反刍动物营养蛋白部分(1)

反刍动物营养蛋白部分(1) 反刍动物营养学参考文献 冯仰廉等,1995,实用肉牛学(第四版),科学出版社。 冯仰廉等,2000,奶牛营养需要和饲养,中国农业大学出版社。 冯仰廉,2000,肉牛营养需要和饲养标准,中国农业大学出版社。 韩正康,陈杰,1988,反刍动物瘤胃的消化和代谢,科学出版社。 刘敏雄,1991,反刍动物消化生理学,北京农业大学出版社。 卢德勋等,1991,现代反刍动物营养研究方法和技术,农业出版社。 望丕县等译,1991,饲料学,北京农业大学出版社。 杨凤,1993,动物营养学,农业出版社。 周建民，张晓明等译,1992,反刍动物营养学,中国农业科技出版社。 Agricultural and Food Research Council (AFRC). 1992. Report No.9. Nutritive requirements of ruminant animal: Protein. C. A. B. International. Hungate, R. E. 1966. The rumen and its microbes. Academic Press, NY. National Research Council. 1996. Nutrient requirements of beet cattle, sixth Revised Ed. Washington, DC National Academy Press. National Research Council. 1989. Nutrient requirements of Dairy cattle, Ed. Washington, DC National Academy Press. Macrae, J. C., 1975. Digestion and metabolism in the ruminant. Armideli, Nsw. Vniv. of New England. Orskov, E.R.,1992，Protein Nutrition in Ruminants. Second Edition，Academic Press,London Blaxter,K.L.,1967.The Energy Metabolism of Ruminants 2nd ed. Huntchison,London. Fahey,G.C,1994.forage quality,evaluation and utilization.Am. Soc Agron., Madison,WI Van Soest P.J.,1982. Nutritional ecology of ruminant. O and B Books,Inc.,Corvallis,OR. 瘤胃微生物发酵与其它发酵的比较 项目 瘤胃的发酵(饲料) 优质青贮发酵 酿造发酵 pH值 6.0-7.0 3.8-4.0 4.5-5.6 微生物种类 很多 很少,乳酸菌 酵母 微生物蛋白质合成 很多 很少 很少 可利用的纤维素的消化 90% 0 很少 发酵的终产物 乙、丙、丁酸, 乳酸 乙醇 CO2 ,CH4 CO2 少量不挥发性酸(0.4g/100ml) 发酵的状态 动态 静态 静态 瘤胃微生物 细菌 原虫(纤毛虫、鞭毛虫) 厌氧真菌 细菌 1010(10×1010 个/毫升瘤胃液 200多种或系 纤毛虫2×105 ( 200×105个/毫升瘤胃液 计6个属 厌氧真菌 已发现3个属4种 能分泌纤维素酶 纤毛虫与细菌占微生物的总体积相当 瘤胃细菌在瘤胃中的分布 (1) 瘤胃液细菌 游离状，随瘤胃液外流进入皱胃 (2) 附着于饲料颗粒的细菌 避免外流，消化饲料颗粒 (3) 附着于瘤胃壁上皮的细菌 兼性厌氧 10-14%是尿酶产生菌 