维生素K2 对K562细胞生长抑制作用的实验研究（医学论文）

维生素K2 对K562细胞生长抑制作用的实验研究（医学论文） 维生素K2 对K562细胞生长抑制作用的实验研究 作者:邵泽叶 ，陈宝安 ，夏国华，丁家华，朱怀刚 【摘要,目的: 研究维生素K2 ,VK 2 ,对慢性粒细胞白血病急性变细胞株K562细胞的生长抑制作用及其机制。 : 采用形态学检测VK2 作用后的细胞形态改变，MTT方法检测VK2 对K562细胞的生长抑制作用，流式细胞仪Annexin-V FITC .PI分析细胞凋亡，PI染色分析细胞周期变化，RT.PCR技术检测抗凋亡基因bcl.2、促凋亡基因bax的达。 结果: 经VK2 作用后细胞出现明显的形态学改变:细胞变小，核固缩，核染色质聚集边挤于核膜内侧呈新月形以及典型凋亡小体形成等;MTT结果显示VK 2 对K562细胞有明显的抑制作用，作用72h半数抑制浓度为25.1μmol・L-1 ;流式细胞仪检测结果显示随着VK 2 浓度的增加凋亡率逐渐增高,P<0.05,，随着作用时间的延长凋亡率也逐渐增高,P<0.05,;VK 2 作用72h，S期细胞逐渐减少,r=-0.99，P<0.05,，G 0 .G 1 期细胞逐渐增加,r=1.00,，细胞被阻滞在G 0 .G 1 期;随着VK 2 浓度的增高抗凋亡基因bcl.2表达明显下调，而促凋亡基因bax表达无明显差异。 结论: VK 2 通过诱导K562细胞凋亡抑制其增殖，并呈浓度和时间依赖性;抗凋亡基因bcl.2下调可能是VK 2 诱导K562细胞发生凋亡的机制之一。 更多精品文档,欢迎来我主页查询 ,关键词, 维生素K 2 ;K562细胞;细胞凋亡;细胞周期;基因表达;抗凋亡基因bcl.2 VK2 ,是天然的具有萘醌核结构的化合物，有凝血 维生素K2 , 活性，临床上作为止血药物已应用多年。近几年有关VK2 抗肿瘤的作用1:7, 日益受到重视，但对作用机制研究甚少。本实验研究了VK 2 对K562细胞的生长增殖、诱导凋亡作用及其机制。 1 与方法 1.1 材料与细胞培养 VK2 购自Sigma公司，用无水乙醇配成浓度为5、10、20和40μmol・L-1 ，实验表明该浓度乙醇对K562细胞生长无影响。K562细胞株购自上海细胞生物研究所，用RPMI.1640培养液加10%小牛血清，在37?饱和湿度条件下体积分数为0.05的CO 2 培养箱中培养。 1.2 MTT比色法取对数生长期细胞，调细胞浓度为1×10 5 ml-1 接种于96孔培养板，实验组分成4组分别加入不同浓度,5、10、20和40μmol・L-1 ,VK2 ，对照组不加药，另设空白对照组,只加培养液,。置37?、体积分数为0.05的CO2 饱和湿度培养箱中孵育，分别于24、48、72和96h取出加MTT,终浓度为更多精品文档,欢迎来我主页查询 0.5mg・ml-1 ,20μl，继续培养4h，弃上清，加二甲亚砜150μl，摇床震荡10min，用酶标仪,B-L,570nm波长读取光密度，以时间为横坐标、A值为纵坐标绘制细胞生长曲线，半数抑制浓度,IC 50 ,采用Logit法计算。实验重复3次，每孔设复孔5个，取均值为最终结果。 1.3 细胞形态学观察取对数生长期细胞，调细胞浓度为1×10 5 ml -1 ，试验组加入不同浓度VK2 ，对照组不加药培养72h，收集细胞涂片作瑞氏染色观察细胞形态的改变。 取对数生长期细胞调细胞浓度为1×10 5 ml-1 ，接种于6孔培养板，分别加入不同浓度,0、5、10、20和40μmol・ml -1 ,的VK 2 ，分别于孵育24、48、72和96h收集细胞，经PBS洗涤后加Annexin-V FITC 和PI避光作用10min后在流式细胞仪上检测凋亡细胞。结果Annexin- ?染色阳性PI染色阴性和Annexin-?染色阳性PI染 色阳性细胞均为凋亡细胞，而Annexin-?染色阴性PI染色阳性为机械损伤细胞。 1.4 细胞周期分析 于Annexin-?.PI检测细胞凋亡的同时收集1×10 6 细胞进行细胞周期分析，所有资料经Multieycle1.0DNA分析软件分析。 