副溶血性弧菌细胞猝灭及代谢物组提取方法（可编辑）

副溶血性弧菌细胞猝灭及代谢物组提取方法（可编辑） 副溶血性弧菌细胞猝灭及代谢物组提取方法 第 39 卷 分 析 化 学 FENXI HUAXUE 研 究 第 期2011 年 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry ~ : / D O I 1 03 7 2 4 S PJ1 0 9 62 0 1 10 0 0 0 0 副 溶 血 性 弧 菌 细 胞 猝 灭 及 代 谢 物 组 提 取 方 法 的 优 化 * 赵 强 刘 海 泉 卢 瑛 孙 晓 红 潘 迎 捷 赵 勇 上 海 海 洋 大 学 食 品 学 院, 上 海 201306 摘 要 以 气 相 色 谱 质 谱 联 用GC MS 为 分 析 方 法, 比 较 了 液 氮 和 75% 甲 醇 80 两 种 溶 液 对 副 溶 血 性- - - ? , 、 、 、 / 、 / 、 弧 菌 细 胞 的 猝 灭 效 果 以 及 氯 仿 75% 冰 甲 醇 水 甲 醇 氯 仿 水 10 3 1, 甲 醇 氯 仿 水3 1 1, 甲 - - ?? V V - - ?? V V / 。 , 醇 氯 仿1 1, 6 种 提 取 剂 对 副 溶 血 性 弧 菌 代 谢 物 组 的 提 取 效 果 结 果 表 明 用 75% 甲 醇 80 猝 灭 副 - ? V V - ? 溶 血 性 弧 菌 时, 出 现 了 代 谢 物 泄 漏 现 象, 而 液 氮 猝 灭 则 不 存 在 这 个 现 象; 检 索 发 现, 采 用 75% 冰 甲 醇 提 取 获 得 了 47 种 代 谢 物, 峰 面 积 标 准 偏 差 为 8.02%, 其 它 5 种 提 取 剂 获 得 代 谢 物 种 类 少 于 40 种, 且 重 现 性 差。 比 较 色 谱 峰 数 量、 面 积 和 重 现 性 后 发 现, 液 氮 猝 灭、75% 冰 甲 醇 提 取 适 于 副 溶 血 性 弧 菌 代 谢 物 组 提 取。 关 键 词 副 溶 血 性 弧 菌; 猝 灭 方 法; 代 谢 物 组 提 取 方 法; 气 相 色 谱 质 谱 联 用 - 引 言 1代 谢 组 学 通 过 定 性 与 定 量 研 究 生 物 体 内 代 谢 物 的 变 化 研 究 生 物 体 代 谢 途 径, 代 谢 组 学 主 要 关 注 分 [1] [2] [3,4] 子 量 小 于 1000 的 小 分 子 。 目 前, 代 谢 组 学 的 研 究 已 在 药 物 研 发 、 代 谢 成 分 研 究、 疾 病 检 测 、 生 物 标 [5] 。 , 志 物 寻 找 等 方 面 展 开 近 几 年 代 谢 组 学 在 微 生 物 研 究 中 迅 速 展 开 已 对 部 分 微 生 物 代 谢 物 提 取 方 法 [6 8] [9] ~ 进 行 了 优 化 , 并 研 究 了 猝 灭 过 程 中 的 冷 休 克 现 象 。 副 溶 血 性 弧 菌 是 一 种 常 见 的 食 源 性 致 病 菌, 由 该 菌 引 起 的 食 物 中 毒 事 件 占 细 菌 性 食 物 中 毒 事 件 [10] 。 。 60% 以 上 代 谢 组 水 平 研 究 是 副 溶 血 性 弧 菌 的 致 病 机 理 的 重 要 研 究 内 容 本 研 究 对 副 溶 血 性 弧 菌 细 胞 猝 灭 及 代 谢 物 组 提 取 方 法 进 行 了 优 化, 为 副 溶 血 性 弧 菌 代 谢 组 学 分 析 奠 定 了 基 础。 实 验 部 分 2 仪 器 与 试 剂 21 5975B 型 质 谱、6890N 型 气 相 色 谱 美 国 Agilent 公 司;Milli Q 制 水 系 统 美 国 Millipore 公 司;JY92 - - IIN 超 声 波 细 胞 粉 碎 机 宁 波 新 芝 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司;Hermle Z36HK 冷 冻 离 心 机 德 国 Hermle 公 ; ; 。 司 真 空 干 燥 机 美 国 Eppendorf 公 司 1 mL 色 谱 注 射 器 上 海 ? 