[doc格式] 金黄色葡萄球菌所致肺部感染的耐药特点及其Panton—Valentine杀白细胞素基因的携带状况分析

[doc格式] 金黄色葡萄球菌所致肺部感染的耐药特点及其Panton—Valentine杀白细胞素基因的携带状况 金黄色葡萄球菌所致肺部感染的耐药特点及其Panton—Valentine杀白细胞素基因的 携带状况分析 中国微生态学杂志2008年2月第20卷第l期 文章编号:1005—376X(2008)O1-0051-03【论着】 金黄色葡萄球菌所致肺部感染的耐药特点及其Panton—Valentine杀白细胞 素基因的携带状况分析 张雪青,陈增强,黄金伟,余方友 (1.温州医学院第一附属医院,浙江温州325000;2.丽水市中心医院,浙江丽水323000) 【摘要】目的分析金黄色葡萄球菌所致肺部感染的耐药性特点及其Panton—Valentine杀白细胞素基因的携 带状况.回顾性调查了温州医学院第一附属医院2005年1月至2006年1月医院感染的金黄色葡萄球菌所 致肺部感染患者132例,对其体外药敏试验进行分析;并利用多重PCR检测其PVL基因,应用多位点基因序列分 型(multilocussequencetyping,MIST)技术对PVL基因阳性的菌株进行序列分型.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin?resistantStaphylococcusaureus,MRSA)的SCCmec基因分 型采用多重聚合酶链反应.结果致肺部感染 的132株金黄色葡萄球菌的耐药现象较为严重,仅对万古霉素,呋喃 妥因及复方新诺明等药物的敏感率较高;其中 经多重PCR筛选出10株携带PVL基因的金葡菌,全部为MRSA菌 株,3株为ST239一SCCm,2株为ST398一SCCmec m,2株为ST398一SCCmecIV,ST25一SCCmecm,ST59一SCCmecI 和ST88.SCCmecm各1株.结论肺部感染的金黄色 葡萄球菌对多种抗生素耐药,呈多重耐药性;其携带PVL基因占一定 比例. 【关键词】金黄色葡萄球菌;肺部感染;耐药I生;Panton—Valentine杀白细胞素基因;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 【中图分类号】R378.99【文献标识码】A Studyondrug—resistanceoflunginfectioncausedbyStaphy,lococcusaureu sandits carryingPanton—Valentineleukocidingenes ZHANGXue—qing,CHENZeng—qiang,HUANGJin—wei,YUFang—y ou (1.TheFirstAffiliatedHo~itdofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou32500 0,China;2.TheCentralHospitalofLishuiCity, L~hui323000,China) 【Abstract】 0bjectiveToanalyzethedrug—resistanceoflunginfectioncausedbyStaphyloc occusaureusandits cawingPanton—Valentineleukocidingenes.MethodsThedrugsensitivityresultsof132caseswithlunginfectionby StaphylococcusalzFeusfromJanuary2005toJanuary2006wereinvestigatedretrospectiveinlocalhospita1.Staph),lococcus aureuscarryingPanton—Valentineleukocidin(PVL)genesweredeterminedbymultiplexPCR.Multilocussequencetyping (MIST)wasusedtodeterminetheSTsoftheisolates.ThegenotypesofSCCmecwerealsodeterminedbyanothermultiplex PCRintheisolatesofmethicillin—resistantStaphflococcusaltFeus(MRSA) .ResultsThedrug—resistanceof132strains