单乳糖甘油酯 甘油,乳糖 VFA 二乳糖甘油酯 脂肪酸 棕榈酸,硬脂酸 三酰基甘油酯 H2 磷酯 微生物脂肪 瘤胃内脂肪的消化 估计的瘤胃发酵特征 底物 日粮 碳水化合物转化产物的比例 乙酸 丙酸 丁酸 戊酸 可溶性碳水化合物 粗饲料 0.69 0.20 0.10 0.00 (包括有机物和果胶) 精饲料 0.45 0.21 0.30 0.04 淀 粉 粗饲料 0.59 0.14 0.20 0.06 精饲料 0.40 0.30 0.20 0.10 半 纤 维 素 粗饲料 0.57 0.18 0.21 0.05 精饲料 0.56 0.26 0.11 0.07 纤 维 素 粗饲料 0.66 0.09 0.23 0.03 精饲料 0.79 0.06 0.06 0.09 MurpHy et al.,1982 瘤胃内微生物生存环境 瘤胃内环境 反刍动物主要靠瘤胃微生物来消化,消化的终产物与单胃动物不同 容积大 :能采食大量的饲料,包括精料和粗料,瘤胃在贮存饲料的同时, 也大量贮存水分 大量的微生物: 瘤胃相当于一个活体的发酵罐,将饲料的能量和 蛋白质转化为微生物蛋白和VFA; 终产物: 微生物发酵饲料的终产物是VFA,CO2,CH4,NH3 唾液: 瘤胃液被胃壁吸收后,以唾液的形式分泌到瘤胃中, 补充瘤胃液的损失,同时唾液的pH值为8~9, 可以中和瘤胃的酸环境,起缓冲作用, 此外唾液也含有营养物质如尿素的再循环 瘤胃物的性质: 动物采食、反刍、饮水, 食物和水分相为稳定进入瘤胃, 供给微生物所需的水分和营养物质,瘤胃内容物含干物质10~15%, 食糜在瘤胃的分层见图. 瘤胃的pH值: 变动范围5.0~7.5,pH值若低于6.5就不利于纤维素的消化, pH值呈规律性变化,取决于日粮的类型和采食的时间, NH3的浓度: 氨氮的含量变动较大,浓度一般为10~50毫克/100毫升, 饲喂后1~1.5小时达到峰值,大体上反映饲料的含氮量及 饲料蛋白质的可溶性和降解特性. 渗透压: 瘤胃内的渗透压比较稳定,接近血浆水平,牛的瘤胃内的 渗透压为250~380毫渗透摩尔/千克,瘤胃中的NH3, VFA是通过渗透作用而吸收,如采食后VFA量增加,渗透压增加, VFA进入血液中. 缓冲力: 瘤胃本身有调节酸碱平衡的能力,HCO3-/H2CO3,HPO42-/H2PO4-, 前者调节能力较强瘤胃缓冲能力与饲料,唾液和瘤胃壁的分泌 相关,并受pH值,CO2分压和VFA,NH3浓度的影响. 温度: 39~40? 比重 1.022~1.055 饲料蛋白质降解率的评定 饲料蛋白质在瘤胃的降解率是小肠蛋白质营养新体系的基本参数 1 体内法: 到达真胃或小肠的非降解饲料蛋白质=总非氨态氮-微生物氮-内源氮 饲料蛋白质降解率=(进食氮-非降解氮)/进食氮 (1)微生物蛋白质的估测 (2)食糜的收集 全收集:用十二指肠过桥瘘管采集,在十二指肠前端装一过桥瘘管, 收集前端的食糜 点采样:在真胃或十二指肠前端装一单瘘管(也称,瘘管),连续24或 48小时每隔2或3小时采样(叫定点采样).每天食糜总量通 过使用食糜流量标记物来计算. 食糜标记物:食糜有两种形态,液态和固态(或颗粒态),标记物有两种 液态标记物:聚乙二醇(4000,PEG) Cr-EDTA 固态标记物:Cr2O3,Cr-标记饲料,稀土元素 单标记物技术:Cr2O3 双标记物技术:Cr2O3+PEG 单个饲料蛋白质降解率的测定用差异法: 先测定基础日粮非降解蛋白质,被测饲料加到基础日粮组成 被测日粮,测定被测日粮的非降解蛋白质, 某一饲料蛋白质降解率 =(被测非降解蛋白质-基础非降解蛋白质)/被测饲料蛋白进食 2 瘤胃尼龙袋技术 (1) 计算方法 尼龙袋中不同时间点(t)的蛋白质或养分的消失率(dP)符 合数学模型 dP=a+b(1-e-ct) (Orskov & McDonald 1979) t=0, dP=a 快速降解部分 t??, dP=a+b 被降解部分 b 最终降解部分,即潜在降解,且以常数c降解 降解率(P)=a+bc/(c+k) k是被测饲料离开瘤胃的外流速度 测定饲料的瘤胃外流速度的方法: 用Cr-标记饲料方法,Cr-标记饲料在瘤胃几乎不降解,在小肠也不消化. 