录 贸 易 有 限 公 司 甲 基 三 甲 基 硅 烷 基 三 氟 乙 酰 胺MSTFA、 甲 氧 胺 盐 酸 盐、 吡 啶 色 谱 纯, 美 国 Sigma 公 司; 甲 N- - N- 醇、 氯 仿 分 析 纯, 国 药 集 团; 胰 蛋 白 胨 大 豆 培 养 基 北 京 陆 桥 技 术 责 任 有 限 公 司;副 溶 血 性 弧 菌 。 ATCC33846 中 国 科 学 院 微 生 物 研 究 所 色 谱 质 谱 条 件 22 TM SLB 5ms 色 谱 柱60 m 0.25 mm 0.25 mm; 进 样 口 温 度 280 ; 分 流 比 5 1, 进 样 量 1 mL; 载 气: - × × ? ? ; ; : , , , 氦 气 溶 剂 延 迟 4 min 载 气 流 速 1.0 mL/min 色 谱 柱 初 始 温 度 120 保 持 4 min 以 3 /min 升 至 270 ? ? , 保 持 10 min。EI 离 子 源: 温 度,230 ; 电 子 能 量, 70 eV; 四 级 杆 温 度, 150 ; 全 扫 描 模 式, 扫 描 范 围 ? ? ? m/z 18 800, 扫 描 速 度: 20 次/s。 ~ 样 品 前 处 理 23 , , 将 副 溶 血 性 弧 菌 接 种 于 含 5 mL TSB 的 试 管 150 mm 15 mm 中 在 37 以 180 r/min 摇 床 培 养 × ? 10 h, 至 OD 0.8, 连 续 活 化 2 次, 作 为 种 子 液。 吸 取 200 mL 种 子 液, 接 种 于 含 100 mL TSB 的 三 角 瓶 600 250 mL 中, 在 37 , 以 180 r/min 摇 床 培 养 12 hOD 1.0。 取 2 mL 菌 液 于 4 8000 r/min 下 离 心 5 ? 600 ? 2011 01 01 收 稿;2011 05 24 接 受 -- -- 、 、 、 本 文 系 上 海 市 科 技 兴 农 重 点 攻 关 项 目 沪 农 科 攻 字 2005 第 4 2 号 2006 第 10 5 号 2009 第 6 1 号 上 海 市 教 育 委 员 会 重 点 学 科 建 设 项 - - - 目 J50704 资 助 * E mail: yzhao@//0>. -分 析 化 学 第 39 卷 , , , ; , min 弃 上 清 液 一 组 加 约 1 mL 液 氮 于 冰 上 放 置 5 min 另 一 组 加 1.0 mL 75% 甲 醇 80 轻 柔 吸 打 - ? 均 匀, 于 冰 上 放 置 5 min 猝 灭, 在 4 8000 r/min 下 离 心 5 min, 上 清 液 用 于 检 测 代 谢 物 泄 漏; 菌 体 沉 淀 分 ? 别 加 3.0 mL 提 取 溶 剂,180 W 超 声 波 破 碎 2 s, 停 止 4 s, 超 声 60 次。 超 声 波 破 碎 后 溶 液 于 4 14000 ? r/min 下 离 心 10 min, 吸 取 500 mL 上 清 液,30 真 空 干 燥 6 h, 加 入 30 mL 20 g/L 甲 氧 胺 吡 啶 溶 液,60 ? ? , , 。 。 水 浴 1 h 再 加 入 45 mL MSTFA 60 水 浴 1 h 最 后 吸 取 1 mL 上 清 液 进 行 GC MS 分 析 ? - 数 据 分 析 与 统 计 检 验 24 本 研 究 采 用 NIST、Origin 8.0、Past 1.79 和 SPSS 13.0 对 实 验 结 果 进 行 分 析, 根 据 不 同 方 法 得 到 的 色 。 谱 总 离 子 图 中 峰 数 量 和 峰 面 积 判 断 不 同 方 法 的 优 劣 匹 配 度 为 样 品 质 谱 图 与 标 准 图 谱 的 正 检 索 相 似 系 数0 1000, 匹 配 度 700 为 适 合 匹 配 度。 可 能 性 为 样 品 质 谱 图 与 标 准 图 谱 的 正、 反 检 索 相 似 系 数 的 综 ~ ? 合, 置 信 区 间 为 80%。 ? 结 果 与 讨 论 3 细 胞 猝 灭 方 法 比 较 31 比 较 75% 甲 醇 80 与 液 氮 两 种 溶 剂 对 副 溶 血 性 弧 菌 细 胞 的 猝 灭 效 果。 