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马尾神经压迫性损伤对骶髓神经营养因子3表达的影响

2017-11-12 10页 doc 31KB 25阅读

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马尾神经压迫性损伤对骶髓神经营养因子3表达的影响马尾神经压迫性损伤对骶髓神经营养因子3表达的影响 第四军医大学 硕士学位论文马尾神经压迫性损伤对骶髓神经营养因子-3表达的影响 姓名:康乐 申请学位级别:硕士 专业:外科学(骨外) 指导教师:罗卓荆 20070501 第四军医大学硕士学位论文 缩略语表缩略语 英文全称 中文全称CES cauda equina syndrome 马尾神经综合症CEI cauda equina injury 马尾神经损伤PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲盐水NTFs neurotrophic factors ...
马尾神经压迫性损伤对骶髓神经营养因子3表达的影响
马尾神经压迫性损伤对骶髓神经营养因子3达的影响 第四军医大学 硕士学位论文马尾神经压迫性损伤对骶髓神经营养因子-3表达的影响 姓名:康乐 申请学位级别:硕士 专业:外科学(骨外) 指导教师:罗卓荆 20070501 第四军医大学硕士学位论文 缩略语表缩略语 英文全称 中文全称CES cauda equina syndrome 马尾神经综合症CEI cauda equina injury 马尾神经损伤PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲盐水NTFs neurotrophic factors 神经营养因子NT-3 neurotrophin-3 神经营养因子-3NGF nerve growth factor 神经生长因子BDNF brain-derived neurotrophic factor 脑源性神经营养因子HE hemotoxylin and erosin staining 苏木精-伊红染色CBS combined behavioral score 联合行为评分SCEP spinal cord evoked potential 脊髓诱发电位 1 第四军医大学硕士学位论文 马尾神经压迫性损伤对骶髓神经营养因子-3 表达 的影响 硕 士 生:康 乐 导 师:罗卓荆 教授(主任医师) 辅导教师:桑宏勋 副教授(副主任医师) 第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安 710032 中文摘要 马尾神经损害在腰椎伤病中较为常见,大多是由于各种先天或后天的原因致腰椎管绝对或相对狭窄,压迫马尾神经引起神经组织的广泛病理变化,继而发生逆行馈变,致使骶髓前角细胞凋亡,临床上产生以鞍区感觉、大小便及性功能障碍为主,伴有坐骨神经痛或双下肢感觉、运动部分或完全功能障碍的症候群,简称马尾神经综合征(Cauda Equina Syndrome,CES)。CES一旦产生治疗效果不佳,及时有效的治疗可使病变局限,促进神经功能恢复。手术是治疗 CES 的一个重要因素,诊断及时、适时外科干预能极大地提高疗效。但在临床上由于复杂因素的影响,部分患者不能得到及时的手术治疗,或手术减压不彻底、综合治疗不,从而影响临床治疗效果,因此需要我们寻找一些别的方法来弥补缺憾。 神经元营养因子-3 (neurotrophin-3,NT-3),是神经营养因子家族的重要成员,具有阻止胚胎期及出生后运动神经元细胞死亡,维持神经元的存活及促进神经损伤后的修复与再生,并参与调节神经元突触活动的作用。体外研究表明 NT-3 对离体神经元的存活,轴突的生长都具有良好的作用。而对体内马尾神经损伤后,上位神经元即骶髓神经元 NT-3 在时相上表达变化的研 2 第四军医大学硕士学位论文究相对较少。 本实验模拟临床马尾神经损伤的机制,建立马尾神经急性压迫性损伤的实验模型,应用免疫组织化学方法检测了压迫性马尾神经损伤后不同时间骶髓 NT-3 表达的变化规律,期望为临床应用神经营养因子抵制马尾神经损伤后继发性神经元凋亡提供一定意义的理论依据。一 建立大鼠马尾神经急性压迫性损伤模型 目的:建立一种大鼠马尾神经急性受压性损伤的动物模型。方法: 将 36只SD大鼠随机分为对照组A组,n9,1 d 实验组B组,n9,7 d 实验组(C组,n9)及 21 d 实验组D组,n9,将平头金属螺钉自L6椎板紧贴棘突拧入实验组大鼠椎管,取术后不同时间1,7,21 d的动物用联合行为评分(CBS)、神经电生理、组织病理学进行综合评判。结果: H-E染色示在螺钉拧入椎管后,大鼠骶髓前角细胞发生明显的形态改变,术后的CBS评分 1 d:17.89?1.27,7 d:9.78?1.30,21 d:9.33?1.41;脊髓诱发电位SCEP潜伏期1 d:4.29?0.51,7 d:4.35?0.54,21 d:4.91?0.50 ms,同对照组比较差异有统计学意义Plt0.05。结论:建立的马尾急性压迫性损伤模型,马尾神经压迫性损伤后可逆向引起骶髓神经元坏死。