胆红素的检测的现实意义

成都中医药大学2011年秋季学期期末考试 立题 格式 论据 行文 结论 总分 得分 姓 名： 学 号： 班 级： 胆红素的前景概况 摘要：近年来，健康问题逐渐成为人们最关注的问题之一。健康保健，健康体检逐渐成为人们生活中不可缺少的一部分。在这些检查中，也不断地反映出一些情况来。为了方便找出更有效的各种疾病的诊断、治疗方法，了解胆红素与人体各种疾病的关系便变得势在必行。而血清胆红素在各种疾病诊断、治疗、及预后工作中的就显得尤为重要了。血清胆红素浓度的测定在疾病诊断中也扮演着极其重要的角色，无论是肝功检测还是心血管疾病的诊断检测，血清胆红素都可作为一个很有力的参考依据。于是，提高检测的灵敏度和特异度便可通过分析比较各种检测方法，找出精准度相对较高的检测方法或者寻找到更好的检测方法。 关键字：胆红素;重氮法;化学氧化法;KHC3法 正文：胆红素（英文：Bilirubin）是胆色素的一种，它是人胆汁中的主要色素，呈橙黄色，同时也是内源性抗氧化活性的生物还原剂，它是血红蛋白分解代谢的一种产物[1]，即它是体内铁卟啉化合物的主要代谢产物，有毒性，可对大脑和神经系统引起不可逆的损害，但也有抗氧化剂功能，可以抑制亚油酸和磷脂的氧化。胆红素是临床上判定黄疸的重要依据，也是肝功能的重要指标。胆红素有游离胆红素和结合胆红素两种形式，结合胆红素不存在分子内氢键，可以直接与重氮试剂结合，生成紫红色偶氮化合物，因此又称直接胆红素，游离胆红素存在分子内氢键[2]，不能直接与重氮试剂结合，必须先用乙醇或尿素破坏氢键，才能与重氮试剂反应，因此又称间接胆红素。正常人每天产生250-350mg的胆红素，其中70%是衰老红细胞血红蛋白血红素的降解产物，即衰老细胞被单核吞噬细胞系统破坏，释放出血红蛋白，再被分解成珠蛋白和血红素。胆红素裂解成胆绿素，胆绿素还原成胆红素，即游离胆红素。肝脏可以有效地摄取血浆游离胆红素，并将其转化成结合胆红素，提高其极性和水溶性，使其易于随胆汁排入肠道。研究明，肝脏每小时可以清除100g胆红素，比单核吞噬细胞系统产生胆红素的速度快十倍，所以正常人的血浆游离胆红素的浓度极低。当然，胆红素还和体内很多因素有着密切的关系，因此，分析找到最有效的胆红素的检测方法，是现在的形势对我们的要求。 1、胆红素的4种常规检测方法 1.1 重氮法 1.1.1重氮法的原理   血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应产生偶氮胆红素，所以称为直胆，因此重氮法又称1min胆红素测定法，非结合胆红素测定时要以咖啡因-苯甲酸钠为加速剂破坏胆红素氢键再与重氮试剂反应，抗坏血酸破坏剩余重氮试剂，加入碱性酒石酸钠使最大吸光度由530nm转到598nm，非胆红素的黄色色素及其它红色与棕色色素产生的吸光度降至可忽略不计，使灵敏度和特异性升高，最后形成的绿色是由兰色的碱性偶氮胆红素和咖啡因与对氨基苯磺酸之间形成的黄色色素混合而成。 1.1.2重氮法的操作 　操作： 总胆管 结合管 对照管 血清（ml） 0.2 0.2 0.2 咖啡因-苯甲酸钠试剂（ml） 1.6 1.6 重氮试剂（ml） 0.4 0.4 混匀后，总胆管置室温10min，结合管置37℃1min NaN3（ml） 0.05 咖啡因-苯甲酸钠试剂（ml） 1.55 碱性酒石酸钠溶液（ml） 1.2 1.2 1.2                       以对照调零，测各管A600，查标准曲线 正常参考值：血总胆红素5.1~19umol/L(0.3~1.1mg/dl) 血清结合胆红素1.7~6.8umol/L(0.1~0.4mg/dl 1.1.3重氮法的评价   本法稳定性好、灵敏度高、轻度溶血无影响,.重氮法作为全国检验学会推荐测定胆红素的常规方法，有较高的灵敏度、精密度和较宽的线性，但试剂无法长期稳定，溶血可使胆红素测定值偏低，以叠氮钠作为防腐剂时能破坏偶氮试剂，终止偶氮反应，使重氮反应不完全，甚至不呈色[3]。 1.2钒酸氧化法 1.2.1钒酸氧化法的原理   胆红素在酸性环境下 (PH3.0)被钒酸氧化成胆绿素，使胆红素所特有的黄色减少，这样在450nm波长 处测得钒酸加入前后的吸光度，由两吸光度的差值即可得出胆红素的含量(直接胆红素试剂缓冲液中含有阻止间接胆红素被钒酸氧化的成份)。即将标本加入缓冲液中，等吸光度稳定后，读取吸光度Al，加入钒酸溶，吸光度立即下降，经一段时间(约5分钟)趋于稳定，读取吸光度A2，将 A2-A1与标准品的A2-A1比较，即可测出胆红素的含量[4]。 1.2.2钒酸氧化法的操作   ①双波长 450-460nm，温度37℃。