用 75% 甲 醇 80 和 - ? - ? , 。 , , 液 氮 分 别 处 理 同 一 批 样 品 用 6 种 溶 剂 对 代 谢 物 进 行 提 取 由 较 图 1 和 表 1 可 见 用 液 氮 猝 灭 后 以 75% 冰 甲 醇 提 取, 获 得 峰 数 量 最 多。75% 甲 醇 80 猝 灭 时, 细 胞 出 现 代 谢 物 泄 漏 图 2 和 表 2。 液 氮 - ? 猝 灭 速 度 快, 不 存 在 代 谢 物 泄 漏 问 题, 且 操 作 简 便, 因 此, 液 氮 更 适 合 于 副 溶 血 性 弧 菌 猝 灭。 图 1 液 氮1 和 75% 甲 醇 80 2 猝 灭 后,6 种 溶 剂 提 取 的 代 谢 物 组 的 总 离 子 流 图 - ? Fig.1 Total ion current chromatograms of metabolites extracted by 6 solvents after quenching by liquid nitrogen and 75% cold methanol 80 - ? 1. 氯 仿;2.75% 冰 甲 醇;3. 水;4. 甲 醇 氯 仿 水10 3 1, / ;5. 甲 醇 氯 仿 水3 1 1, / ;6. 甲 醇 氯 仿1 1, / 。Extrac - - ?? V V - - ?? V V - ? V V - ting Solvents: 1;Chloroform; 2,75% Wold ethanol; 3. Water; 4. Methanol: chloroform water10 3 1, / ; 5. Methanol chloroform ? ?? V V ? / / ?water 3?1?1 V , V ; 6. Methanol?chloroform 1?1, V V图 2 75% 甲 醇 80 猝 灭 后, 上 清 液 的 总 离 子 流 图 - ? Fig.2 Total ion current chromatogram of supernatant after quenching by 75% methanol at 80 - ?第 期 赵 强 等: 副 溶 血 性 弧 菌 细 胞 猝 灭 及 代 谢 物 组 提 取 方 法 的 优 化 表 1 两 种 淬 灭 方 法 所 得 代 谢 物 组 的 峰 数 量 与 峰 面 积 Table 1 Quantity and peak areas of metabolites extracted by different solvents after quenching with liquid nitrogen or 75% meth - anol 80 - ?? 液 氮 Liquid nitrogen 淬 灭 方 法 Quenching 甲 醇 氯 仿 水 甲 醇 氯 仿 水 - -- -甲 醇 氯 仿 - method 75% 冰 甲 醇 氯 仿 水 Methanol Methanol - - Methanol - 提 取 溶 剂 75% Cold methanol Chloroform Water chloroform chloroform - - chloroform Solvent water water? 共 有 峰 数 量 The number of 47 44 22 22 31 43 peaks 峰 面 积 Peak area 100 8.02 80 3.83 50 13.5 30 21.4 600 78.8 90 8.94 ? ? ? ? ? ? 7 10 × 75% 甲 醇, 80 75% Methanol at 80 - ? - ? 淬 灭 方 法 Quenching 甲 醇 氯 仿 水 甲 醇 氯 仿 水 - -- -甲 醇 氯 仿 - method 75% 冰 甲 醇 氯 仿 水 Methanol Methanol - - Methanol - 提 取 溶 剂 75% Cold methanol Chloroform Water chloroform chloroform - - chloroform Solvent water water? 