【word】 用溶血素从感染红细胞分离羊泰勒虫裂殖子

【word】 用溶血素从感染红细胞分离羊泰勒虫裂殖子 用溶血素从感染红细胞分离羊泰勒虫裂殖 子 畜牧兽医2007,38(10):1093,1097 ActaVeterinariaetZootechnicaSinica 用溶血素从感染红细胞分离羊泰勒虫裂殖子 李有全,罗建勋,关贵全,马米玲,高金亮,刘志杰,党志胜,刘爱红, 刘军龙,任巧云,鲁炳义,白启,殷宏 (中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室/ 甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046) 摘要:用嗜水气单胞菌产生的细胞毒素一溶血素Ah一1,裂解羊泰勒虫感染的红细胞,通过Percoll密度梯度离心 分离羊泰勒虫裂殖子,建立了一种自感染红细胞中分离泰勒虫裂殖子的快速方法.光学显微镜观察显示,所分离 的羊泰勒虫裂殖子基本保留原有的正常形态,并从宿主细胞成分中游离. 关键词:羊泰勒虫;裂殖子;溶血素;嗜水气单胞菌 中图分类号:$852.72文献标识码:A文章编号:0366—6964(2007)10—1093—05 PurificationofMerozoitesofTheileriaspp.fromInfected ErythrocytesinSheepUsingHemolysin LIYou—quan,LUOJian—xun,GUANGui—quan,MAMi—ling,GAOJin jie, —liang,LIUZhi— DANGZhi—sheng,LIUAi—hong,LIUJun-long,RENQiao-yun,LUBing- yi,BAIQi,YINHong (KeyLaboratoryofVeterinaryParasitologyofGansuProvince,StateKeyLaboratoryof VeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResearchInstitute, ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046,China) Abstract:AsimpleandrapidmethodforpurifyingmerozoitesofTheileriaspp.frominfected erythrocytesinsheeporgoatswasdeveloped.Infectederythrocyteswereeffectivelylysedusing hemolysinAh一 1producedbyAeromonashydrophila,andthelysatewassubjectedtocentrifuga— tioninaPercolldiscontinuousdensitygradientatcommonspeed.Lightmicroscopicalstudy showedthatthemerozoitespurifiedretainedtheirintactbasicstructureandwerefreeofinfected erythrocytemembraneandotherhost—cellcomponents. Keywords:Theileriaspp.;merozoite;hemolysinAh一 1;Aeromonashydrophila 羊泰勒虫是一类寄生于羊血液细胞(如红细胞, 淋巴细胞等)的泰勒科泰勒属的血液原虫,由其引起 的疾病总称羊泰勒虫病(Ovineandcaprinetheileri— osis)1].该病在我国北方地区广泛流行,可引起 羔羊和引进羊大量死亡,使慢性发病的山羊和绵羊 发育迟缓,产肉和产毛量显着下降,从而给养羊业造 成重大经济损失~7].过去,许多研究更多地集中 于牛的泰勒虫,而对羊的泰勒虫关注较少.近年来, 由于小反刍动物在社会经济中的重要性,羊泰勒虫 病的研究已成为国际社会研究的焦点之一. 由于泰勒虫裂殖子寄生于红细胞内,因而采用 传统方法难以获得纯净的虫体,这已经成为阻碍羊 泰勒虫分子生物学研究的主要因素之一.