究 ? ? ?? 一 上 ; 。 ?‘?‘ 日? 青 人类胚胎于细胞来源于囊胚内细胞团,其可以无限增殖同时又保持着多 向分化潜能。。具有正常的染色体核型,在特定的诱导分化条件下,能够产生 人体组织的所有细胞类型,为再生医学研究提供了良好的模型,然而由于细胞 来源于活的胚胎,目前其广泛运用还存在着诸多伦理和政治争议’。最近,人们通 过导入特定四因子重编程的方法建立了人类诱导的多潜能干细胞,其具 有人类细胞的多种特性,尽管目前人们还不知道人类细胞是否能完全模拟 细胞,但是已经证明它的发育和分化潜力与人类细胞是相当的。而且,在很 多方面,人类细胞作为再生医学的资源更利于运用。首先,从人类成体细胞诱 导产生细胞的技术较简单。其次,与人类细胞相比,细胞较少引起伦 理道德问题方面的争论。第三,人类细胞的出现为建立疾病特异性模型提供了 可能,事实上,以人类细胞为基础建立疾病模型睁,为最终实现个体化治疗 打下坚实的基础。 自从等首次报道从成功诱导分化出成熟血细胞以来,短短几 年时间,已先后有多个研究小组报道在体外条件下从诱导出功能成熟血细胞, 其具有与外周血细胞相似的表面标记及功能。 嗜酸性粒细胞是一种含有密集嗜酸性颗粒的多功能白细胞,参与体内多种炎 症反应包括寄生虫感染和过敏反应。在各种刺激因子作用下,嗜酸性粒细胞能够穿 过血管壁聚集到炎症部位,通过调节各种炎症反应发挥作用 嗜酸性粒细胞 胞 浆内含有密集均一橘红色颗粒,这些颗粒主要由四种颗粒蛋白组成,包括组成晶体 核的主要碱性蛋白,,组成基质的嗜酸性粒细胞阳离子蛋白, 还有嗜酸性粒细胞神经毒素和嗜酸性粒细胞过氧化物酶。其中, ,对各种组织都有毒性作用,包括心脏,大脑及支气管上皮。和是 酶,具有抗病毒活性们。 嗜酸性粒细胞起源于造血干细胞,其发育及增殖主要受粒细胞一单核细胞 集落刺激因子】,白细胞介素一,自细胞介素的调控引。 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 嗜酸性粒细胞相关疾病多数都有一过度表达。众所周知,嗜酸性粒细胞的发生 发育经过一个特殊的阶段即同时具有表达嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞两种细胞特性, 随后逐渐发育成为成熟的嗜酸性粒细胞。这种现象己在外周血干细胞及脐带血来源 嗜酸粒细胞发育过程中得到证实卜翱。 嗜酸型粒细胞相关疾病主要包括原发性嗜酸性粒细胞增多,反应性嗜酸性粒细 胞增多,原发性高嗜酸性粒细胞综合征,慢性嗜酸性粒细胞自血病 和其他血液系统肿瘤伴发的嗜酸性粒细胞增多。反应性嗜酸性粒细胞增多症多为短 期嗜酸性粒细胞增高,常见于非特异性炎症反应,如过敏反应,药物反应,或者是 细菌或者病毒感染嘲删。慢性嗜酸性粒细胞增多常见于慢性的持续性的感染,自身 免疫性疾病,特异性疾病,内分泌性疾病,特定的肿瘤性疾病业卜?。持续性嗜酸性 粒细胞增高主要的原因是寄生虫感染口钆施钥。在以上这些反应性嗜酸性粒细胞增多 中,人们认为主要是由于嗜酸性粒细胞生长因子刺激祖细胞的原因,常表现为嗜酸 性粒细胞一系的增高,偶尔也会伴随着其他血细胞的异常。反应性嗜酸粒细胞增多 通常是由于嗜酸性粒细胞细胞因子刺激,最重要的是,?的作用,而肿 瘤性嗜酸性粒细胞增多通常是由于突变引发细胞因子受体或者疾病特异性癌蛋白 激活。如急性粒单核细胞白血病伴嗜酸性粒细胞增多,慢性粒细胞白血病, 急性粒细胞白血病?等。 基于我们前期工作发现在/与共培养周,回收共培养细胞行悬 浮培养可见大量颗粒细胞,经?染色镜下可见细胞胞浆中含有密集均一 的橘红色颗粒,运用免疫,细胞化学染色及流式细胞学,透射电镜,方法对 细胞表面标记,内部颗粒结构,特异性基因进行检测,并对其功能进行观察,大量 实验数据证实,我们成功的从,诱导出成熟的嗜酸性粒细胞,其具有与 外周血成熟嗜酸性粒细胞相似的表面抗原,颗粒蛋白及功能。这一研究有助 于我们 更进一步了解了嗜酸性粒细胞发生,发育,分化及成熟的过程,对研究嗜酸性 粒细 胞相关性疾病及药物研发并建立特异性疾病模型具有重要的价值。 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 材料与方法 一.材料 . 主要仪器和试剂: 主要仪器 ? 超净台:培养箱?. 倒置光学显微镜 荧光显微镜及成像系统? 透射电子显微镜流式细胞仪?. 细胞离心涂片机 一 一 台式低温高速离心机?.. 台式常温高速离心机?..扩增仪核酸水平电泳仪??.. 凝胶成像分析系统??. 分析天平?... 主要试剂: /培养基美国 培养基?.美国 培养基?.美国??美国..美国 非必须氨基酸..美国..??.?..美国 ? .%/.?. ? .%/.??..?.. . 胎牛血清??....??. 碱性成纤维细胞生长因子.? 血管内皮细胞生长因子谷氨酰胺??..??.美国 青霉素/链霉素??.?.美国 ×一... ?.