1.5 RT.PCR半定量检测bcl.2和baxmRNA表达引物由上海生更多精品文档,欢迎来我主页查询 工生物工程公司合成:bax,258bp,:5′.ACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC.3′，R:5′.TGTC-CAGCCGCATGATGGTTC.3′;bcl.2,326bp,F:5′.GACT-TCGCCGAGATGTCCA.3′， R:5′.GTCTTGAGAGA-CAGCCAGGA.3′;GAPDH,内对照,F:5′.TCCCATCAC-CATCTTCCA.3′， R:5′.CATCACGCCACAGTTTCC.3′。总RNA抽提:按Promema公司提供的试剂盒建议的步骤操作。逆转录:在0.5ml PCR管中加1μg总RNA、0.5μg Oligo,dT,引物、4μl缓冲液、2μl10mmol・L-1 dNTP混合物、0.5μl,20U,重组核酸酶抑制剂Rna-sin、1μl,10U,AMV逆转录酶,Promega公司,，总反应体系20μl，42?逆转录1h，然后95?5min使酶失活。上述cDNA加80μl dd H2 O稀释后，取4μl用于50μl PCR反应。PCR:在50μl反应体系中加入PCR缓冲液,Taka-ra,5μl、4μl2.5mmol・L-1 dNTP、4μl25mmol・L-1 MgCl 2 、GAPDH内对照引物和基因特异性引物,上、下游,各20pmol、cDNA稀释液4μl、Taq DNA聚合酶0.5μl,2.5U,，95?加热预变性后94?45s、58?1min、72?1min进行35个PCR循环，最后在72?延伸7min。 取5μl PCR产物加1μl上样缓冲液混匀，1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下拍摄，用Kodak EDAS120凝胶电泳分析系统对电泳条带进行光密度分析。 更多精品文档,欢迎来我主页查询 1.6 统计学处理 验结果以均数?差表示，实验数据用SPSS for windows 实 统计软件进行处理，采用单因素方差分析和双因素相关分析，P<0.05为差异有显著性。 2 结 果 2.1 MTT检测结果VK2 对K562细胞具有明显的生长抑制作用，不同浓度,0、5、10、20和40μmol・L-1 ,VK2 具有不同的生长抑制作用,P<0.01,，作用不同时间,24、48、72和96h,其生长抑制作用也不同,P<0.05,，见图1。经加权直线回归方程计算，72h IC 50 为25.10μmol・L -1 。 图1 VK2 作用后K562细胞的生长曲线图 2.2 细胞形态对照组细胞形态相对较，胞体较大，胞浆较多，胞浆中有少量的空泡;胞核大，核染色质细致，核仁清楚。而经VK2 处理组细胞胞浆中含有大量空泡呈蜂窝状;胞核变小，核染色质边挤、固缩形成典型的凋亡小体。见图2。a.凋亡细胞;b.正常对照图2 VK2 作用72h后细胞形态变化 2.3 流式细胞仪检测结果不同浓度,5、10、20和更多精品文档,欢迎来我主页查询 40μmol・L-1 ,的VK2 作用于细胞48h的凋亡率分别是,13.0?2.0,%、,13.9?2.3,%、,16.3?2.6,%和,22.4?2.8,%， P<0.01,;作用72h凋亡率明显高于对照组的,13.0?1.5,%, 分别为,14.8?1.3,%、,17.3?2.1,%、,19.4?1.8,%和,30.2?2.3,%，显著高于对照组的,15.5?2.2,%,P<0.01,;作用96h凋亡率为,17.8?2.5,%、 ,31.0?2.5,%、,40.4?2.9,%和,48.7?2.5,%，显著高于对照组的,18.9?2.1,%,P<0.05,。随着时间的延长凋亡率也逐渐增高,P<0.05,。见图3。 图3 VK2 作用后凋亡率与药物浓度和作用时间关系 2.4 bcl.2和bax mRNA的表达与VK 2 作用之间的关系不同浓度,5、10、20和40μmol・L-1 ,的VK2 作用72h后抗凋亡基因bcl.2表达分别为1.11?0.02、0.77?0.01、0.51?0.04和0.35?0.02，与对照组,1.48?0.03,相比呈明显 下调,P<0.05,;而促凋亡基因bax则没有明显的差异,P>0.05,。