共 有 峰 数 量 The number of 31 42 25 27 40 33 peaks 峰 面 积 Peak area 70 5.14 100 6.72 60 7.09 80 9.60 700 6.81 80 11.9 ? ? ? ? ? ? 7 10 × 甲 醇 氯 仿 水 10 3 1 / ; 甲 醇 氯 仿 水 3 1 1 / ; 甲 醇 氯 仿 1 1 / 。 - - ?? ?? V V - - ???? V V - ?? V V Methanol chloroform water 10 3 1 / ; Methanol chloroform water 3 1 1 / ; methanol chloroform 1 1 / . - - ?? ?? V V - - ???? V V - ?? V V 表 2 75% 甲 醇 80 猝 灭 后, 代 谢 物 泄 漏 的 种 类 及 相 对 含 量 - ? Table 2 Species and content of metabolites in supernatant after quenching by 75% methanol 80 - ? 保 留 时 间 相 对 峰 面 积 可 能 性 可 能 的 代 谢 物 匹 配 度 Retention time Relative peak Probability Endogenous metabolites Match min area% % 11.541 2,5 二 甲 基 苯 甲 醛 Benzaldehyde, 2,5 dimethyl 0.86 877 26.0 - - - 12.163 丙 三 醇 Glycerol 17.54 934 95.0 12.233 磷 酸 Phosphorous acid 43.21 925 83.9 14.079 二 甲 基 硅 烷 Dimethylsilanediol 0.61 763 85.5 , 21.299 2 4 二 叔 丁 基 苯 酚 Phenol, 2,4 bis1,1 dimethylethyl 0.90 904 52.6 - - - - , 22.192 2 6 二 叔 丁 基 苯 酚 2,6 Ditert. butylphenoxy 2.13 833 77.8 - - - 35.879 棕 榈 酸 甲 酯 Hexadecanoic acid, methyl ester 1.15 878 48.8 39.545 棕 榈 酸 Palmitic acid 11.8 916 97.6 肌 醇 Cyclohexane 1,2,3,4,5,6 hexol 1.45 858 46.6 - - 42.136 硬 脂 酸 甲 酯 Octadecanoic acid, methyl ester 1.45 898 69.1 44.464 Androst 2 en 17 amine, 4,4 dimethyl 2 phenylethyl , 5 0.81 672 54.5 ---- - - N-- - α- 45.365, 硬 脂 酸 Stearic acid 7.16 904 96.6 54.318 棕 榈 酸 甘 油 酯 Palmitate 4.44 898 97.3 59.84 硬 脂 酸 甘 油 酯 Glyceryl monostearate 4.31 875 49.5 61.704 D Galactopyranoside, methyl, cyclic phenylboronate 2.47 580 15.4 à--代 谢 物 组 提 取 方 法 比 较 32 , , ; / 由 图 1 可 见 以 75% 冰 甲 醇 为 提 取 剂 时 获 得 的 代 谢 物 种 类 最 多 以 甲 醇 氯 仿 水3 1 1, 为 提 - - ?? V V 取 剂 时, 所 提 取 代 谢 物 量 最 多, 但 重 现 性 较 差。 计 算 6 种 提 取 溶 剂 3 个 平 行 中 峰 面 积 的 相 对 标 准 偏 差, 结 果 显 示,75% 冰 甲 醇、 氯 仿、 水、 甲 醇 氯 仿 水10 3 1, / 、 甲 醇 氯 仿 水3 1 1, / 和 甲 醇 氯 仿 - - ?? V V - - ?? V V - 1 1, / 的 标 准 偏 差 依 次 为 8.02%, 4.79%, 27.00%, 71.33%, 13.10% 和 9.93%。