日本 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文??日本 ×??..??..日本 聚合酶?日本 引物?美国 琼脂糖??.和光纯药工业株式会社 分子??. 氯仿?. ? 异丙醇.. ? 无水乙醇 ? 抗体: : : : : : : : : : : 一 : :: ? :一 :: : : 一: : 一: : 一 :一 :?? / : 一: : : :一一 :: : : 一:: :: ?: : : : 一:.:: : : ??:: 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 : : ?:::: 一 .主要溶液的配制 培养液的配制 ,非必须氨基酸,胎牛血清, 取 一 . 滤器过滤,置于冰箱备用。 ,充分混匀,. 培养液配制 取? ,去补体化,充分混匀,. 滤器过滤,置于冰箱备用。 未分化细胞维持液的配制 , ,谷氨酰胺? 取 .., , , ,充分混匀,. 滤器 过滤,置于?冰箱备用。 /血细胞分化液配制 , , 取 ,去补体化,从., ,充分混 ,血管内皮生长因子 ,一 匀,. 滤器过滤,置于冰箱备用。 二. 实验方法 .小鼠胚胎纤维母细胞的制备: 取.天妊娠小鼠,行安乐死处置后,依次切开腹部皮肤及腹膜,取出胚胎, 用洗净,去除头部及内脏,将剩余胚胎组织放置于无菌培养皿中研磨粉碎,然 后用.%解离处理分钟,加入培养液,离心分 钟,弃去上清液,加入新鲜培养液于培养皿中进行细胞培养。隔天更换培养 液, 直至细胞铺满整个细胞培养皿底部,以:继代次后,部分细胞用于细胞培 养,部分存于液氮中备用。 ./培养: 将未分化和,,,种于经照射射线 或/处理后的上,每天更换培养液或 培养液。每隔天继代一次,维持和的未分化状态。 .小鼠主动脉一性腺一中肾区基质细胞的建立: 组织来源于.天/小鼠胚胎。行安乐死处置后,依次切开腹部 皮肤及腹膜,取出胚胎,用洗净,取小鼠组织置于无菌培养皿中研磨粉碎, 然后用.%解离处理分钟,加入培养液,离心 分钟,弃去上清液,加入新鲜培养液于培养皿中进行细胞培养。隔天换培养 液, 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 直至细胞铺满整个细胞培养皿底部,以:继代次后,部分细胞用于细胞培 养,部分存于液氮中备用。使用组织分别建立了和?细胞株, 使用冻存的细胞株时,将解冻后的细胞株每个培养盘×细胞数种于 培养盘中,培养两天,直至细胞平铺整个培养皿后,照射后备用。 ./与共培养: 取未分化/集落,每个集落包含.一×细胞,将显微镜置于超 净台内,镜下用枪尖将/集落分成数个小集落,然后将分割好的小克隆 每个孔培养板中平均?个克隆种于备用细胞上,每个明胶 包被的培养盘中加细胞分化液%胎牛血清,谷氨酰胺,% 非必需氨基酸溶液 :,抗坏血酸/ ,原液, 一,血管内皮生长因子和,将其置于? %:孵育箱中孵育。每天置换一半培养液,在共培养天收集上清浮游细胞, 底部贴壁细胞用.%/处理后回收。 ./向造血系统分化: /,/共培养细胞周,使用.%/处理细胞然 后回收,将回收的共培养细胞种于细胞悬浮细胞培养盘中 , ,并加入细胞分化液及各种细胞因子组合/ 屯 / 一,/ ,/ ,置于?.%:培养箱中孵育。根据细胞培 养条件更换细胞分化液,一般天更换一次培养液。 .悬浮细胞流式细胞学表型检测: /,/共培养第天,/悬浮培养 ,收集各阶段细胞进行流式细胞学表型检测。将各阶段细胞使用正 常兔血清孵育分钟阻断非特异性结合,然后加入各种连接,,的特 异性单克隆抗体与目标细胞结合,度避光反应分钟,反应结束后的细胞用冰 洗次后,使用 流式细胞仪进行分析 .普罗匹 定碘化物一染死细胞,进行设定。实验数据使用 进行 分析 .实验中使用的单克隆抗体包括:抗人,, ,,, ,,,?, ,,,, ,,,,, :一, ;, :& : , ,:在一些实验中,共培养和悬浮培养 细胞分别用抗一,抗一一,抗一抗一并使用 肋分选。 .?染色: /,/共培养第天及悬浮培养第天细胞,收集各阶 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 段细胞,分别用洗次,使用细胞离心涂片机制各细胞涂片,×/玻片,以 染液进行固定分钟,以自来水冲洗分钟后使用染液染色分钟, 自来水冲洗分钟后,自然晾干后显微镜下观察。 .免疫荧光染色: /,/共培养第天及悬浮培养第一天细胞,收集各阶 自然干 段细胞,用洗次,用细胞离心涂片机制备细胞涂片,ב/玻片。 燥后的细胞涂片用%多聚甲醛度下固定分钟,洗次,使用含% 脱脂奶粉和.%的,度下破膜处理分钟。滴加:稀 释一抗鼠抗人,鼠抗人,鼠抗人,鼠抗人置于湿盒中度 孵育过夜。用含%脱脂奶粉的洗次,滴加:稀释的或标记的二抗,室温孵育分钟, 滴加:稀释的 复染细胞核分钟,用洗次,封片后荧光显微镜下观察并拍照。 .