白细胞介素-2研究进展.doc

白细胞介素-2研究进展.doc 白细胞介素-2的研究 摘 要:综述白细胞介素-2 及其主要临床应用、检测方法和基因工程研究方法。白细胞介素-2 是一种在机体的免疫调节中发挥着重要而复杂作用的细胞因子，既可促进淋巴细胞增殖，增强免疫功能，又能限制 T 细胞反应而增强机体的免疫耐受，故可用于治疗肿瘤和感染性疾病及自身免疫性疾病。 关键词:白细胞介素-2;生物活性;临床应用;检测方法 引言 1966年，一些科学工作者发现，淋巴细胞在体外被激活后能释放出许多具有生物学活性的成分，它的化学组成是非免疫球蛋白的糖蛋白分子。这些分子能抑制巨噬细胞的迁移、调节白细胞的生长和功能。1969年首先由Dumonde把这些淋巴细胞产生的活性成分称为“淋巴因子”(Lym-phokines)。除淋巴细胞外，巨噬细胞、成纤维细胞、角质细胞和各种转化细胞均可产生淋巴因子。 1976年Morgan等首先报道，用丝裂原(植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA)等)刺激的淋巴细胞条件培养液(PHA-LyCM)可刺激T淋巴细胞在体外培养中长期生长。据此，他们认为PHA-LyCM中存在一种能刺激T细胞生长的因子，并将其命名为“T细胞生长因子(TCGF)”。随着研究的深入，人们发现PHA-LyCM不仅能刺激T细胞生长，还有多种其它生物活性，并依据不同的生物活性予以命名。例如:胸腺细胞刺激因子及细胞分裂因子(TSF，TMF)，杀伤辅助因子(KHF)及协同刺激因子(Co-Stimulator)等，其实这些都是同一种淋巴因子所表现出的不同生物活性。为避免名称混乱，1979年召开的第二届国际淋巴因子研讨会决定将这种“淋巴因子”命名为白细胞介素-2，即IL-2。1983年日本学者克隆了IL-2的基因，并成功表达。1992年美国FDA首先批准rhIL-2应用于临床。自从IL-2发现以后，人工培养和繁殖淋巴细胞成为现实，为免疫学领域的研究奠定了很好的基础。 1 IL-2及其受体蛋白 1.1 IL-2蛋白的结构 天然hIL-2在体内主要由活化的I型辅助淋巴细胞(T细胞)分泌，为分子量Hl 约为15.5kDa的糖蛋白，pI在6.6~8.2。成熟的IL-2分子由153个氨基酸肽链N端剪掉20个氨基酸残基的信号肽后剩下的133个氨基酸残基组成，它与其它的细胞因子在序列上无同源性。翻译后加工的过程还包括第三位Thr位点的糖基化和二硫键的形成。蛋白链中有三个半胱氨酸残基(Cys)，位于第58、105和125位。58位和105位半胱氨酸残基结合形成二硫键，使肽链折叠，125位半胱氨酸残基游离。研究者发现将125位游离的半胱氨酸残基突变为丝氨酸或丙氨酸时，仍具有生物活性，且不会与第58位半胱氨酸残基形成错误二硫键，增加了IL-2的稳定性，同时也消除了由第125半胱氨酸残基造成的二聚体，但是这样新型 [1]IL-2容易产生抗体，这是一大不足之处。IL-2肽链折叠后才呈现活性，直链是无活性的，正确的二硫键对于IL-2活性的保持是必需的，但糖基化却与活性无[2]关。 IL-2的二级结构有4个α螺旋区和一对β反平行折叠，各螺旋相互折叠使IL形成球状蛋白分子。磁共振 (NMR)确定IL-2的四个α螺旋，分别为A、1l-29(B、 [3]53-73，C、81-97，D、116-131。对IL-2的α螺旋结构研究结果说明α螺旋的破坏对其生物活性必定有影响。另外，IL-2与其受体结合需要酸性基团(Asp)，而较长的疏水侧链基团则妨碍这种结合，使其活性降低，甚至完全丧失。在生物 [4]学活性上，IL-2的氨基端和羧基端对于其结构和活性都起到关键作用 1.2 白细胞介素-2受体(IL-2R)结构 IL-2通过与细胞膜上的IL-2受体(IL-2R)结合来发挥其生物活性。IL-2R受体是一个复合体，由α链(55kd)，β链(75kd)和γ链(64kd)组成，3条链都有相似长度的外部控制区和不同的血浆控制区。β链的内部控制区最大(286个氨基酸残基)，而α链的最小(13个氨基酸残基)。Α链不具备信号传递功能，β和γ都属于I型细胞因子受体超家族，它们同时负责信号传递功能。只有在3条链同时存在时，IL-2才能与IL-2R以高亲和力结合[Ka(解离系数)=10pmol/L]。