少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤染色体1p19q杂合性缺失及其临床意义研究（可编辑）

少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤染色体1p19q杂合性缺失及其临床意义研究（可编辑） 少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤染色体1p19q杂合性缺失 及其临床意义研究 新疆医科大学 硕士学位 少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤染色体1p19q杂合性缺失及其临 床意义的研究 姓名李俊芝 申请学位级别硕士 专业病理学与病理生理学 指导教师张巍 2011-04 新疆医科大学硕士学位论文 少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤染色体 1p19q 杂合性缺 失及其临床意义的研究 研究生李俊芝 导师张巍 副教授 摘 要 目的探讨少突胶质细胞瘤染色体 1p19q 杂合性缺失及其临床意义并与星形 细胞瘤进行比较研究选择 2003,2010 年间经病理组织学诊断为不同级 别的少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤合计 81 例包括 WHO ?级少突胶质细胞瘤 23 例WHO?级少突胶质细胞瘤 20 例不同级别星形细胞肿瘤标本 38 例采用荧光 原位杂交技术检测染色体 1p19q 杂合性缺失情况结果81 例少突胶质细胞瘤和 星形细胞瘤中76 例表现为 1p19q 杂合性缺失另外 5 例3 例星形细胞肿瘤2 例少突胶质细胞瘤1 号和 19 号染色体呈多倍体改变76 例 1p19q 杂合性 缺失的 肿瘤中22 例 WHO ?级少突胶质细胞瘤 1p 缺失率为 591 132219q 缺失率 为 636 14221p19q 缺失率为 545 122219 例 WHO?级少突胶质细胞 瘤对应的三种染色体缺失率分别为 737 1419737 1419585 1219 两种级别间三种染色体缺失率差异无统计学意义P 0326 P 0491 P 0577 35 例星形细胞瘤对应的三种染色体缺失率分别为 86 335 143535 和 86 335 与少突胶质细胞瘤三种染色体缺失率差异有统计学意义P 0000 少突 胶质细胞瘤的年轻患者18,60 岁1p19q 杂合性缺失高于老年患者,60 岁 和未成年患者,18 岁P 0007 位于额叶顶叶和枕叶的肿瘤与其他部位肿 瘤相比更多的具有 1p19q 杂合性缺失P 0018 有 1p19q 杂合性缺失组病例 总 生存时间长于 1p19q 未缺失者和仅有 1p 缺失者P 0005 P 0035 而星形细 胞 肿瘤中 1p19q 杂合性缺失这种分子遗传学改变不存在相应的临床意义5 例 1 号和 19 号染色体呈多倍体改变的肿瘤中3 例为星形细胞瘤2 例为少突胶质细胞瘤 结论低级别和高级别少突胶质细胞瘤发生染色体 1p19q 杂合性缺失率均比较高 而星形细胞瘤发生率则比较低两类肿瘤间三种染色体缺失率有明显差异1p19q 杂合性缺失是少突胶质细胞肿瘤特异性的分子遗传学改变少突胶质细胞瘤 1p19q 杂合性与患者的年龄和部位之间有一定的相关性本研究中有 1p19q 杂合性缺失的 患者较没有这种改变或仅有 1p 缺失的患者预后好生存期较长星形细胞瘤 1p19q 1 新疆医科大学硕士学位论文 多倍体比例较少突胶质细胞瘤高可能与星形细胞肿瘤的组成成分有关 关键词少突胶质细胞瘤星形细胞瘤杂合性缺失临床特征 2 新疆医科大学硕士学位论文 Study of loss of heterozygosity of chromosome 1p19q in oligodendroglioma and astrocytoma and its clinical significance PostgraduateLI Jun-zhi SupervisorVice Prof Zhang-Wei Abstract Objective To study the status of loss of heterozygosity LOH of chromosome 1p19q in oligdendroglioma and to analysis the relationship with its clinical features as compared with astrocytoma Methods Eight-one cases of subtypes and grades of gliomas were investigated including 23 low-grade oligodendrogliomas 20 anaplastic oligodendrogliomas and 38 different grades of astrocytoma paraffin-embedded tissue Loss of heterozygosity LOH of chromosome 1p19q was detected by fluorescence in situ hybridisation FISH Results In 81 cases of oligodendroglioma and astrocytoma 5 cases 3 cases of astrocytoma and 2 cases of oligodendroglioma were polyploid of 1p19q In the remaining 76 tumors the positivity rate of 1p loss 19q loss and 1p19q loss was 59 1 63 6and 54 5respectively in 22 cases of low-grade oligodendroglioma