电镜观察 取悬浮培养第天和天细胞,用含有%多聚甲醛/.%戊二醛的. 固定至少小时,然后%四氧化锇固定小时。乙醇梯度脱水,环氧树脂包 埋,制备超薄切片后用乙酸双氧铀和枸橼酸铅双染,标本使用透射电子显微 镜进行 观察并拍照。 .半定量 我们使用方法观察来源早期造血细胞及嗜酸性粒细胞特异性颗粒 蛋白基因表达。按照分离试剂盒说明,提取和成熟嗜酸性粒 细胞总。使用单链合成系统合成,然后行 扩增,电泳凝胶成像分析。整个实验中使用人类基因特异性引物避免与小鼠 细 胞交叉。提取及逆转录具体步骤如下: 处理过的无酶的 将洗过的复苏细胞或活细胞离心沉淀于. 管中,根据细胞量的大小加入.一. ,用枪反复吹打几次, 并颠倒混匀~次,室温静置,使细胞充分裂解 . 细胞裂解后液体加入.稀释缓冲液,. %酒精,将其混 合物加入收集管中,,离心分钟。 分钟 弃去离心后液体,加入.洗液入收集管中, ,.。 , 加入酶孵育液, /份标本黄色缓冲液 酶 ,置于室温孵育分钟。 加入. 酶中止液中止反应,离心分钟。 加入. 洗液,离心分钟。 弃上清后,加入. 洗液,离心分钟。 收集总:加入.无酶水后,离心分钟。 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 稀释,并 浓度测定:可以直接用仪器,取,用 以 为空白对照,分光光度计检测浓度和纯度/介于.~.之 稀释倍数/。 间,并计算浓度,浓度/ 将提取的一?保存。取处理过的管,按逆转录试剂盒说明, 随机引物加 的模板,用无酶的水补足到 ,?温育分钟后置于冰上,依次加 入 ,,酶抑制剂, 逆转录酶,?温育小时。 标本放置一?备用。 .嗜酸粒细胞功能检测 使用删嵌入膜孔直径为 ,孔培养板及不同浓度因子检测成熟嗜酸性粒细胞 趋化游走功能。具体步骤:将悬浮于 一/%培 养液中×成熟嗜酸性粒细胞加入上层间隔中,不同浓度,, 分别加入. 一/%中并置于下层培养盘中,?% 孵育小时,计数从上层间隔进入下层细胞培养盘中的细胞数量。根据 试剂盒说明,在人类分泌型刺激下,检测嗜酸性粒细胞释放量。 三、统计学分析: 所有实验数据描述为平均值?标准差?。 两个样本均数的比较 采用配对检验,.认为有统计学意义,数据用.统计软件进行分析。 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 结 果 .人类胚胎干细胞/诱导型多潜能干细胞及基质细胞, 形态学观察 未分化和集落形态极其相似,如图所示,组成集落的细胞 胞体均较小,圆形或椭圆形,核大,有一个或数个核仁,细胞聚集在一起呈克 隆性 生长,无明显界限,形状像鸟巢。基质细胞包括小鼠胚胎纤维母细胞及主 动脉一性腺一中肾基质细胞细胞如图所示:两种细胞均为纺锤形或星状 扁平细胞,胞核呈卵圆形。 / / .与共培养可产生极少量早期嗜酸性粒细胞 如图实验流程所示,未分化集落集落/孔培养板与经过 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 射线照射的细胞共培养周后可见集落分化,集落中心处隆起, 周边可见密集的小圆形或椭圆形细胞,此类细胞回收后制片,经免疫荧光染 色法 分析可见极少量细胞呈现,阳性均小于/。若共培养阶段延长 至天,且从第天始加入一/,同上法回收后制片进行免疫染 色发现细胞及的阳性率明显升高分别为.%,.%。 我们采用?方法对/共培养过程中细胞早期造血调控及嗜酸性 粒细胞发育分化基因表达水平进行检测,发现从共培养第天即出现早期造血 基 因一的表达,且随着共培养时间的延长,一,表达水平逐渐增加。 嗜酸性粒细胞特异性颗粒蛋白基因表达出现在共培养天,在共培养 天表达率明显增强。 . ?汀 觚 一一 一一 .图早期嗜酸性粒细瞻的产生/饿共培养第。天 免疫染色图片/共培养阶段早期造血相关基因及嗜酸性粒细胞 特异性颗粒蛋自基因表达 .液体培养条件下获得大量高纯度成熟嗜酸性粒细胞: 回收/。共培养周细胞,将其转入液体条件下继续培养并加入一系 列早期造血刺激因子:一,一,,配体。在液体培养条件下,细胞 快速大量增殖,一般在液体培养周达到增殖最高峰,平均从.?. 增加到.?.×,随着培养时间延长,细胞增殖量逐渐下降图?细 胞增殖量;?率。 众所周知,,是嗜酸性粒细胞颗粒蛋白重要的组成成分,而, 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 主要表达于成熟的嗜碱性粒细胞表面。我们选取液体培养不同阶段细胞 进行,,,免疫荧光染色,观察在来源嗜酸性粒细胞诱 导分化过程中特异性抗原表达水平变化。如图,所示:来源的嗜酸性 粒细胞特异性抗原表达水平呈现时间依赖性模式。随着培养时间的逐渐延长, 嗜 酸性粒细胞表面特异性抗原即,表达水平逐渐增加阳性率从第 天.%增加到第天.%,而嗜碱性粒细胞表面抗原,水平逐 渐减少阳性率从.%降至.