②终点法2，吸光度下降法。③第一试剂200μl与标本10μl，孵育5分钟，读取一次吸光度，这时加入第二试剂50μl孵育5分钟，第二次读取吸光度，前后两次吸光度之差与标准吸光度之差比较，可得样品胆红素量。光径：0.5cm。 1.2.3钒酸氧化法的评价   钒酸盐氧化法中，试剂稳定，而且操作简单，尤其适合在各种自动生化分析仪的应用。在重复性、准确性、稳定性、抗干扰能力及线性范围等方面均较理想[5]。钒酸盐氧化法因其稳定性、精密度、准确度均能满足实验室要求，且试剂简单易得[6]，各项指标符合方法学要求，因而是值得推荐的胆红素常规测定方法，近年来被许多实验广泛采用。 1.3氧化酶法 1.3.1氧化酶法的原理   1987年，Kosaka[7]和Doumas[8]分别了血清直接胆红素的酶法测定，实验以二牛磺酸胆红素作为直接胆红素标准，将反应液pH控制在酸性范围，在此条件下，血清中的葡萄糖醛酸结合胆红素和大部分蛋白结合胆红素都被氧化，胆红素在胆红素氧化酶的作用下与氧气反应，生成胆绿素，胆绿素在与水作用。胆红素最大吸收峰在450nm附近，在胆红素氧化酶的作用下，总胆红素在450nm吸光度的下降与胆红素成正比[9]。 1.3.2氧化酶法的操作 测定方法：取5ml试管若干，按表1顺序加液。 表1酶法[10]测定结合胆红素操作步骤 步骤 样品 标准 空白 测定 空白 测定 柠檬酸缓冲液（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 样本（μl） 50 50 - - 二牛磺酸胆红素（μl） - - 50 50 去离子水（μl） 50 - 50 - BOX（μl） - 50 - 50 混匀，置30℃水浴保温15分钟，在460rim处读各管吸光度值( A) 1.3.3氧化酶法的评价   1987年Kosaka[7]报告了在含十二烷基硫酸钠的条件下，PH8.0的tris-HCL缓冲溶液中，氧化酶法可催化各种类型的胆红素，使胆红素所在的450nm吸收峰下降，以此测定血清总胆红素。而在无十二烷基硫酸钠，PH3.5-4.5的乳酸——枸櫞酸纳缓冲溶液，氧化酶法特异性地降解结合胆红素，在PH10.0的甘氨酸——NaOH中氧化酶法特异性地降解胆红素葡萄糖醛酸苷。关于氧化酶法测定血清胆红素的条件，国内外文献已有多次报导[8,11]。从分折原理上可以看出氧化酶法测定胆红素应具有很好的特异性．因为氧化酶法仅对胆红素起作用，在酶法铡定胆红素过程中我们以450nm为检测波长，通过检测加入氧化酶后胆红素在该波长下降程度来得出胆红素的浓度，由此可见不与氧化酶反应的物质均不会导致该测定过程。而且，氧化酶法具有明显的抗干扰能力。临床送检标本中最易发生的干扰因素之一就是溶血．有时约占临床送检标本的10%。而且各标本溶血程度也不一致，若将这种不同程度的溶血干扰带入胆红紊测定中，就会对黄疸的临床鉴别、分型及诊斯产生不良影响氧化酶法抗溶血干扰的特点则可使此类标本的误差太大减小[12]。 1.4 KHC3法 1.4.1 KHC3法的原理   总胆红素检测原理：样本中含有的结合胆红素和未结合胆红素被试剂溶解，结合胆红素和未结合胆红素在电子转移介质KHC3作用下生成蓝绿色的显色基团——胆蓝素，在红外区域700nm处有最大的吸光度，且反应前后吸光度变化与胆红素的浓度成正比，通过测定700 nm处吸光度的增加计算出胆红素的浓度。②直接胆红素检测原理：结合胆红素被电子转移介质KHC3氧化生成蓝绿色的胆蓝素，胆蓝素在红外区域700 nm处有最大的吸光度，与结合胆红素浓度成正比。未结合胆红素在直接胆红素试剂中未能被溶解，仍与白蛋白结合，所以不能直接检测[13]。 1.4.2 KHC3法的操作   取高、中、低不同胆红素浓度水平的患者血清标本各30份，分别取样、混匀。取上述高、中、低值混合血清在暗室中各自分装成20份，并于-20℃避光冰冻保存。每天取高、低值混合血清各一份，待其在避光状态下完全溶解后测定血清胆红素，连续测定20d，按照NCCLS[14]的要求，，取患者黄疸血清和健康人正常血清标本各一份，分别编为⑤号、①号。将⑤号高值和①号低值分别按3:1、2:2、1:3的比例混合作为④、③、②号。将5个不同浓度的标本随机排列，测定每份标本中的血清胆红素，重复测定4次，取其均值为测定值，与设定值做线性对比[15]。 1.4.3KHC3法的评价   KHC3法测定血清中总胆红素和直接胆红素方法简单，为液体单试剂，室温保存，试剂稳定，无需配制直接上机使用，满足临床检验工作需要[16]。