while it was 73 7 73 7and 58 5respectively in 19 cases of anaplastic oligodendroglioma There was no statistics difference of LOH of 1p 19q 1p19q between low-grade oligodendroglioma and anaplastic oligodendroglioma P 0326 P 0491 P 0577 While it was 14 3 20and 14 3respectively in 35 cases of astrocytomas There was statistics difference of LOH of 1p19q between oligodendrogliomas and astrocytomas P 0000 The positivity rate of 1p19q LOH was higher in younger patients 1860 years old than in older patients 60 ears of age and teenagers 18 years old P 0007 The positivity rate of 1p19q LOH was higher in frontal lobe and occipital lobe than in other lobes P 0 018 The survival time of patient with 1p19q LOH was longer than those without 1p19q LOH or only with 1p LOH P 0 005 P 0 035 And astrocytomas in the molecular genetics specificity does not exist corresponding clinical significance Polyploid of 1p19q in 5 cases including 3 cases of astrocytoma and 2 cases 3 新疆医科大学硕士学位论文 of oligodendroglioma Conclusion The 1p19q LOH was a common event in oligdendrogliomas but not in astrocytomas LOH of chromosome 1p19q was a distinct molecular abnormality in oligodendrogliomas There wewe correlations between 1p19q LOH and patient age and tumor location The survival time of patients with 1p19q LOH was longer than those without this molecular abnormality or only with 1p LOH polyploidy of 1p andor 19q was more common in astrocytoma subtypes which may be associated with composition of the astrocytomas Key words OligodendrogliomaAstrcytomaLoss of heterozygosityclinical features 4 中英文缩略词对照表 英文缩写 英文全名 中文译名 1p Short arm of chromosome l 1 号染色体 短臂 19q Long arm of chromosome 19 19 号染色体 长臂 LOH Loss of heterozygosity 杂合性缺失 FISH Fluorescence in situ hybridization 荧光原位杂交 PCR Polymerase chain reaction 多聚酶链反应 CGH Comparative genomic hybridization 比较基因组杂交 HPF High power field 高倍镜视野 WHO World Health Organization 世界卫生组织 SPSS Statistic Package For Social Science 社会科学统计软件包 PCV procarbazineCCNUvincristine 甲基苄肼环己亚硝基脲长春新碱 OS Overall survival 总生存时间 CNS Centreral nervous system 中枢神经系统 肿瘤 6 6 MGMT O -methylguanine-DNA O -甲基鸟嘧啶-DNA 甲基转移酶 methyltransferase LGG Low grade glioma 低级别胶质瘤 HGG High grade glioma 高级别胶质瘤 EGFR Epidermal Growth Factor Receptor 表皮生长因子受体 论文独创性说明 本人申明所呈交的学位论文是在我个人在导师的指导下进行的 研究工作及取得的研究成果尽我所知除了文中特别加以标注和致 谢的地方外论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意 学位论文作者签名 签 字日期 导师签名 签字日 期 关于论文使用授权的说明 本人完全了解学校关于保留使用学位论文的各项规定 选择同意不同意以下事项 1学校有权保留本论文的复印件和磁盘允许论文被查阅和借 阅可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存汇编学位论文 2学校有权将本人的学位论文提交至清华大学中国学术期刊 光盘版 电子杂志社用于出版和编入 CNKI《中国知识资源总库》 