多采用粪便中Cr的浓度变化可以确定外流速度. 影响饲料外流速度的因素:主要受日粮的结构和饲喂水平的影响, 其中最重要的是基础日粮的精粗比例.相同饲养水平, 如粗料比例大,外流速度则快 (2)尼龙袋技术: 袋孔的大小:35~50μm, 样品量: 精料40mgDM/cm2, 粗料20 mgDM/cm2 样品颗粒大小: 细度是通过2.5mm的筛孔 在瘤胃中的位置: 瘤胃中囊(部) 洗袋:手洗或洗衣机,水变澄清 袋中残留微生物群体,粗料影响较大 估测消失率数据的误差:动物之间,同一动物天之间,放袋时间之间,袋之间 动物的基础日粮:主要影响饲料的外流速度,我国推荐的尼龙袋方法 的基础日粮精粗比为1:1,日粮蛋白质水平>13%,饲养水平为1.3倍 的维持需要,日饲喂两次 动物种类:绵羊与牛相比,羊的降解率较高 3. 溶解度法 4. 短期人工瘤胃法 5. 长期人工瘤胃持续模拟技术 6. 酶解法 瘤胃微生物蛋白质合成 瘤胃微生物蛋白质合成取决于瘤胃的可利物能量和氨的来源。 氮源充足时，瘤胃微生物的合成量与瘤胃现消化有机物(FOM)有关， 微生物对能量利用效率的平均值近27,32克微生物氮/克FOM， 变异很大，主要受日粮影响。 对于瘤胃中饲料降解氨的利用效率则报道不多， 但各国新的蛋白质营养评定体系基本都使用相似的参数0.8,1.0 饲料氮进入瘤胃后，大部分为瘤胃微生物降解成氨基酸,肽,氨， 绝大部分为微生物利用，当降解氮和可利用能量平衡时， 则利用效率较高。否则氮和能量利用率较低。 影响瘤胃的微生物合成蛋白质的效率的因素: 1 流速 流速是指从瘤胃或人工瘤胃中每小时外流液体的比例。 处流速度(或流速)用Cr-EDTA或PEG测定，范围是0.03~0.15。可以人为 地增加到约0.2。进食水平和日粮中粗纤维的比例能明显影响外流速度。 2 日粮氮水平 氨是微生物合成蛋白质的主要前体,当基础日粮缺乏氨时， 瘤胃注入尿素或饲喂尿素可以增加微生物蛋白质合成产量。 但当基础日粮中瘤胃可降解氮水平较高时，尿素加入的作用很小或无效 3 能量来源:提供快和慢发酵的碳水化合物的混合物对微生物生长是有利的影响。 4 粗料与精料的比例，在70%精料水平时得到最大的细菌蛋白质合成产量。 5 进食水平 增加饲料进食量将提高瘤胃微生物氨产生量。 6 饲喂频率 日粮饲喂频率对微生物产生的效率研究不多。 7 青贮饲料的保护剂 使用饲料青贮的保护剂影响研究较少。 8 蛋白质来源的影响，这方面研究大多数是以尿素作对比，通过加入蛋白质 饲料代替纯尿素，瘤胃微生物蛋白质合成产量明显提高。 1 微生物蛋白质产生的表示 微生物发酵产生的ATP与其生长之间直接相关，可用Y(ATP)表示, Y(ATP)的概念:每摩尔来于发酵产生的ATP所产生的微生物干物质的克数 Y(ATP)的值是变异的，因不同种属和不同生长条件而变化。 由于体内Y(ATP)难以测定,所以微生物产量通常用瘤胃表现可发酵有机物质 或真消化有机物质(即瘤胃有机物质的消失加上微生物合成的有机)。 微生物蛋白质产量通常用微生物粗蛋白质/每克在瘤胃表观或 真消化有机物(FOM或TDOM)， 或微生物蛋白质克数/千克FOM或TDOM表示 2、瘤胃微生物的分离 目的是得到一个代表离开瘤胃微生物的瘤胃微生物样品， 样品应包括附着在将要离开瘤胃的饲料颗粒上和游离于瘤胃液的微生物。 3、测定瘤胃微生物蛋白质合成的方 (1) 纯化蛋白质日粮的使用 (2) 应用微生物标记测定微生物蛋白质的合成 二氨基庚二酸(DAPA)是细菌细胞壁的组分。 