KHC3法作为胆红素一种新的测定方法，准确度高、线性范围宽，精密度好，抗干扰能力强，溶血、脂血无明显干扰，符合IFCC和酶学委员会推荐方法的各项技术要求，是一种崭新、实用的胆红素测定方法。 2、目前较为常用的检测方法比较   化学氧化法具有较好的线性范围，化学氧化法>钒酸氧化法>氧化酶法>KHC3法，4种方法的线性范围基本符合应用要求。化学氧化法、钒酸氧化法、胆红素氧化酶法的重复性较好，可以满足临床要求，而KHC3法对低值血清测定的重复性较差，说明该方法的精密度仍有待改善。血红蛋白对测定均有不同程度的干扰，化学氧化法较钒酸氧化法、胆红素氧化酶法、KHC3有更好的抗血红蛋白干扰的能力，且不易受脂肪乳、VitC、肝素等干扰因素的影响。血红蛋白对重氮法有一定程度的正干扰，而酶法为负干扰，钒酸盐氧化法则为较轻的正干扰，干扰程度随血清胆红素总体水平降低加重[17]。   钒酸氧化法与酶法比较具有试剂价格低廉，精密度更高的优点，是目前临床检验室测定胆红素推荐的方法，但钒酸盐对仪器和环境存在潜在的污染 ；其余方法大都需要特殊的仪器以及受某些适用范围的限制等，因此，重氮法简单、快速、价格低廉，虽然存在脂血、溶血的干扰，依然是国内很多检验科的常规方法。 3、胆红素的检测方法预测   为了提高诊断的灵敏度和特异度，目前实验室一般使用的是钒酸氧化法。通过比较可以看出，酶法和钒酸盐氧化法具有精密度高、受血红蛋白干扰小、线性范围宽等优点。酶法测定试剂盒价格昂贵，所以钒酸盐氧化法相比较而言更适合于临床实验室推广应用。虽然氧化酶法测定胆红素的试剂盒价格昂贵，但其特异性良好，操作简便，适合在全自动生化分析仪上使用，尤其是其抗干扰能力比其它胆红素常规检测方法更为理想，因而氧化酶法测定血清胆红素也是很有发展前景的。   当然，未来的胆红素检测方法方向则是具有更简便，成本更低，精密度更高，受血红蛋白干扰更小，线性范围更宽的优点的方法。如果条件允许，则尽可能把氧化酶法、重氮法、分光光度法、钒酸氧化法相结合，寻找到更有效，灵敏度和特异度更高的检测方法。 参考文献： [1]聂文荣.（2011）高胆红素血症对肾功能的影响.医护论坛，18，（11）:154-155 [2]Xia Wang ,Jayanta RC,Namita RC.(2006)Bilirubin  metabolish:Applied physiology.Current Paediatnics,16:70-74 [3]杨荣伟，陈屹一，殷舟，王文娟，宋克征.(2005).4种总胆红素常规检测方法的比较.中国医学检验杂志，6（2）：144-146 [4]王滨.（2008）钒酸盐氧化法测定血清胆红素的方法学评价.哈尔滨医药.28（1）：5-6 [5]宫浩，刘文良，隋秀丽.（2008）重氮法与钒酸盐氧化法测定血清胆红素的初步比较分析.中国误诊杂志，8（24）5838-5839 [6]曾东良，姜焕妤，吴春凤.（2005）钒酸盐氧化法与干化学法测定总胆红素的方法学比较.华夏医学，18（1）：33-34 [7]Kosaka A，Yamamoto C, Morishita Y.(l987 )Enzymatic Determination of bilirubin fractions in serum Clin bioehem 20：451-458 [8]Doumas BT，Perry B，Jendrzejczak B．(1987)Measurement 0f direct bilirubin by use of bilirubin oxidase．Clin Chem .33：l349-1531 [9]白峰，赵海建，吴锦华.胆红素氧化酶法测定血清总胆红素试剂盒在Monarch自动生化分析仪上的应用评价。 [10]Perry B.(1986)Measurement of total bilirubin by use of bilirubin oxidase,Clin chem,32(2):329 [11]郭健，莫培生.（1994）胆红素氧化酶法测定血清结合胆红素.中华医学检验杂志，17（5):274-276 [12]杨帆，杨力，王玫，李金城.（1997）胆红素氧化酶法测定血清胆红素的方法评价.当代医师杂志，2（10）：23-24 [13]何卫东,杨宝圩,蔡月珍.（2007）KHC3法检测血清胆红素.国际检验医学杂志，28（1）：82-83 [14]Daniel WT,Martin K,J Rex A.(2003)Evaluation of the linearity of Quantitative Analytical Methods. 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