6 种 提 取 溶 剂 的 提 取 ? V V 结 果 经 主 成 分 分 析PCA 及 聚 类 分 析CA 发 现, 甲 醇 氯 仿 水3 1 1, / 提 取 所 得 代 谢 物 种 类 与 前 5 - - ?? V V 。 , 、 、 种 差 异 较 大 图 3 对 75% 冰 甲 醇 提 取 所 得 总 离 子 图 分 析 表 3 根 据 峰 面 积 峰 数 量 相 对 标 准 偏 差 及 物 种 数 量, 确 定 75% 冰 甲 醇 最 适 合 于 副 溶 血 性 弧 菌 代 谢 物 组 的 提 取。 方 法 稳 定 性 测 定 33 样 品 经 液 氮 猝 灭、75% 冰 甲 醇 提 取, 衍 生 化 后, 进 行 GC MS 分 析, 比 较 所 得 图 谱 的 峰 数 量 及 峰 面 积。 - , , , 结 果 显 示 所 有 共 有 峰 保 留 时 间 重 现 性 良 好 几 乎 所 有 峰 面 积 相 对 标 准 偏 差 均 小 于 5% 总 峰 面 积 相 对分 析 化 学 第 39 卷 , 。 标 准 偏 差 为 5.56% 说 明 此 方 法 的 稳 定 性 较 好 图 3 图 3 液 氮 猝 灭 后 6 种 提 取 溶 剂 提 取 结 果 主 成 分 分 析 图 1 和 聚 类 分 析 图 2Fig.3 PCA and cluster analysis CA of metabolites extracted by 6 solvents after quenching by liquidnitrogen ; ; ; / ; / ; 1. 氯 仿 2. 75% 冰 甲 醇 3. 水 4. 甲 醇 氯 仿 水 10 3 1, 5. 甲 醇 氯 仿 水 3 1 1, 6. 甲 醇 氯 仿 - - ?? V V - - ?? V V - 1 1, / 。Extracting Solvents: 1, Chloroform; 2, 75% cold methanol; 3, Water; 4, Methanol chloroform water ? V V ? ? 10 3 1, / ; 5, Methanol chloroform water3 1 1, / ; 6, Methanol chloroform1 1, / . ?? V V ? ? ?? V V ? ? V V , 表 3 液 氮 猝 灭 75% 冰 甲 醇 提 取 所 得 代 谢 物 种 类Table 3 Species of metabolites extracted by 75% cold methanol after quenching by liquid nitrogen保 留 时 间 相 对 峰 面 积 可 能 性 可 能 的 代 谢 物 匹 配 度 Retention time Relative peak Probability Endogenous metabolites Match min area% % 7.787 缬 氨 酸 Valine 0.35 734 83.7 9.213 2 氨 基,4 甲 基 戊 酰 胺 Pentanamide, 2 amino 4 methyl , S 0.42 595 7.74 - - - -- - - 9.432 甲 基 环 己 基 二 甲 氧 基 硅 烷 Silane, cyclohexyldimethoxymethyl 0.16 617 36.4 - 12.11 丙 三 醇 Glycerol 4.87 925 95.2 12.189 磷 酸 Phosphorous acid 27.34 924 83.0 12.644 2,6,10,15 四 甲 基 十 七 烷 Heptadecane, 2,6,10,15 tetramethyl 0.42 591 5 28 - - -13.677 丁 二 酸 Butanedioic acid 0.19 772 66.7 17.545 三 氟 乙 酰 甘 氨 酸 Glycine, trifluoroacetyl , 1.28 538 19.3 N- - ,, , 20.301 2 6 10 15 四 甲 基 十 七 烷 Heptadecane, 2,6,10,15 tetramethyl 0.40 823 6.7 - - - 二 甲 基 叔 丁 基 硅 哌 