RNA1965年首先使用RNA作为微生物蛋白质全成的标记物， 嘌呤碱基法(PB法) (3)尿中嘌呤衍生物 (4)同位素示踪技术的应用 同位素的使用目的是区分微生物蛋白质 和日粮蛋白质,常用的同位素是放射性同位素和稳定同位素 15N,32P,35S 日粮对瘤胃干物质含量的影响 牛 羊 干草 青贮 自由采食 自由采食 维持 自由采食 维持 苜蓿 禾本科 进食的DM量 20.6 12.4 17.0 11.5 32.5 17.5 瘤胃DM/kgW 21.6 16.8 17.6 15.6 19.2 17.7 瘤胃DM% 12.5 11.1 11.8 11.1 14.8 12.9 瘤胃不同部位的DM% 采样时间 瘤胃背囊 瘤胃腹囊 网胃 2 13.7 3.7 3.9 4.5 13.8 3.8 4.3 7.5 13.3 3.8 4.8 瘤胃微生物的体积与数量 平均数量(个/ml) 平均细胞体积(μ3) 小细菌 1.6×1010 1 新月单胞菌 1.0×109 30 鞭毛虫 1.0×106 250 纤毛虫 内毛虫 3.0×105 1.0×104 双毛虫 3.0×104 1.0×105 前毛虫 1.1×104 1.0×106 瘤胃微生物是一个反应链,各个微生物之间可以存在相互协同作用, 单个分离的细菌不能代表瘤胃环境 瘤胃微生物的种类 ,、细菌 纤维分解菌: 纤维素分解菌,产生纤维素酶 琥珀酸拟杆菌, 黄化瘤胃球菌,白色瘤胃球菌,溶纤维乳杆菌 特性:细菌的变异性,随日粮不同而不同,纤维含量低则数量少 受PH的影响,PH低抑制它的活性。 与饲料类型相关,如喂大麦,即使PH达到6,纤维分解菌活性仍较低 半纤维素分解菌:能水解纤维素的细菌常能利用半纤维素,• 但利用半纤维素的细菌不能利用纤维素 溶纤维丁酸弧菌,居瘤胃拟杆菌 淀粉分解菌:许多纤维分解菌都有分解淀粉的能力,但有些淀粉 分解菌缺乏纤维素分解能力。 嗜淀粉拟杆菌,解淀粉琥珀酸单胞菌,居瘤胃拟杆菌 反刍(兽)新月单胞菌,乳酸分解新月单胞菌,牛链球菌 淀粉分解菌在PH值低时活性高,在PH值高时活性下降 利用酸菌:能利用乳酸,所以正常瘤胃内乳酸不多,有些细菌能利用 琥珀酸,苹果酸,延胡索酸，还有些细菌能利用甲酸、乙酸 蛋白质分解菌:大多数属兼性菌,单一分解蛋白质的细菌不多,蛋白质 分解菌的酶与胰蛋白酶活性相似。大多数蛋白质分解菌没有脲酶的活性,但附着在 瘤胃壁上的细菌具有分解尿素的能力,脲酶活性高 ,、真菌:瘤胃中属厌氧真菌, 孢子从孢子囊中释放出来,在接种到饲料 碎片上并寄生,通过真菌根的形式来撕裂纤维素,利于纤维分解菌的作用 ,、纤毛虫 作用 主要消化可溶性的碳水化合物和淀粉,纤毛虫不分泌脲酶 防止瘤胃PH过低 与瘤胃争夺淀粉及可溶性糖,当纤毛虫含量高时,细菌低, 纤维素含量高时纤毛虫数量低 用药物可控制瘤胃的纤毛虫数量,除去原虫动物 瘤胃微生物生态系统 一定饲养和比较稳定内环境,微生物区系相对稳定, 微生物与动物,纤毛虫与细菌之间达到动态平衡, 三者构成瘤胃微生物的生态平衡,外来微生物不易繁殖 1 纤毛虫之间 :拮抗,相互捕食; 种属之间， 协同 2 细菌之间 依赖作用,即某一些细菌的终产物为另一些细菌的底物 如， 琥珀酸拟杆菌与新月单胞菌的关系 纤维素+CO2 琥珀酸拟杆菌 纤维素碎片 琥珀酸 新月单胞菌 乙酸 丙酸 ， ， 甲酸 乙酸 ， CO2 细菌之间的协作作用 协同作用, 如 对植物细胞壁的降解 3 细菌与纤毛虫之间 A 两种微生物对养分的竞争,瘤胃中纤毛虫数量多时,细菌量降低 尤其养分不足的情况下更明显 当动物去纤毛虫时,细菌数量增加,不影响动物的健康 接种纤毛虫后,细菌数量减少 B 纤毛虫吞噬细菌的量很大,细菌在纤毛虫中消化,产生的肽,NH3, 细菌和纤毛虫均可利用 C 对饲料消化的互补 去原虫,细菌对纤维素消化降低, 如 纯纤维分解菌 对粗纤维的消化率 38.1% 纯纤毛虫 6.9% 细菌+纤毛虫 65% 细菌+灭活纤毛虫 65% 4. 