二 大鼠压迫性马尾神经损伤后神经营养因子-3 的表达变化 目的:探讨马尾神经压迫性损伤后不同时间骶髓神经元中神经营养因子-3 的表达变化。方法:复制马尾神经压迫性损伤模型。于术后不同时间1 d,7 d,21 d,将动物过量戊巴比妥钠麻醉,心脏灌注后取骶髓(S2-3),固 定及切片后,用兔抗NT-3 抗体行免疫组化ABC法染色。观察并测量各组骶髓神经 元NT-3 的阳性神经元数。结果: NT-3 免疫阳性反应产物主要在骶髓神经元胞浆着 色。腹角的NT-3 阳性神经元数在脊髓挤压伤后 7 d组和 21 d组较正常组和 24 h组 明显增高Plt0.05;背角的NT-3 阳性神经元数从术后 24,至术后 7 3 第四军医大学 硕士学位论文,进行性减少,而术后 21,时则增加并高过正常者水平Plt0.05。结论: NT-3不仅参与脊髓的正常生理活动,而且可能与脊髓挤压伤的早期修复有关并具有 双向效应。关键词:马尾神经;急性压迫性损伤;模型;神经因子-3;免疫组织化 学;大鼠 4 第四军医大学硕士学位论文Effects of cauda equina compression on the expression of NT-3 ofthe conus medullaris flow an experimental study in rats Candidate for master: Kang Le Supervisor:Pro.Luo Zhuojing Department of orthopaedics Xijing hospital Fourth Military Medical University Xi’an 710032 China Abstract Cauda equina injury is comprehensive in clinical disease or injury of lumbarspine. The causes for cauda equine injury can be diverse but most of them arerelated to direct compression leading to not only the damage of the cauda equinebut also the injury of sacral nerve. The cauda equina consists of peripheral nervesboth motor and sensory below the level of the conus medullaris and within thespinal canal. The conus medullaris contains the myelomeres of the five sacralnerve roots. damage to any part of this structure may result in the cauda equinasyndrome CES. The clinical symptoms of CES are manifest by low back painsciatica saddle and perineal hypoesthesia or anesthesia a decrease in anal toneabsent ankle knee or bulbocavernous reflexes and bowel and bladderdysfunction. Judicious physical examination and prompt diagnosis remain thecornerstones of effective management of this syndrome but when it does occur itcan lead to poor outcomes with significant legal implications. Expeditious surgeryis a significant factor that can affect outcome in this syndrome. Timing of surgicalintervention attack mechanism early diagnosis can all affect outcome of CES. 5 第四军医大学硕士学位论文Part of patients with cauda equina injury however contract other severecomplications which result in infeasibility of timely surgical intervention.Therefore we should find some remedial measures to improve it. Neurotrophin-3/neurotrophic factor 3 is the important member ofneurotrophin family which