只有β和γ链的表达而失去α链的细胞(能够进行信号转导，但只能以中度亲和力与IL-2结合(Ka(解离系数)=1nmol/L)。只表达α链的细胞以低亲和力与IL-2结合，且无法进行细胞的内信号转导。γ亚基不单独与IL-2结合。高亲和力IL-2R主要 8存在于活化的T，B淋巴细胞及NK细胞，在人类外周血中约10个;大约90, 6NK细胞(静止状态)表达低水平的CD56抗原及中等亲和力IL-2R，约l0个。静 止状态的巨噬细胞亦表达中等亲和力IL-2R，低亲和力IL-2R仅表达在静止状态的T细胞。 IL-2R有两种存在形式，一种是与细胞膜结合的IL-2R(mIL-2R)。另一种是IL-2R释放到血液及其他体液中成为可溶性形式(sIL-2R)。当 IL-2Rα 从细胞膜上经酶解脱落后进入血液，就形成了可溶性 IL-2R( sIL-2R) ，sIL-2R可与mIL-2R竞争结合IL-2，使得活化T细胞周围的IL-2减少，减弱机体的自分泌效应，抑制已活化的T细胞克隆性扩增，发挥类似“封闭因子”的作用。sIL-2R释放量与T细胞激活程度及膜受体表达率有关，因此，sIL-2R被称为是T细胞介导免疫反应的标志。 IL-2R的表达受IL-5和IL-6的调节，还受IL-2R/P55诱导因子，IL-2R诱导因子和IL-2Rα链抑制活性的调节。IL-2受体不仅能与IL-2结合传递信号，还能与其他的细胞因子发生作用。IL-2Rα亚基只与IL-2产生特异性结合，β链是IL-15受体重要的成员，而γ链则是IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21受体复合物的一员。所以，IL-15R中含有β和γ两个亚基，IL-15对靶细胞能产生高度相似的生物活性。 2 IL-2的生物学活性 IL-2的生物学活性有一大特点:不同种属的IL-2的生物学活性呈现下行性，即沿种系谱向上有约束性，向下无约束性。如人和猿的IL-2几乎可以作用于所有哺乳动物的T细胞，但其它哺乳动物的IL一般很少可以作用于人。对IL-2的氨基酸序列分析表明这与其受体结合部位氨基酸序列较保守有关，以及与氨基酸 [5]排列顺序和形成的空间构型也有很大关系。另外一个特点是，IL-2具有很强的种属特异性，鸡IL-2(ChIL-2)与哺乳动物IL-2的同源性仅为20~30,。 IL-2生物学功能很广泛，能够对多种细胞类型如T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和少突神经胶质细胞等产生作用，其中最显著的作用是影响T淋巴细 [6]胞的生长。 2.1 促进T细胞增殖 IL-2最主要的功能是促进T细胞的增殖。T细胞在受到丝裂原或抗原刺激后，表面出现IL-2受体并与IL-2发生特异性结合，结合后启动IL-2受体阳性细胞大量繁殖。IL-2受体必须在抗原刺激后，才能在T细胞表面表达，未受刺激的T 细胞表面是不存在IL-2受体的。IL-2可刺激T细胞表面胰岛素受体、MHC II类抗原的表达，并产生多种淋巴因子如IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-B及CSF等。在体外，T细胞的增殖同样需要IL-2的促进作用。 2.2 诱导细胞毒性T淋巴细胞产生和增殖 IL-2是抗原激活的细胞毒性T细胞前提细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞的主要因子。在IL-2存在条件下，细胞毒性T淋巴细胞繁殖明显增强，特异性地识别肿瘤相应抗原，特异性地杀伤肿瘤细胞，是肿瘤侵润淋巴细胞的主要细胞群。 2.3 对自然杀伤细胞(NK)的作用 NK细胞是一种极为主要的杀伤细胞，具有很强的清除肿瘤细胞和被感染细胞的功能。NK细胞的活化、分化和增殖都离不开IL-2。IL-2不仅能促进NK细胞的增殖，还能促使NK细胞产生TNFα，IFNγ和GM-CSF等多种细胞因子，IL-2与IL-12协同作用增加NK细胞的杀伤能力。所以IL-2在NK细胞发挥免疫调节、抗肿瘤等功能上具有重要作用。 2.4 增殖分化B细胞作用 IL-2能促进B细胞分化增殖，启动免疫球蛋白J链的翻译合成，增强抗体的分泌。所以IL-2可以使B细胞分化成为能够产生免疫球蛋白的活化细胞。 