殷宏曾用 低盐裂解感染红细胞,通过差速离心获得大巴贝斯 虫裂殖子,但由于红细胞等碎片较多,影响其在cD— NA文库构建等方面的应用[8].嗜水气单胞菌是一 收稿日期:2006—12—21 基金项目:国家”863”(2006AAlOA207);国家自然科学面上项目 (30571397);欧盟EPIZONE,ICTTD和SSA—INCOME项目(INCONo 510561) 作者简介:李有全(1975一),男,博士生,主要从事原虫免疫学和分子生 物学研究,Tel:0931—8342681,E—mail:youquan—li@163.tom *通讯作者:殷宏,Tel:093l一 8342515,Fax:0931—8340977,E—mail:yinhong@public.1z.gs.cn 1094畜牧兽医 种革兰氏阴性细菌,能产生细胞毒素或溶血素,这种 毒素能裂解哺乳动物细胞而对原虫细胞没有影响. Sugimoto等用溶血素成功裂解感染瑟氏泰勒虫 的牛红细胞,继而用Percoll梯度超速离心,获得纯 化的瑟氏泰勒虫裂殖子.然而在国内,尚未有用溶 血素和Percoll进行泰勒虫裂殖子纯化的相关报道. 笔者在瑟氏泰勒虫裂殖子分离技术的基础上加以改 进,将其用于羊泰勒虫裂殖子的分离,获得了较满意 的结果. 1材料与方法 1.1羊泰勒虫 所用羊泰勒虫是本实验室于2005年5月分离 自我国甘肃省宁县自然感染山羊,经大量繁殖后,在 兰州兽医研究所虫种资源库液氮保藏. 1.2实验动物 0.5,1岁除脾绵羊,购自景泰县无羊泰勒虫地 区.用前30d左右切除脾脏,隔离饲养.在接种前 10d每天涂片检查,无血液原虫时方可用于试验. 1.3试剂 CF-11Cellulose为FarmaciaBiotech产品; PercollTM为AmershamBiosciences产品;RNAlat— erTRNAStabilizationReagent为QIAGEN产品; 溶血素Ah一1,在嗜水气单胞菌(由Sugimoto惠赠) 12h培养物中加10mg/mL的酵母核糖核苷酸,嗜 水气单胞菌Ah一1产生的溶血素按Asao等人的方 法纯化_1叩;Tris-Saline缓冲液(pH7.4,0.1mol/L Tris—HC1,1.5mol/LNaC1)和Tris—Saline—EDTA (pH7.4,0.1mol/LTris—HC1,1.5mol/LNaC1, 0.05mol/LEDTA). 1.4虫体增殖 将液氮中保存感染有虫体的红细胞悬液,在 38?水浴中快速摇振解冻,以2mL红细胞血球泥 (原血6mL,染虫率5)经颈部皮下接种1313号 绵羊.1周后逐日耳尖采血涂片,涂片空气干燥后, 用甲醇固定,姬姆萨溶液染色,在光学显微镜下观 察,注意各类虫体形态及计算染虫率.同时测定直 肠体温,观测临床症状,血液学变化等. 1.5虫血收集 当羊泰勒虫的染虫率达到高峰时,由颈静脉采 集抗凝含虫血,以2000r/rain离心10min,弃上层 血浆部分,再用等量或更多10mmol/LTris—HC1 缓冲液轻轻混匀,2000r/rain离心10min.用1O mol/LTris—HC1缓冲液重复洗涤2次.最后用等 量10mmol/LTris—HC1缓冲液与红细胞轻轻混 匀,准备过柱或4?保存(最好立刻过柱). 1.6虫体的纯化 1.6.1CF11柱制备用丙酮浸泡和悬浮CF11介 质3,5min,将此悬浮液快速装柱(10mL平底注 射器),当柱床达到10mL刻度时,用10mmol/L Tris—HCl缓冲液平衡柱子30min. 1.6.2过柱将等量10mmol/LTris—HC1缓冲 液与红细胞混匀物逐滴加入柱中,在重力作用下,红 细胞能缓缓从柱床底端流出,而白细胞被吸附在介 质中.每个柱子能纯化约5OmL血液.以2000 r/min离心过柱血液10min,再以等体积10 mmol/LTris—HC1缓冲液与红细胞轻轻?昆匀,以备 下步应用.同时取少许血液,涂片,甲醇固定,姬姆 萨染色,观察虫体和红细胞的形态及其变化. 1.6.3裂解红细胞37?孵育红细胞悬液5min, 然后加溶血素于1.6.2中红细胞悬液(按300 U/mL),37?再孵育10min.