Staphylococcusaltreuswasserious.Theantibioticdrugswhichhadhighersusceptibilityratiowerevancomycin,nitrofurantoin andtfimeth?sulfaeta1.10strainsStaph)lococcusaltreuscarryingPanton—V alentineleukocidingeneswereallmethicillin—re— sistantStaphylococcusaureus(MRSA),3isolatesofST239一 SCCm,2isolatesofST398一SCCmecm,2isolatesofST398一SCC— neeIV.1isolateofST25一 SCCmecm.1isolateofST59.SCCmecIand1isolateofST88一 SCCmec.ConclusionStaphylo. COCCusaureuscausinglunginfectionsweremulti--drugresistanttomanykindsofantibioticsanditscawingPanton--Valentine leukocidingeneshadcertainratio. 【Keywords】 ValentiStaphylococcusalzFeus;Lunginfection;Drug—resistance;Panton—neleukocidingenes;Methicil— lin—resistantStaphylococcusaureus 本文回顾性了在温州医学院第一附属医院 2005年1月至2006年1月金黄色葡萄球菌所致肺部 感染的病例,对其体外药敏试验和Panton—Valentine 杀白细胞素基因的携带状况进行分析,现报道如下. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1患者资料该院2005年1月到2006年1月 的由金黄色葡萄球菌致肺部感染的132例患者,其中 男性105例,女性27例,平均年龄58.3岁. 1.1.2菌株来源(1)临床菌株:132例患者的痰液 标本检出金黄色葡萄球菌132株,其中MRSA96株, MSSA36株.经多重PCR筛选出10株携带PVL基 【收稿日期】2007-07-07 【基金项目】温州巾科技讣划金资助项目(NO.20060277) 因的金葡菌,均为MRSA.(2)质控菌株:金黄色葡萄 球菌ATCC25923,MRSANCTC0442(SCCmecI), MRSAN315(SCCmecII),MRSA85/2082(SCCmecIII) 和MRSAJCSC4744(SCCmecIV)(由日本JUTENDO 大学医学院微生物系LTO教授惠赠). 1.1.3仪器VITEK—AMS全自动微生物分析仪(法 国生物梅里埃公司产品),PCR仪(Epedoff公司产 品),电泳仪(Bio—rad公司产品),凝胶成像仪(上海 天能公司产品). 1.1.4试剂菌种鉴定卡和药敏卡(法国生物梅里 埃公司产品).Taq酶,10x缓冲液,dNTP,MgC1,蛋 白酶K,溶葡萄球菌素(上海生工生物工程有限公 司). 1.1.5引物多重PCR同时检测PVL基因和MRSA 的引物参照文献[2]:葡萄球菌属特异性16SrRNA taphF5AACTCTGTTATTAGGGAAGAACA一3.Staph 52ChineseJournalofMira’oecology,February2008,Vo1.20No.t R5CCACCTFCCTCCGGq盯GFCACC一3:Luk—PVF5一 ATCATTAGCTAAAATGTCTCGACATGAI,CCA一3.Luk— PVR5.GCATCAAGTGTA1丫rGGATAGCAAAAGC.3. MecAR5.GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA.3. MecAR5CCAATFCCACATFGTTTCGGTCTAA-3; MLST的引物序列参照文献[3],详见1,多重PCR 检测SCCmec的引物参照文献[4]. 