或其他同类数据库传播本学位论文的全部或部分 学位论文作者签名 签字日期 导师签名 签字日期 新疆医科大学硕士学位论文 前 言 近年来癌症的死亡率已跃居国内各种死因之首尤其以 40,60 岁的中年组为 甚可能与抽烟恶习人口老龄化工业化的进程等有关传统的生活贫困地区常 见肿瘤如食管癌胃癌肝癌等性发病率仍居高不下而富裕国家的肺癌乳腺癌 结肠癌等多发肿瘤却已快速增长大有后来居上趋势神经系统原发性肿瘤虽 然相对 [1] 其他部位肿瘤发病率较低 最新调查显示发达国家脑肿瘤男女发病率分别为 5810 万和 4110 万而发展国家为 3010 万和 2110 万分属男女性第 8 位和 第 10 位高发癌症在发病率不断上升的同时该病还表现出明显的低龄化趋势逐 [2] 渐逼近 40 岁以下青年人且成为威胁儿童健康的重要肿瘤之一 据美国统计在 20,40 岁人群肿瘤死亡病因中脑肿瘤在男性是第一位的死亡病因在女性排第五 位可见脑肿瘤对社会的危害之大[3] 脑肿瘤发生的危险因素1基因及遗传因素肿瘤的发生发展是遗传突变积 累的过程基因改变在原发性脑肿瘤的发生及发展过程中具有重要作用在这个过 程中正常细胞发生免疫逃逸增殖失控等改变最终转化为具有永生能力的肿瘤 细胞 [1] 2 放射因素接触放射线可导致脑肿瘤的发生急性淋巴细胞性白血病 儿童接受中枢神经系统预防性放射治疗可增加少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤恶性 [4] 胶质瘤发生的危险性垂体腺瘤接受放射治疗后常被检出胶质瘤 3创伤因素 颅脑损伤时脑肿瘤发生的潜在因素因外界创伤刺激到脑脑膜瘢痕组织间而引发 肿瘤这种创伤性肿瘤多半发生在硬脑膜和蛛网膜损伤的基础上此外脑部外伤 可促使原已存在的脑肿瘤加速生长4 手机电脑辐射手机电脑发出的辐射电 [5] 波可能有促进细胞癌化的作用与脑肿瘤的发生有关 由于历史及地理的原因新疆经济文化和医疗发展相对迟缓在边远地区因 病致贫因病返贫是制约新疆社会发展的重要因素目前常见病多发病日益受 到重视对其诊疗过程已有较明确的规范和指南然而由于对少见疾病认识不足 诊断及治疗的手段较为局限常造成误诊漏诊及过度治疗虽然近年来对各种肿 瘤的治疗都获得了长足的进步但在恶性脑肿瘤治疗方面还没有取得令人满意的效 果特别是最常见的胶质瘤临床预后还很差因此在神经肿瘤领域不仅需要 外科手术和病理诊断等方面进行探索还需要在肿瘤的发生发展分子遗传学等基 础方面进行深入的研究因此在新疆从分子遗传学角度对中枢神经系统肿瘤 进行 系统研究具有重要的价值 胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤国内外统计其发病率占所有原发 性中枢 神经系统肿瘤的 43,51[6] 胶质瘤主要包括星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤少 5 新疆医科大学硕士学位论文 突胶质细胞瘤是颅内起源于少突胶质细胞的肿瘤是胶质瘤的一种独立类型约占 颅内肿瘤的 439[7]分为少突胶质细胞瘤oligodendrogliomagrade grade ?和间 变性少突胶质细胞瘤anaplasticoligodendrogliomagrade ?近些年来少突胶 质细胞瘤的分子遗传学研究有了较大的进展 利用杂合性缺失LOH 方法检测 到少突胶质细胞瘤最常见的遗传学该变是 19 号染色体长臂的杂合性缺失LOH 1 号染色体短臂的杂合性缺失LOH 第二个常见的遗传改变是 1994 年 Reifenberger[8]等发现染色体 1p19q 杂合性缺失LOH 是少突胶质细 胞肿瘤相对特异的分子遗传学改变而后有人对少突胶质细胞瘤不同分级中分子 生物学改变进行了研究何杰Gelpi [9 10]等人研究发现在少突胶质细胞瘤 WHO ? 级中 1p 和 19qLOH 检出率比 WHO?级少突胶质细胞瘤高但差异无显著性 在研究上述改变的同时有学者对 1p 和 19qLOH 与患者治疗方法之间的选择进 行了相关方面的研究1998 年Cairncross[11] 等首次报道在间变少突胶质细胞瘤 中1p19q 联合杂合性缺失1p19q loss of heterozygosity1p19q LO H与患者化 疗的疗效及预后紧密相关以后在其他类型少突胶质细胞肿瘤中关于 1p19q LOH 与 PCV 即甲基苄肼procarbazine 环己亚硝基脲 CCNU 长春新碱 vincri stine 化疗敏感性的关系也得到陆续证实[12] 人们还发现1p 杂合性缺失1p LOH多 是整条短臂缺失且往往同 19q 杂合性缺失19q LOH同时发生单纯 1pLOH 的患者就有与化疗敏感相关的特性而不论是否伴有 19q LOH[13] 同时有研究者指 [14] 出1p LOH 不仅与这部分患者的化疗敏感性相关而且还与其放疗敏感性相关 还有学者在研究少突胶质细胞瘤的发病部位与其分子遗传学改变及预后中又提 出了不同部位的少突胶质细胞瘤可能具有不同的分子遗传学改变可能预示着不同 的预后发生在颞叶的少突胶质瘤对化疗的敏感性不如发生在额叶顶骨和枕 骨等 处的肿瘤发生于额叶的肿瘤多伴有 1p19q 杂合性缺失可能与预后较好有关[15] 肿瘤的发生发展是多因素多阶段发展变化的过程不同类型胶质瘤可能存在 不同的分子遗传学特点即使是同一病理组织学的肿瘤其分子机制也有差异可 以分为不同的分子亚型越来越多的学者试图通过对少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤 相关肿瘤分子标记物研究从而达到对二者的病理鉴别诊断预后的目的 更为有趣的是目前认为即使组织学分型完全相同的星形细胞瘤和少突胶质细 胞瘤其分子遗传学特点及其临床进展也是不同的通过分子遗传学研究可能不仅 有助于组织学诊断对于预后的评估和选择更为有效的针对性更强的治疗可 能也是十分有用的因此分子遗传学的研究对少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤的分类 及其治疗具有十分重要的意义 