%,细胞四种抗原表达在液体培养第天 呈现交叉现象,说明此阶段部分细胞同时表达嗜酸性和嗜碱性粒细胞特异性 抗 原,与骨髓造血干细胞及脐带血细胞来源嗜酸性粒细胞分化过程极为相 似。 ? ? ? ?,;一? ?一零一 一尜一 如 山 ? 加 ;再比 .一一一 罩日卫 一圈?圈 ???璺 圈??圈 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 图:嗜酸性粒细胞液体培养条件增殖能力及细胞表面抗原表达特点 来源嗜酸性粒细胞在液体培养条件下增殖能力及抗原表达水平变化 细胞增殖量;?辱液体培养第天蓟天殴.卿. 表达水平变化液体培养第.天.淝。洒 免疫染色照片: . 成熟嗜酸性粒细胞形态学特征: 来源成熟嗜酸性粒细胞形态与外周血嗜酸性粒细胞极其相似,如图所 示:?染色镜下可见,来源成熟嗜酸性粒细胞胞体椭圆形或长 梭形,胞浆淡染,可见密集粗大的桔红色颗粒,折光性强。胞核多为杆状或分 叶 状,染色质凝聚。嗜酸性粒细胞极易破碎,颗粒常分散于细胞周围。此类细胞 过 氧化物酶 阳性或强阳性图。分别选取液体培养天 及天细胞进行透射电镜检查。电镜下图所示:颗粒多呈椭圆形,有膜 包被,内含颗粒状基质,液体培养第天尚未出现嗜酸性粒细胞特异性晶体结 构,第天随着细胞逐渐成熟,细胞颗粒内可见散在结晶结构,尽管尚未完全 形成成熟嗜酸性粒细胞特有的方形或长方形晶体如图。此类颗粒含有 ,,,等嗜酸性粒细胞特异性蛋白及各种脂质。北京协和医学院中国医学科学 院博士研究生学位论文 ,、鬟 鎏爱 燮 藤 ?一 特异性晶体结构 图:来源嗜酸性粒细胞形态学特征 ?染色过氧化物 一??酶染色液体培养第天?天来源嗜酸性粒细胞透射电镜下形态一一一 学特征成熟嗜酸性粒细胞电镜结构示意图 .细胞来源的成熟嗜酸性粒细胞 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 选取四株正常人来源的细胞,分别为,,,, 如图实验流程所述,体外条件下诱导分化出成熟嗜酸性粒细胞。如图 所示:液体培养第天分别进行免疫染色观察细胞,,, 表达水平,阳性率分别为.%.%,阳性率为.%.,为 .%.%,旧为.%.%,其中诱导分化细胞,抗 原表达水平最高,接近于来源成熟嗜酸性粒细胞。 一是外周血成熟嗜酸性粒细胞表面重要抗原之一,如图所示,我 们采用流式细胞学方法分别对,,,,五株细胞共培 养天,液体培养第,,天 双阳性细胞表达水平进行检 测。实验发现五株细胞分别从共培养天 双阳性细胞表达水平 %左右增加液体培养天.%一.%。其中来源成熟嗜酸性粒细胞在液 体培养天一阳性率最高,与抗原表达水平随时间变化趋势 相一致。 ~ 晌 寸 晌 ???圈 ‘ ? 卜 ? 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文? 色: . . .亭% . :% 毫.喇 % 牙,% 瘩 .% ’ ’ 鹾;::’.:. 溪 翮謦.,? 彝 棒: ..一 ?? ‘’ .,’ 。 ? ;? 。% ‘ 。% .% 懑 雾 .% .戡 .: %。霉% , ;% .% .‘ 。% ; 。宦% 弓.% :.,壬卓 .。曲 ?.。 ; 辩 警 币 铆 ?辨 .% 审‘ 『辩 铺‘ .% 。% .% 霪 . ;%.掣% % .% % .% % .% ,‘ , 艋 ?? 擎一 习?‘ ?? 舞 ? 麓 ?‘ 麓瞳争 霉 .% .% .’%. .% 盈 琴 ., 吼‘ %,% % .观 , % 。% .罩 品 .% 娅 毛:。 二业山‘ 宴’ 饕 饕 %’ 潮 写孵 嬉. 翟 ?? .砖 .% .% 畔? .% 习?曩 ,% . . %.% %.% .霸 ?‘黟鸯‘? 黟‘ 喾 .% 。。% 一 辔拯铷星 图:来源成熟嗜酸性粒细胞来源嗜酸性粒细胞液体培养天 ,.。表达水平流式细胞学分析,来源细胞 双阳性细胞表达水平随时间变化趋势 .不同细胞因子组合对嗜酸性粒细胞诱导分化的作用: 细胞因子对嗜酸性粒细胞的发育、分化、成熟起着重要的作用,主要包括 拈???? ,。本实验选取细胞/组合,分别加入种不同细胞因 子组合:一//?/;/, ?/:一/卜/;一/;? /;/,观察不同细胞因子组合对嗜酸性粒细胞发育,分化 成熟的作用。我们选取液体培养天和天两个时间段,观察细胞总体增殖量及 阳性细胞增殖数量。如图所示:不论是液体培养第天还是天,一, 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 ,?三因子组合组其总细胞和阳性细胞增殖量均最多,其次为, 组,单加入或组细胞增殖量明显减少。本实验证实,, 这一组合对嗜酸性粒细胞发育分化成熟起重要作用。 × × 占. ,. ,?, . ... ?,?。. 一一 图:不同细咆因子组合对一来源细咆增殖影响 /共培养 天后分选.细胞×毋/种,通过加入不同细胞因子组合后进行液体培 养.观察液体培养,天细胞及总细胞增殖量变化 .