can prevent embryonic and postnatal motoneurondeath maintain neuron survival promote reparation and regeneration afternervous injury and regulate synapse activity of neuron. Experiment in vitroindicate NT-3 has satisfactory effect on neuronal survive and axonal growthhowever the effect research in vivo is less comparatively. In this study we establish an animal model of acute compressed caudaequina injury of a close similarity with the clinical situation and detect the levelof NT-3 in sacral cord at different times after operation so that a way of rejection ofapoptosis of sacral neurons after cauda equina injury was confirmed and datawould be helpful for clinical application.1. Establishment of acute compressed cauda equina injury model in the ratObjective: To establish an animal model of acute compressed cauda equina injuryin the rat. Methods:Thirty-six rats were randomly divided into control groupGroup A 1 d experimental group Group B 7 d experimental group Group Cand 21 d experimental group Group D 9 rats in each group. Metal screwswithout tip were used to drill into vertebral canal through the lamina of L6 stickingthe spinous processes tightly in experimental groups. At different time 1 7 21 dafter operation animal’s comprehensive evaluation was carried out in combinedbehavioral scoreCBS latency changes of spinal cord evoked potentialSCEPand observation of the morphological changes in the sacral cords using H-E 6 第四军医大学硕士学位论文staining under light microscopes. Results:H-E staining showed the form ofanterior horn cells changed significantly after the screw was drilled into thevertebral canal. At the different time points 1 7 21 d after operationcombined behavioral score 17.89?1.27 9.78?1.30 9.33?1.41 and SCEPlatency ms 4.29 ? 0.51 4.35 ? 0.54 4.91 ? 0.50 were significantlydifferent from those in the control group Plt0.05. Conclusion: Techniques forcreating this acute compressed cauda equina injury model are simple and can behighly replicable. It provides an available basis for the further study on acutecompressed cauda equina injury.2. The change on the expression of NT-3 of the conus medullaris following caudaequina compressed injury in ratsObjective: To observe of expression of