本研究应用荧光原位杂交技术FISH 分析少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤常规 石蜡标本中特异性的分子生物学改变寻找与他们相关的特异性分子标记物旨在 6 新疆医科大学硕士学位论文 阐明某些特异性分子标记物在不同类型不同级别的少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤 表达的差异探索与少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤的病理鉴别诊断有意义的客观性 指标同时结合其临床随访资料寻找有意义的预后评估指标从而为诊断鉴别 诊断及预后判断提供一定的依据和线索 7 新疆医科大学硕士学位论文 内容与方法 1 研究对象 11 临床资料 收集新疆医科大学第一附属医院病理科 2003,2010 年 81 例少突胶质细胞瘤和 星形细胞瘤病人的肿瘤标本其中男性 37 例女性 44 例男女比率为 084 100 男性年龄 1,65 岁平均手术年龄为 319 岁女性 6,73 岁平均手术年龄为 367 岁所有病例的病理形态学均由 2 位神经病理学专家严格按 2007 年《WHO 中枢神 经系统肿瘤分类》标准分类[16]来确定肿瘤的病理类型和级别其中包括 23 例少突 ?级20 例间变性少突胶质细胞瘤WHO?级18 例毛细胞 胶质细胞瘤WHO 型星形细胞瘤10 例星形细胞瘤WHO ?级10 例间变性星形细胞瘤WHO? 级共 5 类图1-4 图 1 图2 图3 图4 图 1 少突胶质细胞瘤瘤细胞胞浆透亮细胞膜明显 HE ×400 图2 间变性少突胶质细胞瘤高度异性的瘤细胞活跃的核分裂 HE ×400 图3 毛细胞型星形细胞瘤典型的双向结构 HE ×400 图4 肥胖细胞型星形细胞瘤肿瘤细胞胞浆丰富 HE ×400 12 肿瘤部位及分组 肿瘤部位指肿瘤主体所在脑叶和区域在 81 例少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤 中15 例位于额叶14 例位于颞叶5 例位于顶叶2 例位于枕叶2 例位于岛叶 例位于颞顶叶3 例位于额颞叶1 例位于顶枕叶1 例位于额枕叶3 例位于7 胼 胝体1 例位于鞍区6 例位于脑室4 例位于丘脑2 例位于大脑镰15 例位于小 脑为了便于分析本组将累及额叶枕叶顶叶的肿瘤统一归入额顶枕叶组而 将累及其他脑叶的肿瘤统一归入其他组 8 新疆医科大学硕士学位论文 13 石蜡切片制作及复查切片 新鲜组织用 10甲醛固定石蜡包埋切片进行HE 染色在普通光镜下对肿 瘤组织的 HE 切片进行形态学观察选取组织定位脱蜡自然干燥备用光镜 下观察各例中所有 HE 切片挑选 1 张典型切片及其对应的蜡块经重新切片分 别进行 HE 染色4um 涂胶白片行荧光原位杂交染色 14 随访资料 采用电话随访法对患者生存期进行随访病人的生存时间以明确诊断接受手术 治疗为起点死亡为终点观察随访日期截止至 2010 年 10 月 30 日生存期以月为 计算单位18 例失访随访率为 763 失访者自失访之日起按截尾数据处理 2 荧光原位杂交染色fluorescence in situ hybridizationFISH 21 荧光原位杂交原理 荧光原位杂交 fluorescence in situ hybridizationFISH 其基本原理是基于 DNA 双链互补的特性将荧光标记的 DNA 片段探针特异性杂交于靶核酸序列染 色体或基因然后通过荧光显微镜观察结合到靶序列上的探针从而检测某一 特定 靶序列变化结构和数目见图2-1 探针是一段荧光标记的核酸DNA 片段 DNA 靶标的指示见图2-2 DNA 靶标可能被用作寻找另一互补 是一个特异 性条带一个基因一个染色体片段或一个完整染色体 图2-1 荧光原位杂交 FISH 技术原理图 22 荧光原位杂交所用试剂 FISH 杂交所用的探针可分为四类1全染色体涂抹探针Whole chromosome painting probes WCP 2 染色体计数着丝粒探针Chromosome enumeration probe CEP 3 位点特异性探针locus specific IdentifyLSI 4 染色体特异重 复序列探针本组所用探针为位点特异性探针图 2-2 9 新疆医科大学硕士学位论文 221 1 号和 19 号染色体位点特异性探针LSI DNA FISH 探针 货名Vysis LSI 1p36LSI 1q25 and LSI 19q1319p13 Dual Color Probe -2 图2 生产厂家美国 Vysis 公司 货号32-2300407J73-001 区带1p361q25 and 19q1319p13图2-3 图2-2 荧光原位杂交 FISH 探针模式图 Probe Maps 图2-3 1p361q25 and 19q1319p13 Probe Maps 222 荧光原位杂交辅助试剂 柠檬酸钠 北京金菩嘉医疗科技有限公司 氯化钠 北京金菩嘉医疗科技有限公司 NP-40 北京金菩嘉医疗科技有限公司 2 ×SSC 溶液 北京金菩嘉医疗科技有限公司 DAPI 北京金菩嘉医疗科技有限公司 蛋白酶 K 北京金菩嘉医疗科技有限公司 10 新疆医科大学硕士学位论文 封片胶 北京金菩嘉医疗科技有限公 司 23 荧光原位杂交溶液配制 2 31 20 ×SSCPH53 氯化钠 88g 柠檬酸钠 44g 去离子水 400ml 充分溶解室温下 1M HCl 调节 pH 值至 53用去离子水定容至 500ml 高压 个月若试剂出现混浊或污染灭菌使用期间 2,8?储存保存期不要超过 6 应丢 弃 232 2 ×SSCPH70 ?02 20 ×SSC PH53 100ml 去离子水 800ml 充分混匀室温下 1M NaOH 调节 pH 值至 70 ?02用去离子水定容至 1L 使用期间 2,8?储存试剂配制 6 个月后应丢弃若试剂出现混浊或污染应丢弃 2 33 乙醇溶液70 ,乙醇85 ,乙醇 将 700ml850ml 无水乙醇用去离子水分别稀释至 1L使用期间2,8?