2.5 IL-2与其他白细胞介素等协同作用 IL-2在细胞因子作用网络中起核心调节作用，和IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、肿瘤坏死因子、集落刺激因子等有协同作用。由于IL-2可以使NK细胞增殖，则IFNγ也随之增加。而TGF-β对IL-2的促细胞增殖有拮抗作用。所以今后对IL-2与各种细胞因子的正负调节作用研究将对免疫学基本理论发展和肿瘤治疗学发展起着重要作用。 研究人员将小鼠的IL-2和IL-2R基因敲除对IL-2在生物体内的活性进行研究。实验证明IL-2对维持生物体的免疫平衡至关重要。首先，IL-2促进几乎所有种类T细胞的增殖分化。其次，IL-2负责诱导活化后的T细胞的凋亡，因此在调节免疫反应中发挥着重要的作用，IL-2的缺失会导致严重的自身免疫反应。 3 IL-2的临床应用及应用前景 IL-2分泌水平的高低与多种疾病有密切关系。多数报道认为，肿瘤患者的IL-2产量和对IL-2的反应性都有不同程度的降低，随着肿瘤的恶化，IL-2产量 更低下。艾滋病病人的1L-2含量仅为正常人的1/3。艾滋病病人用 IL-2治疗后，可恢复极度低下的NK细胞活性和细胞毒作用。IL-2在机体免疫调节网络中的核心作用，与其他细胞因子的协同和拮抗作用，共同完成机体免疫机能的平衡调节作用;IL-2能促进T细胞、B细胞的分化、成熟，维持T细胞活性;还能促进细胞毒性T淋巴细胞的活性，并能使其转化为肿瘤侵润性淋巴细胞;促进NK细胞的活性并诱导成为杀伤肿瘤的新型细胞-淋巴因子激活的杀伤细胞;促进抗体形成，促进干扰素、肿瘤坏死因子及淋巴毒素的产生和释放。免疫佐剂是一类能促进、延长或增强抗原免疫原性和免疫保护效果的物质。IL-2作为一种免疫增强剂，显示出极为广泛的应用前景。hIL-2是研究最多的细胞因子免疫佐剂之一，其在艾滋病的免疫治疗和乙型肝炎病毒作为免疫佐剂的应用上取得了良好的效果。IL-2蛋白和狂犬病灭活苗联合使用，可以明显提高疫苗的免疫效果(保护率至少提高25倍)。 3.1 抗肿瘤治疗 临床上常将 IL-2 单独或与其他化疗药联用治疗晚期肾癌、恶性黑色素瘤及癌性胸、腹腔积液等。 基础研究已经表明，IL-2主要是间接发挥抗肿瘤的作用，其抗肿瘤的机理在于刺激、活化其效应细胞从而达到肿瘤治疗的效果。在恶性肿瘤的发病机制中，非常关键的是机体免疫功能失调和免疫功能低下的问题。 在抗肿瘤免疫效应中，细胞免疫比体液免疫发挥更为重要的作用。参与肿瘤免疫作用的效应细胞主要有T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞三大类。其中细胞毒性T细胞(CTL细胞)起主要作用，它可通过其抗原受体识别肿瘤细胞的特异性抗原，并在T细胞的辅助下活化、直接杀伤肿瘤细胞;它亦可分泌淋巴因子如INF-γ、淋巴毒素等间接杀伤肿瘤细胞。NK细胞为非特异性的抗肿瘤细胞，具有广谱抗肿瘤活性，它可藉其表面的肿瘤细胞受体与肿瘤细胞结合，释放溶细胞素致肿瘤细胞死亡。活化的单核一巨噬细胞可直接杀伤肿瘤细胞，亦可释放肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子、溶酶体酶、蛋白水解酶和活性氧发挥杀伤作用。 由于免疫功能低下，NK、CTL、LAK等杀伤细胞活性太低，不能正常地清除肿瘤细胞。此时提供外源IL-2能增强CTL抗肿瘤应答反应，诱导PBMC或肿 瘤浸润淋巴细胞(TIL)成为淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)。LAK细胞在试管内可溶解自体的新鲜肿瘤细胞以及培养的肿瘤细胞，包括对NK细胞有抵抗的肿瘤 [7]细胞。rIL-2与LAK合用治疗癌症曾引起世界性的轰动，LAK/IL-2对肾细胞癌[8]、黑色素瘤、肠癌等有明显疗效，对肝癌、卵巢癌、膀胱癌等有不同程度的疗效。LAK细胞毒作用是无组织相容性抗原限制的。 临床上应用IL-2治疗肿瘤始于1985年，至今已经有二十多年的历史了，但对其抗肿瘤的活性仍在不断深入的研究中。其中研究比较热门的是IL-2基因治疗药物。将携带IL-2基因的真核表达载体直接导入病灶或将IL-2转移至逆转录病毒感染肿瘤细胞。 3.2 对HIV感染者的免疫治疗 +艾滋病的主要特征是患者体内 CD4T 淋巴细胞(CD4细胞) 呈进行性减少，最终导致机体的免疫系统失去对各种病原体的抵抗力。