表17个管家基因的引物序列 Shikimate dehydrogenase(aroE) Glycerolkinase(#pg) Guanylatekinase(gmk) Phosphateacetyltransfera se(pta) Triosephosphate isomerase(tpi) Acetylcoenzyme Aacetv】trallsferasef,”aiL TTGArCACCAGCGCGTAIGTC AGGTATCTGCTTCAATCAGCG ATCGGAAATCCTAI1f?ACA眦 GGTGTTGTAT11AATAACGATATC CTAGGAACTGCAATCIAATCC TGGTAAAATCGCATGTCCAAIC ATCGTnTI’ATCGGGACCATC TCATlrAACTACAACGTAATCGTA GT11AAAATCGTAT下ACCTGAAGG GACCCT1IGTTGAAAAGCIAA TCGT11CAT11CTGAACGTCGTGAA I1f?CACCTTCTAACAATTGTAC CAGCATACAGGACACCTATrGGC CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC 1.2方法 1.2.1细菌分离与鉴定按常规方法分离细菌,血 浆凝固酶试验阳性,同时用金黄色葡萄球菌SPA单 克隆抗体检测为阳性,经全自动微生物分析仪鉴定为 金黄色葡萄球菌. 1.2.2药敏试验应用VITEK.AMS全自动微生物 分析仪专用药敏试验卡GPS一110对金黄色葡萄球菌 进行药敏测定,严格按照仪器操作说明进行,同时用 金黄色葡萄球菌ATCC25923进行室内质量控制. 1.2.3DNA模板的提取吸取250IDNA裂解液, 挑取血平板过夜培养的金黄色葡萄球菌菌落2,3 个,加入裂解液中,混匀后,再加入溶葡萄球菌素(2O , 30U/m1)和溶菌酶(0.3L),37?作用1h,加热 煮沸15min,以15000r/min的速度在低温高速离心 机中离心5min,将上清液转移到一干净的无菌微量 离心管中,即为细菌总DNA溶液,一2O?保存备用. 1.2.4多重PCR同时检测MRSA和PVL反应条 件参照文献[2]进行,只有756bp1个条带的为 MSSA,同时出现756和433bp2个条带为含PVI基 因的MSSA,同时出现756,433和310bp3个条带为 含PVL基因的MRSA,同时出现756和3lObp2个条 带为不含PVL的MRSA. 1.2.5MLST分型按照文献[3]进行,选择金黄色 葡萄球菌7个管家基因,即氨基甲酸激酶基因(Car— bamatekinase,arcC),莽草酸脱氢酶基因(Shikimate dehydrogenase,aroE),甘油激酶基因(G1)cerolkinase, dp),鸟嘌呤核苷酸激酶基因(Guanylatekinase, gmk),磷酸转乙酰酶基因(Phosphateacet)ltransferase, pta),磷酸丙糖异构酶基因(Triosephosphateisomer— ase,tpi)和乙酰辅酶A乙酰转移酶基因(Acet)’leCO— enzymeAacetyItransferase,)_q).按照文献[3]分别 合成7对引物(详见表1),各条引物的产物长度为 450,500bp.采用普通PCR分别刈71,管家基因进 行扩增,扩增条件按照文献[3J进行.PCR扩增产物 原液送_J二海生:[生物技术服务公司进行纯化后,用 ABIPRISM3771)NA测序仪进行洲序.每侏细菌的 7个管家基因的序列测序完毕后,利用MIST的数据 网站(www.mist.net)进行分析,先参照网站提供的金 黄色葡萄球菌的每个管家基因的序列及长度,对 每株细菌的每个管家基因进行首,尾剪切,使每个所 测管家基因的长度与标准长度相同,把每个管家基因 剪切后的DNA序列输入金黄色葡萄球菌的MIST的 数据库进行基因等位点的分析,得出每个管家基因的 等位点的序号,最后把每株细菌的7个管家基因的等 位点的序号输人数据库进行序列型的分析,最后得出 每株细菌的序列型. 1.2.6多重PCR检测SCCmec按照文献[4]进行. 2结果 2.1132株金黄色葡萄球菌的药敏试验显示,万古 霉素的敏感率最高,为99.2%(131/132),呋喃妥因, 复方新诺明也有较好抗菌性,敏感率分别为97.O% (128/132),75.O%(99/132),其余药物敏感率较低, 见表2 表2132株金黄色葡萄球菌对13种抗生素的药敏结果 2.210例检出携带PVL基因的金黄色葡萄球菌的 患者分布在7个科室,ICU3例,EICU2例,血液科 1例,神经内科1例,神经外科1例,呼吸科1例,移 植利l例 2.310株携带PVL基因的金黄色葡萄球菌的MLST 序列彳丁5种,洋见表3. p 卟一一一一一一一一 中国微生态学杂志2008年2月第20卷第1期53 表310株金黄色葡萄球菌的序列型 2.4多重PCR检1}=贝0SCCmec的结果,根据文献[4] SCCmecI株出现162,342和495bp3条带,SCCmec ?株出现162,209,284和381bp4条带,SCCmecIII 株出现162,209,243,303和414bp5条带,SCCmec ?