储存 2 34 01 ,NP-402 ×SSC 洗液pH 70 ?02 20 ×SSC PH53 400ml NP-40 04ml 去离子水 300ml 充分混匀室温下 1M NaOH 调节 pH 值至 70 ?02用去离子水定容至 400ml 使用期间 2,8?储存试剂配制 6 个月后应丢弃若试剂出现混浊污染应丢弃 235 03 , NP-4004 ×SSC 洗涤液用于快速洗涤方案 20 ×SSC pH 53 200ml NP-40 3ml 去离子水 950ml 充分混匀室温下 1M NaOH 调节 pH 值至 70,75用去离子水定容至 1L 11 新疆医科大学硕士学位论文 使用期间 2,8?储存试剂配制 6 个月后应丢弃若试剂出现混浊或污染应丢弃 2 36 20mgml 的胃蛋白酶储存溶液 溶解 20mg 胃蛋白酶SigmaP7000 于 1ml 无菌水中煮沸 15 分钟冷却至 室温-20?分装储存 24 荧光原位杂交主要仪器 荧光显微镜日本奥林巴斯 OLYMPUS 图像采集分析系统俄罗斯Vido-Test 普通光学显微镜日本 OLYMPUS BX41 恒温水浴箱上海精恒试验设备有限公司 荧光原位杂交仪DAKO 公司 摊片机烤片机德国徕卡 Leica 酸碱分析仪赛多利斯 电子天平蒸馏水机 载玻片盖玻片镊子量筒量杯 25 荧光原位杂交染色步骤 采用少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤石蜡切片荧光原位杂交标准操作步 骤 251 样本玻片的准备 操作实验前准备好必备的实验试剂溶液及仪器 1将组织切片切成3,5um 厚度切片 2 将组织切片置于 40 ?的去离子水浴三蒸水中漂浮展开将组织切片 置 于带正电的玻片上 3 玻片晾干置于65?下烘片过夜 252 玻片脱蜡 1将组织切片浸于二甲苯一般情况可以反复利用但使用过后建议用封口 膜密封使用原则是不至于出现混浊中室温脱蜡 2 次每次 10 分钟提洗数次 2 浸入 100乙醇中 5 分钟 3 将组织切片依次室温置于 100,乙醇85 ,乙醇和70 ,乙醇中各2min 复 水 253 预处理玻片 1100?下柠檬酸酸钠处理组织切片 30 分钟 2 室温放置30 分钟 3 取 0015g 胃蛋白酶溶于30ml 蒸馏水与 150μl 盐酸中得到胃蛋白酶工作液 将组织切片浸泡在胃蛋白酶工作液中55?下孵育 10min 4 组织切片经胃蛋白酶消化后蒸馏水中漂洗3 次每次 5min 12 新疆医科大学硕士学位论文 5 室温自然干燥 254 杂交过程 1待玻片烤片干燥后取配置好的 1 人份的探针 10uL 加于样本区域 盖上 盖片后封片胶封片 2 杂交仪变性杂交83?变性 5min42 ?杂交过夜 255 玻片的洗涤 快洗方案 1配置30ml 03 ,NP-4004 ×SSC 溶液置于 67?水浴锅中预 热试验 前测试瓶内温度达到 67?方可开始洗涤 2 30ml 01 ,NP-402 ×SSC 溶液室温备用 3 将杂交后的玻片取出揭掉表面的封口胶将玻片放入2 ×SSC 溶液中反 复清洗洗去盖片后开始玻片洗涤 4 将玻片放入67?03 ,NP-4004 ×SSC 溶液中洗涤 2 分钟 5 室温下01 ,NP-402 ×SSC 溶液中洗涤 1 分钟 6 玻片置于室温的2 ×SSC 或 70乙醇中洗涤 1 分钟 7 取出后在暗处自然干燥3,5 分钟后 8 玻片干燥后滴加 15ulDAPI 于样本区盖上盖片避光保存 15,20 分钟 后观察结果 26 结果判定 荧光显微镜分析肿瘤切片结果判读标准参照文献[17] 用Olympus 型荧光显微 镜在滤光镜的激发下观察间期细胞的红色荧光杂交信号和绿色荧光杂交信号 LSI1p36 探针在正常间期细胞中表现为两个红色荧光杂交信号LSI1q25 探针在正常 间期细胞中表现为两个绿色荧光杂交信号LSI19q13 探针在正常间期细胞中表现为 两个红色荧光杂交信号LSI19p13 探针在正常间期细胞中表现为两个绿色荧光杂交 信号选择细胞核大小一致核的边界完整DAPI 染色均一细胞核孤立无重叠 红色荧光杂交信号和绿色荧光杂交信号清晰的间期细胞进行分析计数高倍镜视野 HPF 下 200 个细胞核内红色荧光杂交信号数和绿色荧光杂交信号数计算其百 分比1p36 缺失评判1p361q25 即红色信号绿色信号,085 为 1p36 缺失红色 信号和绿色信号均为多个红色信号绿色信号 1 为 1 号染色体呈多倍体改 变19q13 缺失评判19q1319p13 红色信号绿色信号,09 为 19q13 缺失红色信号和绿色信 号均为多个红色信号绿色信号 1 为 19 号染色体呈多倍体改变 27 统计学分析 用 SPSS170 软件进行统计学分析用x2 和 Fisher 确切概率法和 Spearman 秩相 关评估两变量之间是否有统计学相关性生存曲线分析采用 Kapalan-Meier 法单 因素生存曲线比较采用Log-rank 检验P ,005 为差异具有统计学意义 13 新疆医科大学硕士学位论文 结 果 1 少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤 1p19q 杂合性缺失情况 少突胶质细胞瘤染色体 1p 缺失图 3-1A 和 19q 缺失图 3-1B 1p19q 未 缺失 图3-1C3-1D 星形细胞瘤染色体 1p 缺失 图3-2A 和 19q 缺失 图3-2B 1p19q 未缺失图 3-2C3-2D 76 例少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤中 1p 和 19q 杂合性缺失情况设为两组表 1第一组22 例 WHO ?级少突胶质细胞瘤和 19 例间变性少突胶质细胞瘤22 例 WHO ?级少突胶质细胞瘤中1p 缺失率为 591 132219q 缺失率为 636 14221p19q 缺失率为 545 122219 例间变性少突胶质细胞瘤中1p 缺 失率为 737 141919q 缺失率为 737 14191p19q 缺失率为 632 1219 WHO ?