来源成熟嗜酸性粒细胞表型特征分析: 采用流式细胞学技术对来源成熟嗜酸性粒细胞表面抗原表达水平进行分析, 如图所示:来源成熟嗜酸性粒细胞阴性,阳性,%细胞 阳性,部分阳性,阳性,,,, 均阴性。采用 方法对来源成熟嗜酸性粒细胞胞浆颗粒蛋白基因表达水平进行检测,如图 所示,未分化其,,,,均阴性,液体培养第天,随 着来源嗜酸性粒细胞逐渐成熟,其胞浆颗粒蛋白,,,及表面 基因阳性,且在液体培养中加入组,基因表达略强。 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文. .一 . . . 一. . 一 . . . 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 图:成熟嗜酸性粒细胞表型特征分析‘流式细胞学分析来源成熟嗜酸性 粒细胞表面抗原表达水平色区域显示同型对照,黑色部分表明特异性抗体表 达水平法检测成熟嗜酸性粒细胞特异性颗粒蛋白及一基因表达 .来源成熟嗜酸性粒细胞功能测定。 嗜酸性粒细胞参与多种炎症反应包括寄生虫感染和过敏反应。在各种刺激因 子 的作用下,嗜酸性粒细胞能够趋化游走到炎症部位,通过释放颗粒蛋白,炎症 介质 发挥细胞毒性作用。本实验观察来源成熟嗜酸性粒细胞在不同浓度 ,嗜酸性粒细胞趋化因子., 一作用下细胞趋化游走功能。如图所示:成熟嗜酸性粒细胞迁移率 在为最大%,细胞迁移率在最大为.%,在 时最大细胞迁移率为.%。 对成熟嗜酸性粒细胞脱颗粒功能检测采用 试剂盒。在的刺激 下,观察外周血成熟嗜酸性粒细胞、来源成熟嗜酸性粒细胞及脐带血来 源嗜酸性粒细胞释放含量%,如图所示:来源嗜酸性粒细胞释放 略低于外周血成熟嗜酸性粒细胞,明显高于脐带血来源嗜酸性粒细胞。 一零一山 ??一 苗篮图.来源成熟嗜酸性粒细胞功能检测在.一刺激下 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 体外条件下,刺激嗜酸性粒细胞释放 嗜酸性粒细胞游走功能检测 .外周血嗜酸性粒细胞,来源。 黑色:不同刺激因子作用 灰色:对照; 嗜酸性粒细胞。人类脐带血一细胞来源嗜酸性粒细胞 .鱼皇璺 旦苎型巳坐苎皇竺皇空璺皇墨塑堕皇巳盟婴皇璺皇竺空塑 ’’ 一 ’.., 俚。汀’ ’ / ’『..’ ’? ’?’ ’....? ’丁。.’ ‘.一广不., ’丁.’ ’..? ’.’ 侣 ’..? ’一’’. .丁. 粥 胁 表:引物亭勋 删圈? 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 图:液体培养第天细咆分选结果:液体培养第天分选: 阳性细胞群进行免疫荧光染色分析发现此类细胞呈现/双阳性.但睫着 培养时间延长。嗜酸性细胞表面抗原阳性率增高至掰雨嗜碱性粒细胞 抗原阳性率逐渐下降。早期阶段细胞经历一嗜酸性/嗜碱性细胞表面抗原共 , 表达阶段曹冒 一墨..?;零一. 罩.上卜 一冒曹一 脐带血?细胞来源嗜酸性粒细胞表面抗曝表达水平:铆 带血来源嗜酸性粒细胞洒.扭表达水平呈时间依赖性模式液体培养天及天细 胞免疫荧光染色照片/ / 量曹曹 液体培养天不同基质及细胞来源阳性细胞增殖量比较 .与不同基质细胞傩。心来源总细胞及纫 胞增殖量比较黑色区域为细咆增殖量.黑色白色区域为总细胞增殖量 液体培养天不同及基质细胞来源细胞免疫荧光染色照片 :北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 讨论 来源于囊胚内细胞团,它的建立为研究早期造血发生提供了理想的工具, 但是由于来源于活的胚胎,其广泛运用受到诸多伦理道德方面的限制圳。最 近,人们通过导入特定四个因子,,和重编程的方法建 立了艏。,其具有人类细胞的多种特性,包括形态,增殖能力,基质细胞 的依赖性和表面标记,基因表达。尽管目前人们还不知道人类细胞是否能完 全模拟细胞,但是已经证明他们的发育和分化潜能与人类细胞是相当的。 而且,在很多方面,细胞作为再生医学的资源更便于运用。首先,从人类成 体细胞诱导产生细胞的技术较简单。其次,与人类细胞相比,细胞较 少引起伦理道德问题方面的争论。第三,人类细胞的出现为建立疾病特异性 模型提供了可能,事实上,以人类细胞为基础建立疾病模型睁,为实现个体 化治疗打下坚实的基础。 迄今为止,已有多种成熟血细胞在体外条件下从,诱导分化成熟, 如中性粒细胞口拍引,血小板一,红细胞?圳,巨噬细胞‘钔朋’,自然杀伤细胞旧州 及树突状细胞卜跏,他们与外周血成熟血细胞具有相似的细胞特征及功能,为深入 了解血细胞早期发生发育,分化成熟过程及再生医学研究提供了丰富的细胞来源。 嗜酸性粒细胞是一种含有大量均匀,密集嗜酸性颗粒的白细胞,其主要起源 于骨髓阳性造血干细胞,可参与体内多种免疫反应,尤其在抗寄生虫感染及 型超敏反应中起着重要的作用。