啶-2- 羧 酸 2-Piperidinecarboxylic acid, ter- t bu - 20.835 0.38 702 77.2 tyldimethylsilyl ester, 21.264 2,4 二 叔 丁 基 苯 酚 Phenol, 2,4 bis1,1 dimethylethyl 0.42 900 55.0 - - - - 2,6 二 叔 丁 基 苯 三 甲 基 硅 氧 烷 Trimethyl2,6 ditert. butylphenoxy - - 22.148 1.15 839 81.3 silane 28.107 2,6,10,15 四 甲 基 十 七 烷 Heptadecane, 2,6,10,15 tetramethyl 0.46 823 5.43 - - - 32.851 1,2 二 羟 基 环 己 烯 0.29 586 13.2 - 33.166 肉 豆 蔻 酸 Tetradecanoic acid 0.41 848 93.2 33.466 甲 氧 胺 果 糖 Fructose methyloxime 0.21 809 63.5 - O- 33.594 甲 氧 胺 果 糖 Fructose methyloxime 4.29 924 93.4 - O- 33 927 甲 氧 胺 果 糖 Fructose methyloxime 2.75 881 88.8- O- 35.187 棕 榈 油 酸 9 Hexadecenoic acid, methyl ester, Z 0.21 754 26.6 - - 35.318 2 甲 基 十 七 烷 Heptadecane, 2 methyl 0.38 696 4.81 - - - 35.852 棕 榈 酸 Hexadecanoic acid 0.70 890 67.0 邻 苯 二 甲 酸 正 丁 异 辛 酯 1,2 Benzenedicarboxylic acid, butyl octyl - 37.025 0.20 834 14 6ester, 39.545 棕 榈 酸 Hexadecanoic acid 20.08 917 97.2 40.631 环 己 六 醇 Inositol 0.99 858 49.9 41.864 正 二 十 七 烷 Heptacosane 0.44 732 11.942.109 硬 脂 酸 Octadecanoic acid 0.30 820 67.2 44.437 Androst 2 en 17 amine, 4,4 dimethyl 2 phenylethyl , 5 2.47 670 60.1 ---- - - N-- - ?- 45.356 硬 脂 酸 Octadecanoic acid 14.70 907 96.6 47.824 正 二 十 七 烷 Heptacosane 0.32 764 7.31第 期 赵 强 等: 副 溶 血 性 弧 菌 细 胞 猝 灭 及 代 谢 物 组 提 取 方 法 的 优 化 续 表 3Continued to Table 3 保 留 时 间 相 对 峰 面 积 可 能 性 可 能 的 代 谢 物 匹 配 度 Retention time Relative peak Probability Endogenous metabolites Match min area% % 49.382 肉 豆 蔻 酸 甘 油 酯 Tetradecanoicacid,monoglyceride 0.40 523 39.0 , 49.653 3-Trifluoromethylbenzylamine, N N-diundecyl 0.68 627 38.1 51.351 4 Methylthio phenyl 1,2 carbazoledicarboximide 0.89 596 64.1 - - N- - - 53.267 正 二 十 七 烷 Heptacosane 0.31 699 11.6Estra 1,3,510 trien 3 ol, 17 trimethylsiloxy , bistrimethylsilyl - - -- ?