目前，针对艾滋病的治疗主要采用抗逆转录病毒疗法( ART) 或高活性抗逆转录病毒疗法( HAART) ，这些疗法能增加患者体内 CD4 细胞数目并减少致病菌对机体的感染。近几年，基于增强机体免疫的疗法正被逐步用于艾滋病的治疗，在 HAART 基础上采用基于增强免疫的 IL-2 辅助治疗。IL-2作为HIV免疫治疗药物的主要机理是能促进机 +体CD4淋巴T细胞的增殖，提高机体的免疫能力，减少患者的并发症。在国际上也开展了一些临床实验，研究了IL-2是否能提高HIV感染病人的存活率和减少艾滋病相关疾病发生的频率。目前，IL-2在法国已经获准成为艾滋病的辅助性治疗药物。 3.3 抗病毒、细菌感染 在对动物实验的研究中发现，IL-2对HSV感染有明显的抑制作用。在慢性活动型乙型肝炎病人的治疗中，已显示出明显效果。IL-2能增强体内的NK、CTL、LAK等杀伤细胞活性，清除被病毒感染的肝细胞，诱导产生的IFNγ和TNF能对病毒再侵入健康肝细胞加以抑制，所以IL-2对肝细胞起着清理污染的洁化作用。 IL-2对麻风、肺结核等慢性感染性的疾病也有疗效。将小鼠接种TB 5或15 目，结果rIL-2对TB天后，每天肌肉注射rIL-2共10天，观察脾脏中TB细菌数 [9]的抑制作用能达到99,，可见rIL-2对结核杆菌(TB)有很强的抑制作用。除此 之外，IL-2在抗高血压、抗寄生虫感染、镇痛等方面都有着积极的应用。此外，IL-2也可用于其他病毒如人类乳头瘤病毒、疱疹病毒感染的辅助治疗。 3.4 用于自身免疫性疾病的治疗 IL-2是一种在体内具有两种相对立作用的细胞因子，它既可作为 TCGF 促 [10]进 T 细胞的增殖分化外，又能限制 T 细胞的反应并产生免疫耐受。实验发现，缺乏IL-2或IL-2R基因的小鼠非但没有出现明显的免疫无能，相反还产生 [11]了各种严重的T细胞介导的自身免疫性疾病。IL-2 在维持机体的免疫耐受方 [12]面也起着重要的作用，因而可用于自身免疫性疾病的防治。 ++++CD4CD25调节性T细胞( CD4CD25Treg)是调节性T细胞( Treg) 的一种重要亚型，主要由胸腺产生，并进入外周血液和淋巴组织，维持正常免疫反应和 ++免疫耐受的平衡。CD4CD25Treg 组成性表达CD4、CD25、Foxp3、细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)和糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(GITR)等分子。 +++正常情况下，CD4CD25Treg约占人外周血CD4T 细胞的5%~10%。 ++CD4CD25Treg具有免疫无能性和免疫抑制性两大特征，其免疫无能性表现在对高浓度 IL-2 的单独刺激、固相包被或可溶性CD3单抗以及CD3和CD8单抗的联合作用呈无应答状态，也不产生 T 细胞增殖分化所需的IL-2，呈现一种免 ++疫惰性状态;而免疫抑制性表现在其经激活后能抑制 CD4和CD8细胞的活化与增殖，且这种抑制作用是非特异性的，不受组织相容性抗原的限制。 ++CD4CD25Treg发挥免疫抑制作用的机制主要有两种:细胞直接接触机制和细胞因子调节机制，前者主要与 Treg 表面的 CTLA-4 和GITR 有关，而后者主要与分泌 IL-10 和 TGF-β 等细胞因子有关。 因IL-2、IL-2Rα 或β 缺失而产生的各种严重系统性自身免疫性疾病都与 ++[13, 14]CD4CD25Treg 的生成减少有关，而用IL-2 单克隆抗体中和IL-2，可选择 ++[12]性减少小鼠体内CD4CD25Treg 的数量。另外又发现，将一定数量的 ++[15]CD4CD25Treg 转移到 IL-2β-/-小鼠体内可以阻止自身免疫性疾病的产生。 ++大量研究证实，IL-2 对 CD4CD25Treg在胸腺中的发育、外周功能的维持及其 [16, 17]免疫抑制作用的发挥都起着非常重要的作用。 4 lL-2的活性检测 IL-2产生或表达异常与临床疾病有密切关系，通过测定人外周血、尿液或人 激活淋巴细胞培养上清液中的IL-2水平，可作为对肿瘤、心血管病、肝病、红斑狼疮、麻风病、艾滋病等疾病诊断、预后及观察的方法，并用于器官移植后有无排斥反应的早期诊断。