级少突胶质细胞瘤和间变性少突胶质细胞瘤之间 1p19q 和 1p19q 杂合性 缺失率差异均无统计学意义P 0326 P 0491 P 0577 第二组18 例 WHO ? 级毛细胞型星形细胞瘤8 例 WHO ?级星形细胞瘤9 例间变性星形细胞瘤18 例 WHO ?级毛细胞型星形细胞瘤中1p 缺失率为 111218 19q 缺失率为 111 218 1p19q 缺失率为 111 218 8 例 WHO ?级星形细胞瘤中1p 缺失率 为 375 38 19q 缺失率为 50 48 1p19q 缺失率为 375 38 间变性 星形细胞瘤WHO?级对应的三种染色体缺失率分别为 0 09 111 19 0 09 不同级别星形细胞肿瘤之间 1p19q1p19q 杂合性缺失率差异均无统 计学意义P 0075 P 0054 P 0075 第一组与第二组之间三种染色体缺失率 差异有统计学意义P 0000 其中1p19q 杂合性缺失与少突胶质细胞瘤典型的 组织学特征之间的关系见表 2 图3-1 A 图3-1 B 图3-1 1p19q 杂合性缺失的少突胶质细胞瘤 图3-1 A 1p 缺失 FISH 染色×1000图3-1 B 19q 缺失 FISH 染色 ×1000 14 新疆医科大学硕士学位论文 图3-1 C 图3-1 D 图3-1 1p19q 均无缺失的少突胶质细胞瘤 图3-1 C 1p 未缺失 FISH 染色×1000图3-1 D 19q 未缺失 FISH 染色 ×1000 图3-2 A 图3-2 B 图3-2 1p19q 杂合性缺失的星形细胞瘤 图3-2 A 1p 缺失 FISH 染色×1000图3-2 B 19q 缺失 FISH 染 色×1000 图3-2 C -2 D 图3 图3-2 1p19q 均无缺失的星形细胞瘤 图3-2 C 1p 未缺失 FISH 染色×1000图3-2 D 19q 未缺失 FISH 染色× 1000 15 新疆医科大学硕士学位论文 表 1 不同组织学类型的肿瘤 1p19q 杂合性缺失情况例数0 项目 例数 1p 缺失 19q 缺失 1p19q 联合缺失 41 a a a 少突胶质细胞肿瘤 27 659 28 683 24 585 b b b 少突胶质细胞瘤WHO ?级 22 13 591 14 636 12 545 间变性少突胶质细胞瘤WHO?级 19 14 737 14 737 12 632 35 c c c 星形细胞起源肿瘤 5 143 7 20 5 143 毛细胞型星形细胞瘤WHO ?级 18 2 111 2 111 2 111 星形细胞瘤WHO ?级 8 3 375 4 50 3 375 间变性星形细胞瘤WHO?级 9 0 1 0 注a 少突胶质细胞肿瘤与星形细胞起源肿瘤 1p19q1p19q 缺失率差异有 统计学意义 P 0000 b WHO ?级少突胶质细胞瘤和 WHO?级少突胶质细胞瘤之间 1p19q 1p19q 和 杂合性缺失率差异均无统计学意义P 0326 P 0491 P 0577 c 不同级别星形 细胞瘤之 间 1p19q1p19q 杂合性缺失率差异均无统计学意义P 0075 P 0054 P 0075 表 2 少突胶质细胞瘤典型的组织学特征与 1p19q 缺失关系例 数 项目 例数 典型 非典型 P 值 1p19q 缺失 24 21 875 3 125 1p19q 未缺失 17 9 529 8 471 0014 合计 41 30 732 11 268 注1p19q 缺失与少突胶质细胞瘤典型的组织学特征有关差异有统计学意义 P 0014 2 少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤中 1p 和 19q 缺失之间的相关性 76 例少突胶质细胞肿瘤和星形细胞肿瘤中38 例500 没有合并 1p 和 19q 杂合性缺失3 例40 1p 杂合性缺失的少突胶质细胞肿瘤和星形细胞肿瘤患者 无 19q 杂合性缺失6 例79 19q 杂合性缺失的少突胶质细胞肿瘤和星形细胞 肿瘤患者无 1p 杂合性缺失29 例382 肿瘤病例 1p 和 19q 联合性缺失表3 16 新疆医科大学硕士学位论文 表 3 少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤中 1p 和 19q 缺失情况比较[例数] 19q13 P 值 项目 例数 缺失 未缺失 少突胶质细胞瘤 WHO ?级 22 14 636 a 8 364 0000 1p36 缺失 13 12 545 1 45 1p36 未缺失 9 2 91 7 318 间变性少突胶质细胞瘤WHO?级 19 14 737 b 5 263 0049 1p36 缺失 14 12 632 2 105 1p36 未缺失 5 2 105 3 158 星形细胞起源的肿瘤 35 7 20 c 28 80 0000 1p36 缺失 5 5 143 0 00 1p36 未缺失- 30 2 57 28 800 注a WHO ?级少突胶质细胞瘤 1p36 缺失与 19q13 缺失呈正相关r 0716 P 0000 b WHO?级间变性少突胶质细胞瘤 1p36 缺失与 19q13 缺失呈正相关r 0457 P ,005 c 星形细胞瘤 1p36 缺失与 19q13 缺失呈正相关r 0816 P 0000 3 少突胶质细胞瘤和星形细胞肿瘤中 1 号和 19 号染色体多倍体情 况图 3-3图 3-4 图3-3 1 号染色体多倍体 图3-4 19 号染色体多倍体 FISH 染色×1000 FISH 染色×1000 5 例 1 号和 19 号染色体呈多倍体改变的少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤病例中 WHO ?级少突胶质细胞瘤 1 例15WHO?级少突胶质细胞瘤 1 例15WHO ? 级星形细胞瘤 2 例25 WHO?