众所周知,嗜酸性粒细胞的发育,分化成熟过 程经历一个特殊的阶段,这一时期细胞同时表达嗜酸性细胞和嗜碱性细胞抗原特 征,随后嗜碱性粒细胞特性逐渐消失,嗜酸性粒细胞抗原表达逐渐增强,最终发 育为嗜酸性定向祖细胞陆?。这些细胞均可以在骨髓和外周血嗜酸性粒细胞发育, 分化成熟过程中观察到。 我们取,与共培养周发现极少量早期细胞,当加入 这一嗜酸性粒细胞分化成熟过程中重要的细胞因子时,细胞率明显增高,说 明此类细胞可以在一的作用下增殖分化并且成熟。将共培养细胞回收进行液体 培养,并加入一系列促进造血和对嗜酸性粒细胞发育分化成熟起重要作用的细胞 因子能够有效产生大量高纯度细胞,此类细胞在分化早期不仅表达嗜酸性粒 细胞表面抗原、,而且带有嗜碱性粒细胞表面抗原标记即,, 且随着培养时间逐渐延长培养周, 阳性率从液体培养第天的.%增 加到天%,阳性率亦增加至.%,而嗜碱性粒细胞表面标记, 从第天%左右分别下降至.%及.%。我们对液体培养天获得细胞进行 细胞化学染色,发现此类高纯度细胞染色与外周血成熟嗜酸性粒 细胞形态相似,细胞成长索状,或椭圆形,核多为杆状或分叶,染色质聚集成团, 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 胞浆中充满密集均一的桔红色颗粒,有折光性,成熟细胞极易破碎,颗粒多散落 于细胞周围。且阳性或强阳性。对液体培养天细胞行透射电镜检查发现细 胞内可见嗜酸性颗粒细胞特异性晶体结构,尽管此晶体结构尚未完全形成。嗜酸 性粒细胞参与体内多种免疫反应,通过趋化游走功能进入到炎症部位,在各种炎 症介质刺激下释放嗜酸性粒细胞颗粒蛋白,细胞因子,化学趋化因子,脂质介 质 发挥细胞杀伤及免疫调节作用我们对来源嗜酸性粒细胞进行功能检测发 现,在,,作用下嗜酸性粒细胞具有趋化游走功能,并且在 刺激下可释放嗜酸性粒细胞特异性颗粒蛋白,且其释放量与外周血成熟嗜 酸性粒细胞相当,明显高于脐带血细胞来源成熟嗜酸性粒细胞。 本实验在体外条件下成功地从诱导分化出功能成熟嗜酸性粒细胞,为研 究人类嗜酸性粒细胞早期发生,发育,’分化,成熟提供了有益的工具。我们研究 发现:与骨髓造血干细胞及脐带血细胞来源嗜酸性粒细胞分化过程相同啼’羽, 来源嗜酸性粒细胞分化成熟同样经历一特定阶段,细胞同时携带嗜酸性粒细胞 及嗜碱性粒细胞表面抗原,随着培养时间延长嗜碱性粒细胞抗原逐渐减低,嗜酸 性细胞抗原逐渐增强至%以上。一是成熟嗜酸性粒细胞重要的表面抗原 陆钔,我们使用流式细胞学方法观察来源嗜酸性粒细胞一双阳性 细胞表达水平随时间变化趋势,研究发现双阳性细胞表达率逐渐增加从共培养 天.%增加至液体培养天.%,与细胞表达水平变化相一致。我们对 成熟嗜酸性粒细胞表面抗原及颗粒蛋白基因进行检测发现,来源嗜酸性粒细胞 ,成熟嗜酸性粒细胞重要抗原成分一大部分阳性但一 一,中性粒细胞及嗜碱性粒细胞表面抗原,, 均一, 肥大细胞表面抗原 一,单核细胞抗原,一。通过基因检测分 析,来源嗜酸性粒细胞在液体培养早期即出现颗粒蛋白及一基因表达,且 随着基因的加入,表达水平升高。但是在液体培养天尚未检测到细 胞表面抗原表达,考虑可能与成熟度有关,来源嗜酸性粒细胞液体 培养天,细胞仍偏幼稚,抗原可能尚未表达。 来源于成体细胞,具有无限增殖及多向分化潜能。它的建立为研究疾病 发病机制,药物研发及进行个体化治疗开辟了广阔的前景。我们在体外条件 下从 表达水平最高,接 四株诱导分化出成熟的嗜酸性粒细胞,其中 近于,与其他实验小组报道诱导分化率低于的结果一致。运用此培 养体系,我们分别采用不同,和基质细胞,, 同样可以获得大量成熟嗜酸性粒细胞,说明此培养体系具有广泛适用性。 我们成功地从/获得大量高纯度成熟嗜酸性粒细胞,通过这一系统 有助于深入了解嗜酸性粒细胞早期发生,发育,分化及成熟过程。为建立嗜酸 性 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 ????????????????????????????????????????????????????????二.: 一一. 粒细胞相关性疾病模型,了解疾病发病机制,药物研发提供了丰富的细胞来 源和有益的实验模型。 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 结 论 .人类胚胎干细胞与共培养天可产生极少量成熟嗜酸性粒细胞, 其同时表达,抗原。且当于共培养第天加入一嗜酸性粒细胞分 化成熟重要细胞因子,及阳性率明显增加。 .回收共培养细胞进行液体培养周可以产生大量高纯度阳性细胞,其成熟 嗜酸性粒细胞表面抗原,表达水平随时间逐渐增加,而嗜碱性粒细胞标 记,逐渐降低,此四抗原表达水平有交叉现象,表明在液体培养过 程中存在一阶段细胞同时表达成熟嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞抗原特征。 .我们选取这一成熟嗜酸性粒细胞抗原观察来源嗜酸性粒细胞诱导 分化成熟变化规律,发现随着液体培养时间延长,一表达逐渐增强。