IL-2含量测定是基础研究和临床上应用IL-2免疫治疗的重要辅助指标之一。 4.1 放射免疫分析法 利用放射性核素标记抗原或抗体，然后与被测的抗体或抗原结合，形成抗原抗体复合物的原理来进行分析的。早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，该技术以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待测样品中抗原的量。RIA是一种具有高灵敏度(<100pg/ml)、精确度和特异性的体外超微量分析法，但技术要求高，影响因素较多。。稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)，该技术则以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。放射免疫技术 1253常用的核素有I和H，前者采用γ射线，标记方法简单低廉，后者用β射线，标记方法复杂昂贵。放射免疫分析法广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析。 4.2 酶联免疫吸附分析法(ELISA) 应用抗IL- 2的单克隆抗体或多克隆抗体通过酶联免疫吸附测定(ELISA )来 检测人血清，血浆及相关液体样本中IL-2的含量。ELISA是利用酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大提高了灵敏度。hIL-2常采用双抗体夹心法测定。如用纯化的人hIL-2抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入IL-2，再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB(含四甲基联苯胺TMB和过氧化氢HO)显色。HO和TMB在HRP酶的催化下，TMB转2222 化成联苯醌，联苯醌在波长450nm处有最大消光系数。如果HRP量少，过氧化氢溶液和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。加入终止液降低pH(pH1.0)，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌。终止液可以是HCl、HPO 或34HSO等，其中HSO作为终止剂较为理想。颜色的深浅和样品中的白细胞介素2424 -2(IL-2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准 曲线计算样品中人白细胞介素-2(IL-2)含量，最低检测浓度<1.0pg/mL。 4.3 生物学检测法 根据IL-2对特定的依赖细胞株(CTLL-1、CTLL-2、CT6、HT-2、LB3、BD2、NKC3、CTLD及MTH等)的促增殖作用，以增殖细胞中的DNA合成或酶活性 3为指标，间接推算出IL-2的活性。DNA合成量的检测可采用H-TdR掺入法，而酶的活性可采用MTT比色法，该方法酶活性根据增殖期细胞线粒体中富含的琥珀酸脱氢酶能使黄色的3-(4',5'，-二甲噻唑-乙基)-2，4-二苯四唑溴盐(MTT)分解成蓝色结晶状甲瓒(formazan)的特性测得，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，DNA的合成量或上述酶的活性与IL-2的量成正比。 MTT比色法检测细胞的活性，反映了活细胞特别是增殖的细胞能量代谢水 3平，而H-TdR法检测细胞的活性反映了细胞DNA的合成，由于DNA的合成与细胞的能量代谢密切相关，所以两种方法结果是一致的。传统的检测 IL-2活性 3的方法是 H-TdR掺入法，该方法具有较好的敏感性和重复性，但需要昂贵的特 3殊检测仪器，并且具有同位素污染的缺点。不少学者更倾向于H-TdR掺入法，但MTT法因其无同位素的污染也被广泛应用。 5 白细胞介素-2的基因工程研究 Taniiguchi于1983年首次成功克隆了hIL-2的cDNA，使IL-2的大量生产和研究成为可能。