级星形细胞瘤 1 例15其中4 例为女性患 者1 例为男性年龄 13,63 岁平均 318 岁其中 3 例位于顶叶1 例位于颞叶 例位于颞顶叶3 例为汉族病例2 例为少数民族病例 1 4 少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤中 1p19q 杂合性缺失与患者临床 特征之间的关系 17 新疆医科大学硕士学位论文 1p19q 杂合性缺失与少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤患者临床因素关系分析表 4 41 例少突胶质细胞瘤中,18 岁组 3 例,60 岁组 3 例共 6 例肿瘤均无 1p19q 杂合性缺失而 18,60 岁组与前两组相此35 例肿瘤病例中 24 例686 存在 1p19q 杂合性缺失且差异有统计学意义P 0007 额顶枕叶少突胶质细胞肿瘤 1p19q 杂合性缺失率为 812 1316高于其他部位44 1125差异具有统计 学意义P 0018 1p19q 杂合性缺失与少突胶质细胞肿瘤患者性别和族别之间 无 明显相关性P 0326 P 0975 星形细胞肿瘤中 1p19q 杂合性缺失在不同年龄 部位性别族别间差异均无统计学意义P 0832 P 0855 P 0129 P 0889 表 4 1p19q 杂合性缺失与肿瘤患者临床特征的关系 例数 少突胶质细胞瘤 星形细胞瘤 项目 例数 1p19q 1p19q P 值 1p19q 1p19q P 值 缺失 未缺失 缺失 未缺失 年龄 ,18 岁 17 0 00 3 1000 2 143 12 857 d 18-60 岁 54 24 686 11 314 3 158 16 842 0832 0007a ,60 岁 5 0 00 3 1000 0 00 2 1000 部位 额顶枕叶 22 13 812 3 188 1 167 5 833 b d 0018 0855 其他 44 11 44 14 56 4 138 25 862 性别 男性 35 9 50 9 50 4 235 13 765 c d 0326 0129 女性 41 15 652 8 348 1 56 17 944 族别 汉族 44 14 583 10 417 3 150 17 850 c d 0975 0889 少数民族 32 10 588 7 412 2 133 13 867 注a少突胶质细胞瘤患者 18,60 岁组 1p19q 缺失明显高于其他两组P 0007 b 少突 胶质细胞瘤额顶枕叶组肿瘤发生 1p19q 杂合性缺失率高于其他部位P 0018 c少突胶质细 胞瘤不同性别不同民族间发生 1p19q 缺失差异无统计学意义P 0326P 0975 d星形 1p19q 缺失在不同年龄部位性别族别间差异无统计学意义P 0832 P 细胞瘤 0855 P 0129 P 0889 5 WHO ?级和 WHO?级肿瘤 1p19q 杂合性缺失与患者预后之间 的关系 本组 41 例少突胶质细胞瘤包括 WHO ?级少突胶质细胞瘤和 WHO?级少突 18 新疆医科大学硕士学位论文 胶质细胞瘤31 例获得随访3141756 随访时间为 1,92 个月平均随访 时间 65 个月其中 21 例存活10 例死于本病17 例星形细胞瘤包括 WHO ? 级星形细胞瘤和 WHO?级星形细胞瘤15 例获得随访1517882 随访时间 为 1,52 个月平均随访时间 26 个月其中5 例存活10 例死于本病 生存期分析显示少突胶质细胞瘤 1p19q 缺失的患者中位生存时间为 77 个月 5 年总生存率 77 仅有 1p 缺失患者中位生存时间为 48 个月5 年总生存率 33 而 1p19q 未缺失者中位生存时间 43 个月5 年总生存率 20 1p19q 缺失组中位 生存时间长于仅有 1p 缺失组且差异有统计学意义P 0035 图4 1p19q 缺失 组中位生存时间也长于 1p19q 未缺失组差异有统计学意义P 0005 图 5 仅 1p 缺失组虽然中位生存时间长于 1p19q 未缺失组但差异无统计学意义P 0896 图 6 星形细胞瘤 1p19q 缺失的患者中位生存时间 38 个月3 年总生存率 67 而 1p19q 未缺失者中位生存时间 23 个月3 年总生存率 42 星形细胞瘤中 1p19q 缺失组中位生存时间长于 1p19q 未缺失组但差异无统计学意义P 0270 图 7 1p19q 联合缺失和 1p 缺失与少突胶质细胞瘤患者生 图4 存率关系 19 新疆医科大学硕士学位论文 图 5 1p19q 杂合性缺失与未缺失少突胶质细胞瘤患者生存率关系 图 6 1p19q 未缺失和仅 1p 缺失与少突胶质细胞瘤患者生存率关系 图 7 1p19q 杂合性缺失与未缺失星形细胞瘤患者生存率关系 20 新疆医科大学硕士学位论文 讨 论 胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤其发病率据国内外统计占所有原发性中 枢神经系统肿瘤的 43,51[6] 胶质瘤主要包括星形细胞肿瘤和少突胶质细胞肿 瘤少突胶质细胞肿瘤瘤是颅内起源于少突胶质细胞的肿瘤是胶质瘤的一种独立 类型分为少突胶质细胞瘤oligodendroglioma grade ?和间变性少突胶质细胞瘤 anaplastic oligodendrogliomagrade ?