见图4、5、6。 图4 VK 2 作用72h后bcl.2、baxmRNA表达变化1.正常对照;2:5.依次为5、10、20和40μmol・L-1 VK 2 ;6.Marker 图5 VK 2 作用72h bcl.2电泳图1.正常对照;2:5.依次为5、10、20和40μmol・L-1 VK 2 ;6.Marker 图6 VK2 作用72h bax电泳图 2.5 VK 2 作用K562细胞72h后，抗凋亡基因bcl.2mRNA表达变化与细胞凋亡率之间的关系不同浓度,0、5、10、更多精品文档,欢迎来我主页查询 20和40μmol・L-1 ,的VK2 作用 K562细胞72h后bcl.2的表达分别为1.48?0.03、1.11?0.02、0.77?0.01、 0.51?0.04和0.35?0.02，而此时的凋亡率分别为,15.5?2.2,%、,15.8?2.7,%、,17.3?2.1,%、,19.4?1.8,%和,30.2?2.3,%，采用双因素相关分析发现bcl.2mRNA下调与细胞的凋亡呈负相关,r=-0.99，P<0.05,。 2.6 VK2 对K562细胞周期的影响流式细胞仪检测的DNA含量图中，在G 1 期细胞前出现亚G1 峰即凋亡峰，对照组也有少量的凋亡。不同浓度的药物作用K562细胞72h分析周期的变化发现，随着药物浓度的增加G 0 .G 1 期细胞逐渐增多,r=1.00,，而S期细胞逐渐减少,r=-0.99，P<0.05,，细胞被阻止在G0 .G 1 期。见图7。a.正常对照;b.40μmol・L-1 VK2 形成典型的凋亡峰 图7 VK 2 作用72h后细胞周期的变化 3 讨 论 近几年，国外学者已经研究证实VK2 能诱导白血病细胞株HL.60,1:3, 、MDS,4:7, 、肝癌,5, 和鼻咽癌,8, 等多种细胞发生凋亡，特别是近几年国外有报道VK 2 能选择性地诱导白血病细胞发生凋亡，而对正常骨髓细胞只有微弱的抑制作用3, 。国内相关报道鲜见，尤其对VK 2 诱导K562细胞凋亡及机制的研更多精品文档,欢迎来我主页查询 究国内外尚未见报道。 本实验研究了VK2 对体外培养K562细胞增殖的抑制作用及其作用机制，实验结果表明，VK 2 作用K562细胞后细胞的生长受到 .效应依赖关系，作用72h IC50 为明显的抑制，并呈时间、 浓度 25.10μmol・L-1 ;进一步研究表明，VK2 抑制K562细胞增殖主要是通过诱导其凋亡实现的。细胞形态学上表现为凋亡细胞典型形态学特征，如细胞体积变小，胞浆空泡化，核染色质固缩、边聚于核膜内缘呈新月形以及形成典型的凋亡小体等;流式分析结果显示，细胞的凋亡率与VK2 的浓度和作用时间也呈明显的量效和时效关系;细胞周期分析还发现，随着VK 2 浓度的增加，S期细胞逐渐下降，G 0 .G 1 期细胞逐渐增多，细胞被阻滞在G0 .G1 期;RT.PCR结果显示，在VK 2 诱导的K562细胞发生凋亡的过程中，抗凋亡基因bcl.2明显下调，而促凋亡基因bax则无明显变化。Bcl.2和bax是一对正负凋亡调节基因,9，10, ，但本实验结果表明bcl.2下调可能是VK2 诱导K562细胞发生凋亡的主要机制之一，而与促凋亡基因bax无关。凋亡的发生是多因素、多通路参与的一系列复杂过程，在VK 2 诱导K562细胞发生凋亡的过程中是否还存在其他的凋亡机制尚有待进一步研究。VK 2 下调K562细胞株bcl.2mRNA的表达国内未见报道，本实验结果将为临床使用V 2 治疗相关病人提供理论依据。 