株出现162和342bp2条带.SCCmecIA与SCC— mecI的区别在于SCCmecIA多381bp条带,SCC— mecIIIA与SCCmecIII的区别在于少了303bp的条 带,SCCmecIIIB除了少了303bp条带外,还少了401 bp条带.4株4种SCCmec型的阳性质控菌株清晰 地区别开来,见图1.10株携带PVL基因的金黄色葡 萄球菌均为MRSA,其SCCmec型分别为3株ST239一 SCCIII,2株S98.SCCmecm,2株S98.SCCmec ?,ST25一SCCmecm,ST59一SCCmecI和S8一SCCmec ?各1株. M:参考标准;标准株,临床分离株结果:I,4分别为NCTC10442( SCCmecI),N3l5(SCCmecII),M85/2082(SCCmecm)和JCSC 4744(SCCmec?);5为SCCmecII;6为SCCmec?;7为SCCmecm; 8为SCCmecmA 图1多重PCR检测SCCmec电泳图 3讨论 金黄色葡萄球菌是临床分离的最常见的细菌之 一 ,由于可产生多种毒素,其致病性较强,临床上导致 肺部感染的病例较多,其感染情况日益严峻.特别是 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株检出的不断增多,甚至 引起医院感染的暴发流行.MRSA由于获得了外源 性编码青霉素结合蛋白2a(penicillinbindingprotein 2a,PBP2a)的甲氧西林耐药决定子A(methicillinre. sistancedeterminantA,mecA),造成对所有B.内酰胺 类药物及酶复合剂药物耐药.本次调查发现引起肺 部感染的金葡菌对万古霉素,呋喃妥因和复方新诺明 的敏感率较高,临床可选择应用;其余l0种常用抗生 素均不能作为一线药.所以临床医生应尽早送检标 本进行细菌培养,根据药敏结果合理选择使用抗菌药 物,切不可凭经验滥用抗生素. Mec基因存在于葡萄球菌盒式染色体(Staphylo— coccalcassettechromosomemec,SCCmec)中,SCCmec 是一种新型的可移动元件,该元件还携带除mecA以 外的其他抗生素耐药基因,造成多重耐药J.近年 来,携带Panton—Valentine杀白细胞素(Panton—Valen— tineleukocidinPVL)基因的耐甲氧西林金黄色葡萄球 菌(methicillinIresistantStaph)’loeoceusallI’ellsMRSA) 在美国,欧洲,亚洲和非洲等国家有引起的严重感染 的报道,甚至在有些国家造成克隆株的播散,主要引 起化脓性感染和严重的肺部感染_1,引.本次调查研究 从临床分离的携带PVL基因的金葡菌均为医院获得 性,与我们选取的菌株来源有关;从菌株分离的科室 可以看出携带PVL基因的金葡菌存在于我院较多的 科室,分布较广泛,对其可能造成的医院感染应引起 足够的重视. MLST技术是一种用于细菌临床分离株基因分型 的高分辩率的DNA序列分型方法,它的基本原理是 选择细菌7个管家基因约450,500bp的片段进行分 析,每个基因片段不同的序列被认定为不同的等位基 因点,每个管家基因就有多个等位基因点,每株细菌 都可通过7个管家基因的不同等位基因点进行序列 分型.由于7个管家基因都有很多不同的等位基因 点且管家基因的基因序列发生变异的速度非常缓慢, 不同来源的菌株不太可能有机会具有同一类型的序 列型,只有那些来自同一克隆株的菌株问才有可能具 有同一基因序列型.所以,可以把具有同一序列型的 菌株认定为来自同一克隆株,可用于研究流行株的起 源,不同菌株间的关系及发现医院感染的发生等J. 通过MLST进行的菌株的序列型可以在不同的实验 室之间进行比较,且结果非常稳定和客观,克服了 PFGE判断结果的主观性.特别是MLST的结果可以 通过Intemet(已建立MLST数据库网站,网址为 WWW.mlst.OX.ac.uk)与全世界不同的研究所得结果 进行比较,以探明本地区流行株与世界流行株和地区 流行株之间的关系.本研究利用MLST技术对10株 携带PVL基因的金黄色葡萄球菌进行序列型分析, 共发现5种序列型. 综上所述,金黄色葡萄球菌所致的肺部感染对抗 生素的耐药情况相当严重;携带PVL基因的金葡菌 也占了一定的比例,对此应引起临床足够的重视.同 时我们必须加强医院病房内的环境监测,防止同一克 隆株的播散. }?4 5加44 22 4 43 5地4加 3 423 98 ? 一一一一,一一,,,一一一一一,,,一一一一,一,一,一 一,,,弧 参一一 『lr【r【