约占颅内肿瘤的 439[7]占胶质瘤的 5,18仅次于星形细胞肿瘤[16] 20 年前区别少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤 几乎没有任何临床意义其治疗方案相同仅仅是预后不同但 1988 年 Cairncross 等[11]首次报道少突胶质瘤对化疗敏感以来发现有染色体 1p19q 杂合性缺失的少突 胶质细胞瘤对 PCV 化疗药物较为敏感而且预后较好此结果显示如果在选择合 理的治疗前就可以将胶质瘤准确分类无疑将使治疗更具针对性而提高疗效和患者 的生存质量 这对病理诊断提出新的要求因为治疗方案不同必须正确诊断对 于典型的星形细胞肿瘤和少突胶质细胞肿瘤鉴别并不困难但是仍有相当部 分的 星形细胞肿瘤尤其是高级别的星形细胞瘤与少突胶质细胞瘤鉴别有困难从而造 成诊断的重复性及一致性较差目前通过免疫组织化学及原位杂交的方法没有特异 性的指标区别二者 少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤按2007 年WHO 中枢神经系统新分类都是神经上 皮起源的肿瘤属于不同类型的胶质瘤经典的组织细胞学认为它们在生物学方面 差别很大少突胶质瘤在光镜下最具特点容易诊断但少突胶质细胞瘤星形细 胞瘤中在常规病理诊断中形态学上还是有交叉很多情况下准确的诊断存在 问题 近年来随着病理诊断水平影像技术及其他医学水平的不断提高人们发现以往 许多少突胶质细胞瘤容易被误诊为星形细胞瘤尤其是高级别的星形细胞瘤 甚至 是胶质母细胞瘤由于其治疗方案有明显的区别且预后差别较大正确的诊断十 分重要目前除形态学以外又无客观的指标能够有效地区别通过此研究筛选 少突胶质细胞瘤星形细胞瘤特异性分子标志物探讨其在临床病理诊断鉴别诊 断的价值进而获得少突胶质细胞瘤星形细胞瘤中鉴别诊断的特异性肿瘤标志物 同时探讨临床预后因子为临床预后判定乃至个体化治疗方案奠定理论依据 肿瘤的发生发展是多因素多阶段发展变化的过程不同类型胶质瘤可能存在 不同的分子遗传学特点即使是同一病理组织学的肿瘤其分子机制也有差异 可 以分为不同的分子亚型目前认为即使组织学分型完全相同的星形细胞肿瘤和少突 胶质细胞肿瘤其分子遗传学特点及其临床进展也是不同的通过分子生物学 研究 可能不仅有助于组织学诊断对于预后的评估和选择更为有效的针对性更强的治 21 新疆医科大学硕士学位论文 疗方案可能也是十分有用的 1 1p19q 的结构和生物学特性 近些年来少突胶质细胞瘤的分子生物学研究有了较大的进展利用杂合性缺 失LOH 方法检测到少突胶质细胞瘤最常见的遗传学该变是 19 号染色体长臂19q 的杂合性缺失第二个常见的遗传改变是 1 号染色体短臂1p的杂合性缺失1p 和 19q 杂合性缺失是少突胶质细胞肿瘤特异性的分子遗传学改变19 号染 色体是短 的中着丝粒染色体1 号染色体为大的中着丝粒染色体根据染色体的大小和着丝 粒的位置与其他染色体易于区别 19 号染色体是由美国联合基因组研究所破译的是人类所有染色体中基因密度 最高的是迄今为止科学家破译的包含基因最多的染色体包含 1500 个基因占人 类基因组的 2 它具有高GC 含量高复制率和高重排率的特点这预示该染色 体在生物进化中有重要意义其中许多基因与呈孟德尔式遗传规律的疾病有关包 括家族性高胆固醇血症非胰岛素依赖性糖尿病等 在人体全部 23 对常染色体中1 号染色体包含基因数量最多其基因数 目多达 3141 个是平均水平的两倍共有超过 223 亿个碱基对破译难度也最大科学家 在破译 1 号染色体的过程中至少发现了 1000 种新基因其中集中了高密度的与细 胞生长增殖分化相关的基因同时由于研究技术的不断发展近年来有大量 的文献报道在不同的肿瘤中 1 号染色体存在各种水平的结构异常有关 1 号染色体 与肿瘤的相关性引起人们的高度重视Sakari 等[18]统计了结肠癌神经母细胞瘤 乳腺癌肝癌肺癌等 73 种不同肿瘤的比较基因组杂交结果发现 34的肿瘤都 有 1p 缺失并且其最小缺失区域重叠于染色体 1p361提示该区域存在候选的肿瘤 抑制基因Ragnarsson 等[19]报道了 683 例不同肿瘤有关 1p 杂合性缺失的分析结果 平均 54的肿瘤 1p 上至少有一个位点缺失其中子宫内膜癌 72肉瘤 64乳 腺癌 61肺癌 60结肠癌 55卵巢癌 55胃癌 53睾丸癌 37肾癌 高频缺失位点依次集中于 1p35-1p3431p361 及 1p363等三 30胰腺癌29 个区域提示这些区中有相关的肿瘤抑制基因存在人类基因研究将促进生物学的 不同领域如神经生物学分子生物学细胞生物学等的发展人们从中更可以研究 出诊断和治疗 5000 多种遗传性疾病以及恶性肿瘤心血管系统疾病和其他严重疾患 的方法阻止甚至扭转一些疾病的遗传其中超过 300 多种疾病被认为与 1 号染 [16] 色体上的基因出现问题有关包括帕金森氏症癌症智障和老年痴呆症等 最近的研究证明 1p 和 19q 的联合性缺失是由于 1 号和 19 号染色体的不平衡易 位所致的[20 21]形成了两种衍生物就是 der 119p10 q10 和der 119 q10 p10 而后 der 119p10 q10 这条染色体丢失 少突胶质细胞瘤中 1p19q 较高的缺失率被认为其染色体臂上可能含有相关的 22 新疆医科大学硕士学位论文 肿瘤抑制基因精确的寻找和后续的克隆这些染色体上的肿瘤抑制基因对理解这些 染色体改变的意义和推广至临床实践中是非常有意义的在人类的许多肿瘤中从实 性肿瘤到淋巴瘤骨髓增殖性性疾病中都有 1 号染色体的异常尤其是 1 号染色体 的末端丢失[30-33]p73 是新近发现与 p53 类似的基因与 1 号染色体共同缺失但 不认为是 1 号染色体的肿瘤抑制基因少突胶质细胞肿瘤中 1 号染色体的 丢失一般 是整体染色体臂的丢失已经证实的 1 号染色体短臂上的缺失主要集中在 1p342pter -p351p3621p363-pter1p343-3611 等位点缺失的报道区域已有 1p34 [22-24] 但 是这些区域是否存在相关的抑癌基因尚未得到证实目前检测 1p 缺失最常用的 [11] [25] 位点是 D1S2734 D1S199 和 D1S508 张淑坤 等人采用 QuMA 方法对 28 例 少突胶质细胞肿瘤染色体 1p 上四个位点 D1S214 D1S468 D1S514 和 D1S2783 1p351-p363进行检测结果有 24 例857 发生 1pLOH而且缺失的区域 也多比较长其中最常发生缺失的区域是 D1S514 1p3613 19 号染色体的改变仅见于三种亚型的中枢神经系统肿瘤中其他的肿瘤中未发 现有 19 号染色体的异常意味着存在一种特殊的神经胶质细胞肿瘤抑制基 因关于 肿瘤抑制基因的探索是基于突变的分析在大部分的少突胶质细胞瘤中缺失累及 了所有已知的 19q 位点表明几乎全部染色体臂都缺失了这种现象说明 19q 的缺 失可能并不