且 与表达趋势相一致。 .我们采用同样培养方法,从四株,,,诱导分化产生成熟的 嗜酸性粒细胞。四株细胞产生阳性细胞量略有差别,且均低于产量。 .来源成熟嗜酸性粒细胞具有与外周血嗜酸性粒细胞相似的趋化游走及脱颗 粒功能。 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 参考文献 . ,, ::. . . , ::?. . , . : . ::. .::. . . ,,. ::?. . ,, . ::?. ,, .. ::?. .. ::?. ..’ . ::. .. .::. . , . ? . .::?. . . . ::?. . , .: . ::?. . . .: , , .:?.. . . , : .::?. . ., , . . ::. 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 . .,, . .::. . . , ..::?. . , , , . :.? 一 ..::?. . , . . . ,?,一 ::?. . , , , . : .::?。 . .. . .::?. . , , , . /. .::?. ., . : . .::?. . , , , .:.::?. . . , , .:, .::?. . . . .. ::?. ., : , , . ..::. ., , . ? :.::?. . . . ,.::?. . ., . . . ::. 、 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 . . ? , . ::?.. . ,. : :?. ., . ? . .::?. .: , . . ::?. . . , ?,? :?. : . . . . :. : .. , ?. : :?. . ,.? ::?. . . , .. : :?.. .,. : :. . , . ?? ::?. 一. . .一,::. . . . , ?’ :?. . : ., .北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 . ::?.. ., ::?. . .. , ? . ::?. . ., :. :?卜 , . .. : :?. . . . ? .::?. . . ., , , / : . . ::?. . .. ., : . .::. . , . . .: :. . ., , , 一 .::?. . 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 综述: 人类多潜能干细胞及其向血液系统诱导分化的研究进展 杨文钰综述 马峰竺晓凡审校 多潜能胚胎干细胞来源于人类囊胚内细胞团,其可以无限增殖同时又保 持着多向分化能力即可以分化成为人体各种组织的能力叫。人类细胞具有正常 的染色体核型,在特定的诱导分化条件下,能够产生人体组织的所有细胞类型。目 前人类细胞的运用主要分为两大类:一,为研究疾病发病机制,药物的研发及 组织工程这一新的疾病治疗方法提供良好的模型,比如糖尿病,脊髓损伤,帕金森 氏综合症和心肌梗塞等。二,干细胞的多向分化能力及胚胎的特性为我们探索人类 早期发生、发育机制提供了唯一的工具,而这一过程在低等物种中是无法模拟的。 然而人类细胞与特殊疾病类型无明显相关性,而且目前人类细胞的运用还存 在着诸多的伦理和政治争议】。 最近,人们通过导入特定因子重编程的方法建立了人类诱导的多潜能干细胞 睁。其具有人类细胞的多种特性,包括形态,增殖能力,基质细胞的依 赖和表面标记,基因表达,体内分化时启动子和端粒酶活性和端粒的形成。尽管目 前人们还不知道人类细胞是否能完全模拟细胞,但是已经证明他们的发育 和分化潜力与人类细胞是相当的。而且,在很多方面,人类细胞作为再生 医学的资源更利于运用。首先,从人类成体细胞诱导产生细胞的技术较简单。 其次,与人类细胞相比,细胞较少引起伦理道德问题方面的争论。第三,人 类细胞的出现为建立疾病特异性模型提供了可能,事实上,以人类细胞为 基础建立疾病模型阴们,最终可以为实现个体化治疗打下坚实的基础。本文将就多 潜能干细胞及其向血液系统分化研究进展作一综述。 一、人类细胞与其他多潜能干细胞 早期胚胎阶段,细胞的发育和分化是单向的过程。当细胞发育方向一旦明确后 就会丧失发育的潜能。人类对多潜能干细胞起源的探索要追溯到上个世纪年 代。等首次在经典的实验中证实已经分化的细胞仍然保留着多潜能分化的 遗传信息。他们通过将青蛙卵细胞去核,并将囊胚细胞核注入到脱核的青蛙卵细胞 浆中,在培养盘中培养卵细胞,一部分卵细胞发育成为蝌蚪幻。 世纪年代 使用青蛙肠细胞通过核转移技术产生成体动物引。这种方法被命名为成体细 胞核转移技术,在世纪年代此项技术已用于很多哺乳动物的产生, 其中最著名的例子就是多利羊耵。