NT-3 of the conus medullaris neuron withcauda equina compressed injury. Methods: Replicating acute compressed caudaequina injury model in the rat at the followtimes 1d 7d 21d animals weregiven a lethal overdose of pentobarbital and perfused Cardiac with NS and 40 g/Lparaformaldehyde. The conus medullaris was removing. Samples were put infixative overnight and serial 5μm coronal sections were immunohistochemistry:ABC method and microscope were used to observe the expression. Result: NT-3positive products were mainly distributed in cytoplasm. The 7d and 21d groupswere significantly higher than the normal and 24 h groups on the NT-3 positiveneurons counting in the ventral horn following cauda equine injuryPlt0.01 only21 d group was significantly higher than the normal group in the dorsal hornPgt0.01. Conclusion: The number of NT-3 positive neurons is increased in theconus medullaris ventral and dorsal horns following cauda equina and the 7 第四军医大学硕士学位论文increased endogenous NT-3may play a role in early repairment of nerve injury.Keywords: cauda equina ; acute compressed injury ; model NT-3 ;immunohistochemistry ;rat 8 第四军医大学硕士学位论文 前言 马尾神经损伤是腰椎伤病较为严重的并发症,大多是由于各种原因引起的腰椎 管绝对或相对狭窄,导致马尾神经的直接压迫损害所致,短时间内因硬脊膜受压, 血液循环、脑脊液、轴浆耸涫茏瑁 橹 毖 ? 祝 诼砦采窬 蛊炔课怀鱿止惴 旱牟?肀浠 潭 ? 嫦蚶”洌 率棍舅枨敖窍赴 蛲觥?邓溃 俅采喜 园扒 芯跫按笮”恪?怨δ芗八 轮 δ苷习 饕 ?吹闹?蛉骸,蚱湟坏??。 俅仓 瘟菩Ч 芳眩 甘 暌延泻芏嘌д叨云渲瘟谱隽舜罅康难芯俊,壳叭衔 ?缡质跏 侵瘟坡砦沧酆险髦匾 拇胧 , 诹俅采嫌捎诖瓷恕?琢龅雀丛右蛩氐挠跋欤 糠 只颊卟荒艿玫郊笆钡氖质踔瘟疲 蚴质跫跹共怀沟住?酆现瘟撇还娣叮 佣 跋炝 俅仓瘟菩Ч 虼诵枰 颐茄罢乙恍?鸬姆椒ɡ疵植谷焙丁?自 1952 年, Leve-montalcini 首次发现神经生长因子(NGF)以来,人们逐渐认识到:神经细胞 的发育、生存、生长、迁移以及与其他细胞建立功能联系,或在神经再生过程及轴 突的再生长中,均受一类可溶性化学物质—神经营养因子(Neurotrophic factor, NTFs)的诱导、调节和控制。Goto等利用 BDNF 和 NT-3 的抗体,研究大鼠脊髓 横切伤后 BDNF 和 NT-3 免疫反应分布,证实 BDNF 和 NT-3 的免疫反应都定 位于灰质,尤其是前角的运动神经元及白质的一些轴索胶质细胞。在脊髓横切损伤 模型中,损伤后 3 周,运动神经元显示抗 NT-3 抗体强阳性,而抗 BDNF 抗体稍 弱。损伤后 4 周,灰质中形状细胞显示抗 BDNF 抗体阳性,而且还证明 BDNF 和 NT-3 都参与了脊髓修复过程。因此,利用 NT-3 挽救脊髓神经元很有潜力。在发 育中及成熟后的大鼠中,NT-3 都能促进损伤后的神经纤维的生长,且能防止大鼠 发育中损伤红核 9 第四军医大学硕士学位论文神经元的退行性死亡。损伤后 4 周,灰质中星状细胞显示抗 BDNF 抗体阳性,而且还证明,BDNF 和 NT-3 都参与了脊髓修复过程。因此,利用 NT-3 挽救脊髓损伤神经元很有潜力。在发育中及成熟后的大鼠中,NT-3 都能促进脊杷鹕撕笃ぶ始顾枋 纳 で夷茏柚勾笫蠓? 兴鹕撕旌松窬 耐诵行运劳觥?本实验了后路压迫性马尾神经损伤动物模型(应用免疫组织化学方法检测了压迫性马尾神经损伤后不同时间骶髓 NT-3 表达的变化规律,期望为临床应用神经营养因子防止马尾神经损伤后继发性神经元凋亡提供一定意义的理论依据。 