90年代初IL-2在美国问世，1991年，中国科学院上海生化研究所和军医医学科学院承接了“八五”重点攻关课题一基因重组白细胞介素-2。成 ,，经纯化后蛋白的比活性功构建了表达IL-2的pL Y-4质粒，表达水平可达50 7可达到1.6~2.2×10，此课题于1994年获一类新药证书，是我国继干扰素后第二个正式进入市场的基因工程药物。此后，利用基因重组技术，分别在大肠杆菌、酵母、猴COS细胞和昆虫细胞中表达了有活性IL-2，目前人IL-2已经全部采用基因工程的方法生产。研究者相继基因克隆出猪、牛、兔等动物的IL-2及IL-2R，研究发现不同种属IL-2的生物学功能十分相似，不同种属IL-2及IL-2R的分子结构有高度同源性。所以可以采用鼠CTLL-2细胞检测人IL-2的生物活性。 IL-2应用广泛，但其毒副作用比较大。IL-2能产生寒战、发热和乏力的全身 性副作用。其对心血管系统的心脏毒性表现为心律失常、心肌缺血、心肌炎和收缩力下降等症状。血流动力学的改变是IL-2治疗的最严重副作用。表现症状为全身血管阻力下降，心率增快，心输出量增加，平均动脉压下降。因此在临床使用中一般采用低剂量静脉注射以维持低水平、低毒性的有效浓度。另外，基因工程IL-2半衰期太短(约2h)，影响疗效。如何提高其半衰期是研究者比较关注的一个问题。 研究者发现对IL-2进行氨基酸残基突变能有效的提高与IL-2R的结合效率，以延长IL-2的半衰期，这是从分子机制上延长半衰期的方法。目前大部分上市的IL-2都是经过基因改造的，一般是将编码125Cys的密码子突变成为编码Ala的密码子，其生物活性和稳定性都有所提高。也可将125Cys突变成125Ser，突变后的重组人白细胞介素(125Ser-rhIL-2)对恶性黑色素瘤、肾透明细胞癌及恶 [18]性胸腹腔积液有效，不良反应较轻。 从制剂的角度出发同样能缓解这个问题。目前大量开展了“缓释制剂"的研究，如采用脂质体包裹或与M-PEG连接等均可延缓IL-2的半衰期。采用亲水惰性的高分子和蛋白质的非必需基团共价相结合，可以使抗原决定簇屏蔽，这样异源性物质在体内不被免疫系统识别，也就不会不产生相应抗体，从而解除异体蛋白免疫原性。免疫原性被解除后，就不会因为在体内产生抗体而被清除;同时由于大分子修饰物在蛋白质表面的遮蔽作用，使得蛋白质不易被蛋白酶降解;另外蛋白质被修饰以后，其分子量大大提高，就不会轻易被肾小球过滤，也就是降低了滤过率。由于上述几个因素共同作用的结果，使得修饰后蛋白质在体内半衰期得以延长。 IL-2融合蛋白已经成为IL-2研究的热门方向。采用基因重组融合蛋白的方式获得IL-2的融合蛋白同样也能延缓IL-2的半衰期而减少用药量，同时减少了毒副作用。如抗体-IL-2融合蛋白比IL-2单独应用的生物活性更好，其抗体部分带引融合蛋白靶向性结合肿瘤细胞，在肿瘤细胞周围形成高浓度区，从而减少了用药剂量，也相应减少了IL-2引发的副作用。其融合蛋白还可以激活LAK细胞 [19]共同杀伤肿瘤细胞等，并且效果更强。国内外都有相关报道。Belmont等人构建表达的可溶性TCR/IL-2融合蛋白能有效的抑制肿瘤细胞的增殖分化，延长IL-2在体内的半衰期，最小限度的减少了药物毒性，其抗癌活性远远超过单独使 用人IL-2的效果。1992年Gillies等成功地表达了重组抗神经节苷脂抗体(GD2) [20]和IL-2的融合蛋白 。1995年，Eric等对融合蛋白IgG3-IL2的药理学进行了 [21]研究，认为该融合蛋白可以促进LAK活性。2003年，Klimka等构建了IL-2 和其保护性单链抗体的融合蛋白，结果证明可以有效抑制相应蛋白酶对IL-2的 [22]降解 2005年，魏雪涛等构建了马立克氏病病毒gB与IL-2融合基因载体并表 [23]达成功。2007年，倪剑锋等构建了抗GD2单链抗体与IL-2融合蛋白的基因并 [19]大肠杆菌中表达。，目前国内已经研制出一种长效 IL-2，即人血清白蛋白与 IL-2 的融合蛋白( HAS/IL-2) ，并已获得专利【吴军，唱韶红，巩新，等( 人血清白蛋白 : 中国，ZL200310117068( X,P,，2005-06-15】，该融合蛋与白细胞介素 2的融合蛋白及其编码基因 白在小鼠体内的血浆半衰期是普通 rhIL-2 的 10 倍以上，因此其在人体内的药 效有望维持更长时间。