最近还有报道通过技术在灵长类动物中产 生胚胎干细胞盯。 年,和首次提出由小鼠体细胞通过转移因子可将 细胞重编程到干细胞状态阳,这在人类干细胞史上是一项具有里程碑式的研究。他 们第一次证明了利用少数能够维持细胞未分化状态的基因可以使成体细胞 重编 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 程为多潜能干细胞。为了筛选维持干细胞未分化状态的因子,他们把个候选的 重编程因子转入小鼠胚胎纤维母细胞中,这些因子携带一半乳糖苷酶和新 霉素耐药基因的融合基因可以在位点表达,其在小鼠的细胞上表达,但 是对于小鼠细胞的维持并不是必须的。用这个基因转染然后在滋养层 细胞上培养,~些耐药的克隆出现具有样的形态,通过逐步淘汰最终选出个 转录基因/,,肌和能足够保持细胞的干细胞特性, 将其命名为诱导的多潜能干细胞。虽然第一代细胞可以形成胚胎体 和畸胎瘤,但是他们注射入囊胚内形成嵌合鼠的能力却很弱们。 自从最初的报道以来,研究组和其他研究者先后报道了一系列研究证 实并延伸了最初观察结果。研究表明细胞不论是从遗传特性还是发育上与 细胞极为相似哪。运用同样的四因子组合,研究小组成功地从人类成体 细胞诱导出多潜能干细胞睛,而其他小组也同样有效的从体细胞产生出猴和人类的 样细胞乜 钉。与的方法不同的是,有一个研究小组采用/, 和,产生出人类细胞嘲。目前,不论是在啮齿类动物,灵长类动 物还是人类我们都可以利用相似的因子组合建立细胞,说明控制多潜能性的基 础转录网络在这些物种当中是相通的。研究表明的激活容易引起恶性肿瘤的 产生,且坳基因在重编程过程中并不是必需的口刎,因此在后续的建立过 程中很多试验小组采用了去除?的三因子组合。 除和方法外,还有其他诱导核编程的方法。当多潜能细胞如细胞 与体细胞融合,将会产生四倍体细胞获得多潜能性乜乳棚。在特殊的培养条件下,生 殖细胞可以重编程为多潜能细胞,但是效率很低乜,很难进行大量的研究。 二、细胞和细胞的异同点 细胞在很多方面具有与细胞相同的生物学特性。细胞具有正常的染 色体核型,表达的基因模式也与细胞相同。另一方面,细胞具有产生三胚层 一外胚层,内胚层及中胚层的能力,而且能够产生功能成熟的组织细胞。这些特性 是可能会在今后的再生医学研究中发挥重要的作用。 人类细胞来源于活的胚胎,这在伦理方面引起极大的关注。而且由于人类无 法产生自体的细胞,因此还需要解决组织不相容性的问题?。相反,人类 细胞可以来源于自体和组织相容性的成体细胞。在特定的条件下分化成三胚层细 胞,为移植治疗遗传异常及退行性疾病提供了理想的工具。 然而,重编程因子整合到体细胞中到目前仍是个随机事件,而且与细胞相比, 细胞的多潜能程度尚未被充分证实。研究表明和朋彤是原癌基因,虽然, 它们可以提高重编程的效率,但是在由来的小鼠,这些因子的表达和激活可引 起肿瘤的产生乜们,因此目前很多研究者通过避免使用和肌群作为重编程因 子或选择内源性表达这些基因的细胞,这样可以使细胞更加安全昭’四。其 他的 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 肿瘤发生的可能性在于一逆转录病毒或者腺病毒载体插入突变基因。最近研究采 用无病毒载体整合重编程基因,通过去除这些载体,提供了较为安全的产生的 方法‘洲幻。然而,细胞是否在功能上能完全等同于细胞是目前尚待解决的最 重要的问题哺羽。 三、人类多潜能干细胞向血液系统分化研究进展 等首次报道从人类细胞成功的分化诱导出血细胞阳’。在他们系 统中,人类细胞与人类卵黄囊来源的基质细胞共培养可以成功地诱导分化成血 细胞。在血细胞克隆中红细胞表达一球蛋白这一明确造血的标志,说明人类细 胞来源的血细胞可以发展成明确的造血洲。这一结果被其他研究小组采用各种方法 所证实‘?侧。 然而,有些研究得出不同的结论。胚胎体产生血细胞的方法产生的红细胞% 以上只表达胚胎球蛋白,而不是一球蛋白 有研究通过克隆培养的方法观察到,人类细胞来源的红细胞可以不断发育 成熟。一球蛋白和一球蛋白的表达表现出明显的转换模式,与正常人类红细 胞的 发育非常相似?。在与小鼠胚胎肝脏细胞来源的基质细胞共培养天,人类细 胞来源的红细胞.%表达一球蛋白,再培养天,其表达率增加到%,表明人 类细胞来源的红细胞在临床应用中可以有两个角色。他们是研究人类细胞获,:磅 得完全成熟的红细胞,但是,人类细胞来源的红细胞无限的资源及快速的成熟 】。 方式为替代治疗提供了美好的前景?棚一 人类细胞由来的血小板的产生为细胞在临床的使用再一次开辟了广阔的 前景。人们首次报道由细胞可以产生出 阳性巨核细胞。钔。以后研 究通过人类细胞与细胞共培养进一步证实了人类细胞由来的巨核细胞特性,如多倍体核,细胞骨架蛋白和通过 的信号传导能力“羽。最近有报道人 类细胞来源的血小板具有与体内分离的血小板相似的功能和形态特点“驯,这为 不久的将来血小板运用于临床提出了广阔的应用前景。 人类细胞