- - 53.469 0.69 535 78.9 phosphate 54.291 棕 榈 酸 甘 油 酯 Glycerol monopalmitate 4.01 895 96.6 54.51 2 Dimethyldodecylsilyloxynaphthalene 0.27 563 17.4 - 59.805 硬 脂 酸 甘 油 酯 Glyceryl monostearate 2.71 866 50.4 61.642 亚 麻 酸 甘 油 酯 Gamma monolinolenin 0.64 553 15.0 -放 置 时 间 对 提 取 代 谢 物 组 的 影 响 34 样 品 经 液 氮 猝 灭、75% 冰 甲 醇 提 取 的 代 谢 物 组 , 。 衍 生 化 后 在 20 放 置 48 h 对 放 置 前 后 样 品 进 - ? 行 分 析。 结 果 发 现, 峰 数 量 未 发 生 变 化, 单 个 峰 面 积 相 对 标 准 偏 差 小 于 5%, 总 峰 面 积 相 对 标 准 偏 差 为 7.84%。 结 果 表 明, 放 置 前 后 样 品 未 发 生 明 显 变 化。 结 论 4以 GC MS 为 代 谢 组 分 析 方 法, 对 副 溶 血 性 弧 菌 - 。 细 胞 猝 灭 及 代 谢 物 组 提 取 方 法 进 行 优 化 用 NIST 图 3 3 次 分 析 的 总 离 子 图 叠 图 质 谱 数 据 库 快 速 检 索 代 谢 物, 发 现 75% 甲 醇 80 - Fig.3 Stack of total ion curren chromatograms of 3 猝 灭 过 程 中 磷 酸、 棕 榈 酸 和 丙 三 醇 等 出 现 泄 漏。 ? repetitions 比 较 6 种 提 取 剂 提 取 所 得 总 离 子 图 发 现,75% 冰 甲 醇 , 。 , , , 获 得 峰 数 量 最 多 重 现 性 较 好 液 氮 猝 灭 75% 冰 甲 醇 提 取 适 用 于 副 溶 血 性 弧 菌 代 谢 物 组 为 副 溶 血 性 弧 菌 代 谢 组 学 分 析 奠 定 了 良 好 基 础。 R e f e r e n c e s 许 国 旺 : 代 谢 组 学 方 法 与 应 用 北 京: 1 XUGuowanM e t a b o l o m e M e t h o d a n d A l i c a t i o n - .Beiin Science - g p p jg , : 科 学 出 版 社 Press 2 0 0 88~9 , , , ,: 2 NicholsonJK ConnellyJLindonJC. N a tR e vD r u D i s c o v2 0 0 212 153~161 g , , : 3 RashedMS. JC h r o m a t o rB 2 0 0 17581 27~48 g , , : 4 ClatonPT. I n h e r i tM e t a bD i s2 0 0 1242 139~150 y , , , ,: 5 MaS ChowdhurySK AltonKB. C u r rD r u g M e t a b. 2 0 0 675 503~523 , , , ,: 6 FaijesM MarsAE SmidEJ. M i c r o b i a l C e l l F a c t o r i e s 2 0 0 7627 , , , 王 庆 昭, 杨 育 谛, 陈 洵, 赵 学 明 7 WANGQin Zhao YANGYuDiCHENXunZHAOXueMinC h i n e s e Jg- - - g 分 析 化 学 , , : A n a lC h e m2 0 0 6349 1295~1298 , , , : 8 MaharjanRP FerenciT. A n a l y t i c a l B i o c h e m i s t r y 2 0 0 33131 145~154 , , , , , : 9 WittmannC KromerJO KieferPetl. A n a lB i o c h e m2 0 0 43271 135~139 李 晓 春 中 国 预 防 医 学 杂 志 , , : 10 LIXiaoChunC h i n a P r e v e n t i v e M e d i c i n e 2 0 0 455 370~373 -