融合IL-2蛋白具有活性高、毒性小等优点，已经成为IL-2 研究的一条重要研究途径。 6 小结 人们对IL-2的研究已经有30多年的历史了，但IL-2仍然是目前研究最多的 细胞因子之一，它在免疫系统中的作用还有待于继续研究。IL-2能有效增强免疫 能力，提高机体免疫水平，广泛的生物学作用使其在临床上具有较大的应用价值。 随着不断的研究开发，IL-2的应用必定还会得到进一步发展。 参考文献 [1] ARAKAWA T, BOONE T, DAVIS J M, et al. Structure of unfolded and refolded recombinant derived [Ala125]interleukin 2[J]. Biochemistry, 1986,25(25):8274-8277. [2] SONE S, OGURA T. Local interleukin-2 therapy for cancer, and its effector induction mechanisms[J]. Oncology, 1994,51(2):170-176. [3] 刘新垣, 徐获, 蒋春雷, 等. 白细胞介素,2的结构与功能[J]. 生物工程进展, 1994(1):13-17. [4] JU G, COLLINS L, KAFFKA K L, et al. Structure-function analysis of human interleukin-2. Identification of amino acid residues required for biological activity[J]. J Biol Chem, 1987,262(12):5723-5731. [5] 黄建珍, 李震, 沈秋姑. 白细胞介素-2及其在动物医学中的应用[J]. 江西畜牧兽医杂志, 2004(4):3-4. [6] GAFFEN S L, LIU K D. Overview of interleukin-2 function, production and clinical applications[J]. Cytokine, 2004,28(3):109-123. [7] FEHNIGER T A, BLUMAN E M, PORTER M M, et al. Potential mechanisms of human natural killer cell expansion in vivo during low-dose IL-2 therapy[J]. J Clin Invest, 2000,106(1):117-124. [8] ISHIZUKA O, TANABE T, NAKAYAMA T, et al. The serum concentration of interleukin-2 in a hemodialysis patient--report from interleukin adjuvant therapy for local recurrent renal cancer[J]. Gan To Kagaku Ryoho, 2006,33(3):389-390. [9] 庄玉辉, 李国利, 张晓刚, 等. rIL-2在小鼠体内抗结核菌能力的研究[J]. 上海免疫学杂志, 1992(2):76-77. [10] WANG J, WICKER L S, SANTAMARIA P. IL-2 and its high-affinity receptor: genetic control of immunoregulation and autoimmunity[J]. Semin Immunol, 2009,21(6):363-371. [11] YAMANOUCHI J, RAINBOW D, SERRA P, et al. Interleukin-2 gene variation impairs regulatory T cell function and causes autoimmunity[J]. Nat Genet, 2007,39(3):329-337. [12] SETOGUCHI R, HORI S, TAKAHASHI T, et al. Homeostatic maintenance of natural Foxp3(+) CD25(+) CD4(+) regulatory T cells by interleukin (IL)-2 and induction of autoimmune disease by IL-2 neutralization[J]. J Exp Med, 2005,201(5):723-735. [13] MALEK T R, BAYER A L. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2[J]. Nat Rev Immunol, 2004,4(9):665-674. [14] MALEK T R, YU A, VINCEK V, et al. CD4 regulatory T cells prevent lethal autoimmunity in IL-2Rbeta-deficient mice. Implications for the nonredundant function of IL-2[J]. Immunity, 2002,17(2):167-178. [15] MALEK T R, YU A, VINCEK V, et al. CD4 regulatory T cells prevent lethal autoimmunity in IL-2Rbeta-deficient mice. Implications for the nonredundant function of IL-2[J]. Immunity, 2002,17(2):167-178. [16] TURKA L A, WALSH P T. IL-2 signaling and CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells[J]. Front Biosci, 2008,13:1440-1446. [17] BAYER A L, YU A, MALEK T R. Function of the IL-2R for thymic and peripheral CD4+CD25+ Foxp3+ T regulatory cells[J]. J Immunol, 2007,178(7):4062-4071. [18] 郝学志, 王金万, 孙燕, 等. 重组人白细胞介素-2治疗晚期肿瘤?期临床研究[J]. 中国新药 , 2005(3):338-341.杂志 [19] 倪剑锋, 纪剑飞, 吕安国, 等. 抗GD2单链抗体-IL-2融合蛋白基因的构建及表达[J]. 生物医 学工程学杂志, 2007(1):170-175. [20] GILLIES S D, REILLY E B, LO K M, et al. Antibody-targeted interleukin 2 stimulates T-cell killing of autologous tumor cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992,89(4):1428-1432. [21] HARVILL E T, MORRISON S L. An IgG3-IL2 fusion protein activates complement, binds Fc gamma RI, generates LAK activity and shows enhanced binding to the high affinity IL-2R[J]. Immunotechnology, 1995,1(2):95-105. [22] KLIMKA A, YU N, SHAMI E Y. Construction of proteolysis resistant human interleukin-2 by fusion to its protective single chain antibody[J]. Cytokine, 2003,22(5):134-141. [23] 魏雪涛, 李银, 鲍恩东. 马立克氏病病毒gB与IL-2融合基因载体的构建及表达[J]. 南京农业 大学学报, 2005(2):90-93.