10 第四军医大学硕士学位论文 文 献 回 顾 马尾神经损害临床较为常见,大多是由于各种先天或后天的原因,致腰椎管绝对或相对狭窄,压迫马尾神经产生一系列神经功能障碍的症候群。1949年 Verbiest 首 次 临 床 报 告 且 将 其 命 名 为 马 尾 神 经 综 合 征 Cauda equinasydrome CES 1。因其一旦发病,临床治疗效果欠佳。目前认为尽早手术是治疗马尾综合征重要的措施。但在临床上由于创伤、肿瘤等复杂因素的影响,部分患者不能得到及时的手术治疗,或手术减压不彻底、综合治疗不规范,从而影响临床治疗效果,因此需要我们寻找一些别的方法来弥补缺憾。神经营养因子-3Neurotrophin-3,NT-3是神经营养因子家族成员中具有神经营养作用的小分子蛋白,在体内、外对神经元的发育、存活及功能维持具有重要作用。因此,利用NT-3 挽救脊髓损伤神经元很有潜力。一 马尾神经综合症的研究进展:1( 马尾神经综合症的病因 1 腰椎外伤:Benzel EC,Cybulski GR,Gertzbein SD,Little JG分别报告了创伤导致马尾神经综合征的发病特点,他们认为腰椎退变滑脱常引起椎管狭窄,此时椎板下缘及附着在松弛椎板上的黄韧带增厚,骨嵴增生,围绕硬脊膜及侧隐窝内的过多纤维组织可压迫马尾神经及神经根。椎体或附件骨折,骨折块或破碎的椎间盘等占据了椎管内空间直接压迫马尾神经。也可骨折块穿入硬膜内造成马尾神经直接损伤,出血、疤痕化,椎体压缩性骨折致构成椎管的软组织向椎管内皱褶,椎管极度狭窄,产生严重的或不可逆传的马尾神经损伤症状2-5。 2 中 央 型 椎 间 盘 突 出 : 文 献 报 告 腰 椎 间 盘 突 出 症 致 CES为 5.4 ,10.6,占手术治疗腰椎间盘突出症和腰椎管狭窄症的 9.36。因腰椎间盘突 11 第四军医大学硕士学位论文出症和腰椎管狭窄症为常见病,故CES较为常见。也有人报告腰椎间盘突出症合并CES的发生率为 77左右,同时详细描述了椎间盘突出的节段及每个节段突出的部位、程度及手术预后情况,认为椎间盘突出有急性和慢性之分。急性突出时其突出物不仅压迫马尾神经,当其游离于椎管时对马尾神经还有一瞬间的撞击力,使马尾神经缺血、水肿加重,影响了正常脑脊液循环。Holm8曾报告根袖段神经根营养的 75来自脑脊液,25来自血供。因此,脑脊液受阻时营养大部分丧失。马尾神经水肿消退后周围粘连形成,即便行推板切除,突出物摘除减压,一段时间内脑脊液循环仍不能建立,使得马尾神经继发性损伤继续加重。故急性损伤愈后较差。慢性发病者多伴有腰椎管狭窄症状,马尾损伤不完全,症状反复发作,减压后效果好。 3 暴力按摩和过度牵引:Markowitz9等人报告暴力按摩和过度牵引可引起椎间的滑脱,导致马尾神经和神经根损害,产生马尾神经综合征。 4 其它:严重椎管狭窄、强直性脊椎炎、手术、麻醉、出血、Paget病等原因引起马尾神经综合征均有文献报道10-15。2。 目前很多学者通过实验对马尾神经综合征发病机制有以下认识: 1 Delamater16通过大量动物实验和临床观察认为:马尾神经的急性压迫,如椎间盘突出等,损伤部位产生炎性反应、华勒氏变性、雪 旺氏细胞增生。他认为此病理改变是形成马尾神经综合征病理基础。实验也阐述了该病理的形成过程,压迫导致的神经症状与其内血流变化、轴浆运输及直接机械压迫程度有关。直接神经压迫可作用于神经根的所有成份,即神经纤维、神经内血管和连接组织等。压迫神经纤维造成神经纤维华勒氏变和脱髓鞘,导致轴浆运输受阻。血管因受压而屈曲、狭窄,特别是压迫小静脉造成淤血,这将引起毛细血管逆行淤血,导致组织缺血、缺氧和炎症反应。直接的机械压迫造成的损伤主要发生在压迫早期,以后神经和功能的变化主要 12 第四军医大学硕士学位论文还是以神经组织内部血流和营养供应变化所致。 2 Delamater等17,18用环带缩窄法使犬的椎管面积分别缩窄 25,50,75,结果显示:随着缩窄程度的增加,逐渐产生感觉、运动、括约肌异常,SEP潜伏期延长、波幅下降和组织学损伤加重。缩窄 75时,硬膜不再有保护作用,所有神经根均有萎缩,狭窄部完全脱髓鞘,华勒氏变性,出现轴浆运输受阻的扁球体。 3 Rydevik等19强调既使马尾神经根受压的压力很低5,lOmmHg也会有微静脉淤血。50,80mmHg压迫 2h就会出现神经电位下降,随着压力的升高电位逐渐下降,并且神经传导功能的恢复也和压迫程度有关,压力低者恢复快且相对完全。 4 压迫时间和速度对马尾神经的影响。Michael等20,21用荧光显微技术测定马尾神经,发现压迫的时间、速度与所导致的马尾神经水肿程度有一定的相关性,缓慢充气压迫组在各压力水平上水肿的程度不如快速充气压迫组,压迫速度对组织损伤的大小可能由神经组织的粘弹性决定的。神经组织受压后,压迫部向未受压部移位,将导致在不同的层面上产生剪切应力,且在边缘部最大。在快速压迫初期存在着较高的剪切应力,而缓慢压迫允许神经适应这种压力,压力越大对马尾神经的损伤越大。 5 椎间盘破裂漏出的髓核组织的降解产物如磷脂酶AZ,IL-1,IL-6,TNF-α、PGE2、组织胺、5-羟色胺、NO,IgG,IgM等炎性介质和化学因子的作用导致马尾神经及神经根.
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