将红细胞裂解物置冰 上,加入500mmol/LEDTA使其终浓度为1O ML/mL. 1.6.4裂殖体的分离 1.6.4.1不连续梯度的制备:4O和6OPercoll 用Tris—Saline—EDTA缓冲液配制.在50mL透明 离心管(BD,Facon)中先加入4OPercoll15mL, 再用20mL玻璃注射器(携带长针头)吸取15mL 6O9/5Percoll,迅速将针头插入离心管底部,缓缓加 入6OPercoll约10mL. 1.6.4.2不连续梯度离心和虫体保存:将红细胞裂 解物轻轻加在4OPercoll溶液的界面之上,勿破 坏界面.在低速离心机(湘仪,DL一5M)上,4?, 4000r/min离心40min.离心后,可清楚看到在 4O和6OPercoll的界面处,明显有一层颗粒状 或絮状的虫体层.首先吸取4OPercoll界面上的 红细胞裂解物层,尽量吸干净.然后用1mL枪头 吸取上述虫体层,尽量吸取所有可见虫体颗粒,以达 到最大收获量.用等量或更多Tris—Saline—EDTA 缓冲液混匀虫体.4?9000,12000r/min离心 10min.用该缓冲液重复洗涤2次,最后废弃上清, 称量.用RNA稳定剂悬浮虫体,分装在1.5mL离 心管,一8O?保存备用.同时吸取少许虫体,稀释 后涂片,火焰固定并用姬姆萨染色,观察虫体的形态 和纯度. 李有全等:用溶血素从感染红细胞分离羊泰勒虫裂殖子l095 2结果 2.1虫体增殖 接种后20d,直肠体温达40.5?.虫血接种后 第22天,在1313号除脾绵羊的耳尖血液涂片中发 现梨籽形虫体.第47天,染虫率最高达12,此时 从羊颈静脉采700mL抗凝血,用于后面虫体的纯 化.同时取少许血液涂片,甲醇固定并用姬姆萨法 染色.光学显微镜镜检明,红细胞形态基本正常, 白细胞数目明显增多.羊泰勒虫以梨籽形,针形,圆 形(卵圆形)多见,还有一些不规则形虫体,后期出现 三叶草形虫体和十字架形虫体(见图1a,h).第 褰蘸?| . l ?j|t 誊一. 童{每 摹 { 蘩 糟 ?; a,h.羊全血中的羊泰勒虫的形态;i,1.过柱后的羊泰勒虫的形 态;m,P.溶血素裂解后羊泰勒虫的 形态;q,t.梯度离心后的羊泰勒虫的形态 a—h.MorphologyofTheileriaspp.insheepblood:i-1.MorphologyofTheile riaspp.inerythrocytes purifiedbyCF11column:m—P.MorphologyofTheileriaspp.whenerythrocyteswerelysedbyhe— molysin;q-t.MorphologyofTheileriaspp.aftergradientcentrifugation 图1羊泰勒虫的形态 Fig.1MorphologicalformsofTheileriaspp.infectivetosheep 蘩?篷 饕 雾 譬 黪霭爹 ,?/ 譬爹爹 露 霎 雏 ? 睁_|I?IE—,奏?,,?一 . 一曩 1096畜牧兽医 48天,病羊严重贫血,濒死前血液生化表明,血 红蛋白含量由原来的87.3g/L降到43.5L,红细 胞数目由原来的10.2×10/L降到3.5×10/L,患 羊于当天下午死亡. 2.2CFI1柱层析 CF11吸附白细胞,而不吸附红细胞和羊泰勒 虫,利用这一原理,通过CF11柱层析,剔除血液中 的白细胞成分,从而为后面的纯化奠定基础.镜检 表明,在柱层析后,血细胞涂片上的500个视野中, 只有红细胞,而无白细胞(见图1i,1). 2.3裂解红细胞 用红细胞裂解物涂片,甲醇固定并行姬姆萨染 色,光学显微镜镜检表明,溶血素按终浓度300 U/mLJgl入,37?孵育10min就能彻底裂解所有红 细胞.说明该溶血素的活性良好.镜检表明,在裂 解的红细胞中,裂殖子仍保留正常的虫体形态(见图 1m,t),而宿主细胞膜裂解,细胞质结构消失.将 红细胞裂解物置冰上并加入500mmol/LEDTA终 止反应并减少裂殖子的聚集. 2.4裂殖子的分离 光学显微镜镜检显示,溶血素裂解物在不连续 密度梯度离心后,在40Percoll溶液的上面,以及 40和60Percoll溶液的交接面形成区带.