更多精品文档,欢迎来我主页查询 ,参考文献, ,1,MIYAZAWA K，YAGUCHI M，FUNATO K，et al.Apoptosis.dif-fefentiation inducing effects of vitamin K2 on HL.60cells:dichoto-mous nature of vitamin K2 in leukemia cell,J,.Leukemia，2001，15,7,:1111.1117. ,2,FUNATO K，MIYAZAWA K，YAGUCHI M，et al.Combinationof22-oxa-1，25-dihydroxyvitamin D3 ，a vitamin D 3 derivative，with vi-tamin K2 ,VK 2 , synergitically enhances cell differentiation but sup-presses VK 2 inducing apoptosis in HL.60cells,J,.Leukemia，2002， 16,8,:1519.1527. ,3,YAGUCHI M，MIYAZA K，KATAGIRI T，et al.Vitamin K2 and its derivatives induce apoptosis in leukemia cells and enhance the ef-fect of all-trans retinoic acid,J,.Leukemia， 1997，11,6,:779.787. ,4,TAKAMI A，NAKAO S，ONTACHI Y，et al.Successful therapy of myelodysplastic syndrome with menatetrenone，a vitamin K 2 analog ,J,.Int J Hematol，1999，69,1,:24.26. 更多精品文档,欢迎来我主页查询 ,5,NISHIKAWA Y，CARR B I，WANG M，et al.Growth inhibition of hepatoma cells induced by vitamin K and its analogs,J,.J BiolChem，1995，270,47,:28304.28310. ,6,YAGUCHIM，MIYAZAWA K，OTAWAM，et al.Vitamin K2 selec-tively induces apoptosis of blastic cells in myelodysplastic syn-drome:flow cytometric detection of apoptotic cells using APO2.7monoclonal antibody,J,.Leukemia，1998，12,9,:1392. ,7,NISHIMAKI K，MIYAZAWA M，YAGUCH I，et al.Vitamin K2 in-duces apoptosis of a novel cell line established from a patient with myelodysplastic syndrome in blastic transformation,J,.Leukemia，1999，13:1399.1405. ,8,WU F Y，CHANG NT，CHEN W J，et al.Vitamin K3 -induced cell cycle arrest and apoptotic cell death are accompained by altered ex-pression of c-fos and c-myc in nasopharyngeal carcinoma cells,J,.Oncogene，1993，8 ,8,:2237. 更多精品文档,欢迎来我主页查询 ,9,HU Y，BENEDICTM A，WU D，et al.Bcl.XL interacts with Apaf-1and inhibits Apaf-1-dependent caspase-9activation,J,.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95 ,8,:4386.4391. ,10,PAN O，ROURKE K，DIXITVM.Caspase-9，Bcl-XL， and APaf-1form a ternary complex,J,.J Biol Chem，1998， 273,10,:5841. 更多精品文档,欢迎来我主页查询