上层 区带主要由宿主细胞,未裂解的细胞,细胞碎片和个 别裂殖子组成.在40和60Percoll的交接面由 完整裂殖子组成,未发现宿主细胞碎片和未裂解的 细胞;这部分实质上包含纯化的裂殖子,并且它仍然 保留了纯化前红细胞内虫体的正常结构形态(见图 1q,t).表明Ah一1溶血素处理后,用Percoll梯度 分离虫体,能得到纯化的完整虫体. 3讨论 从感染红细胞内分离和纯化羊泰勒虫裂殖子用 作分子生物学研究材料,通常选用对虫体损害最小 的细胞裂解方法.用弗氏细胞压碎器,渗压震扰,皂 角苷裂解或抗红细胞血清加佐剂,均可造成寄生虫 不同程度的损伤[1.Nyormoi等用高浓度缓冲液 裂解宿主细胞后,通过DEAE纤维素离子交换层 析,从破碎细胞中获得纯化裂殖子l1.Frevert等 改良此法并分离出环形泰勒虫裂殖子[1.尽管利 用这些方法可以得到相应裂殖子,但是对于生化或 分子生物学研究来说,这些方法并不理想,因为这样 很难除去破碎过程中大量释放的宿主细胞核,同时 在漫长而复杂的操作中丧失的寄生虫生物学特性也 难以恢复. 在分离其它细胞内寄生虫时,嗜水气单胞菌毒 素被证明是一种重要的细胞裂解物”].该菌可分 泌产气毒素和溶血素Ah一1,分子质量大约相同,约 为50ku,但其它生化特性有差异,如等电点和对 dithoithreitol的敏感性等[1.’.Howard和 Buckley报道,通过特异性糖蛋白受体,产气毒素易 与红细胞膜结合,形成固定大小的离散的小孔,从而 通过胶体渗透过程导致细胞溶解].裂殖子可能 没有对应的糖蛋白受体,所以产气毒素并不影响虫 体裂殖子.Kozaki等认为嗜水气单胞菌产生的溶 血素或许也能连接到膜磷脂引,但连接磷脂的能力 小于对受体糖蛋白的结合能力口.另一种对宿主 细胞膜选择性裂解的解释为产气毒素对细胞表面膜 受体的不可逆结合在一定程度上减少了游离毒素的 浓度,从而对从细胞释放的裂殖子的裂解不足口. Percoll不连续密度梯度离心被认为是纯化完 整裂殖子的最佳方法.1991年Sugimoto用溶血素 和Percoll梯度离心从感染牛红细胞成功分离出瑟 氏泰勒虫裂殖子,并且其正常的超微结构并未改 变_9J.本试验结果也表明溶血素是一种非常有效的 红细胞裂解物,另外其不会对裂殖子产生损伤,用量 少,几乎没有污染;同时普通离心使得在常规实验室 就能进行虫体的纯化,如用国产低速离心机(湘仪, DL一5M),在4?以4000r/min离心40min,就能达 到预期的离心效果.这种高纯度虫体可用于羊泰勒 虫cDNA文库的构建和其它较高要求的研究. 用光学显微镜计数裂殖子是一种简单有效的定 量方法,该法可以定量红细胞和裂殖子数目,确定二 者裂解与否以及裂解效果.Sugimoto等报道,梯度 离心后裂殖子的最佳回收量约为细胞内裂殖子总数 的17,其余裂殖子和细胞核一起分布于Percoll 梯度的上层区域[9].由于该法纯化的裂殖子保留其 原有的抗原特性和正常形态,因而可被用于生化和 免疫学研究.Sugimoto等报道分离裂殖子可用于 双向凝胶电泳来寄生虫之蛋白特性,以及获取 虫体DNA和RNA用于分子生物学研究_1. 总之,在分离细胞内寄生虫体时,嗜水气单胞菌 毒素(如溶血素)被证明是一种重要的细胞裂解物. 而用Percoll不连续梯度离心,使得分离完整裂殖子 成为可能.它们的联合应用为纯化细胞内寄生虫 (如泰勒虫,巴贝斯虫和疟原虫等)提供了一种行之 1O期李有全等:用溶血素从感染红细胞分离羊泰勒虫裂殖子1097 有效的方法. 参考文献: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [1O] [11] NeitzWO.Theileriosis,gonderiosisandcytauzoono— sis:areview[J].OnderstepoortJournalofVeterina— ryResearch,1957,27:257,43O. MehlhornH,ScheinE,AhmedJS.Theileria[M]. London:AcademicPress,1994.217,304. 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