瘤胃微生物与动物 瘤胃为微生物提供良好的生长繁殖的环境,动物采食的 饲料是微生物生存的条件, 饲料的纤维性物质被微生物消化代谢,饲料的养分被畜体充分利用 同时微生物本身也是动物的养分 动物采食日粮的改变,引起瘤胃微生物区系的改变, 一旦微生物失去平衡,会引起动物代谢的扰乱 微生物生长与养分 1 动态生长 瘤胃微生物蛋白质的理论产量 以奶牛为例 奶量,千克 微生物蛋白质,千克/日 占总蛋白的需要 % 维持 522 100 5 716 73 10 911 66 15 1105 62 20 1283 60 40 2077 55 瘤胃食糜不断后移, 包括两部分, 瘤胃微生物和饲料的未消化部分 如果微生物繁殖速度低于食糜的外流速度, 则瘤胃微生物量越来越少, 如果外流速度快,则微生物繁殖加速,如果微生物外流速度慢,则微生物繁殖慢. 外流速度表示法: 百分数/小时, 每小时瘤胃内容物排出量占总量之比 Y ATP,每摩尔ATP产生的微生物量 2 能量 反刍动物既要考虑到动物本身还要考虑到瘤胃微生物,一般情况下, 在氮源充足的条件下,微生物产量与能量给量之间是线性. 在氮源充足情况下,微生物合成蛋白质量为22-27克氮/千克FOM ATP必须在纯化培养的情况下才可测出,所以实际上不能用它, 只能用FOM,但可以根据崐发酵的终产物来推测和计算ATP. 3 氮 瘤胃微生物所需要的非NH3-N大约是25~50%,也就是至少满足 微生物需要AA占25% 不同种类微生物所需N源是不相同的,所以在实践中,当日粮中添加 大量NPN时,必须补充一定的饼粕类饲料,有可能NPN+AA,或 NPN+少量饼粕+AA,以达到最大的微生物蛋白质 尿素在瘤胃中很容易被脲酶分解,产生大量NH3,使瘤胃中NH3 浓度突然升高,(1)影响微生物活性,(2)NH3利用不充分,(3)吸收NH3 使血液NH3浓度升高,导致NH3(NH4+)中毒. 瘤胃[NH3]的临界线为50mg/L,瘤胃液 瘤胃[NH3]与微生物对氮利用效率的关系: NH3-N与MN/RDP之间存在负相关 瘤胃液的[NH3]很容易测定 尿素在瘤胃内释放NH3的速度很快,(1)饲喂方法,应采取多次饲喂, 如舔砖,(2)采取缓释技术,提高氮的利用效率,切勿溶于水中 反刍动物N( NPN) 的来源 名称 含氮量 蛋白质当量 尿素 46.7 292 乙酸铵 18 112 硫酸铵 18 112 氨基甲酸铵 36 225 乳酸铵 13 81 双缩脲 35 219 羟甲基脲 磷酸脲 饼粕类 糊化淀粉尿素(Starea)对瘤胃氨水平和菌体蛋白质合成的影响 4 矿物质和维生素 常量元素:Ca,P,Na,K,S 生长 微量元素:Mn,Mg,Cu,Co 对酶的活性 5 影响微生物生长的饲料饲养因素 纯化的碳水化合物对微生物产量的影响 进食OM,克/日 进食FOM,克/日 微生物N,克/日 碱处理秸秆 459 304 33 淀粉 582 457 24 蔗糖 457 432 23 Mart & Orskov,1979 瘤胃微生物的组成 1 组成 瘤胃微生物的组成 细菌 原虫 总成分 N 7.77 6.36 N*6.25 48.6 39.75 碳水化合物 15.52 38.1 脂类 10.1 9.1 灰分 16.85 6.45 N的组成 RNA-N 10.0 DNA-N 5.2 AA-N 82.5 瘤胃中微生物的成分相当稳定,不受饲料影响,饲料只能 影响微生物的产量,不影响微生物的成分 2 消化率 微生物蛋白质进入小肠后,被消化,其消化率平均为0.74~0.77 瘤胃细菌的表观消化率 试验 头数 测定数 消化率 1 4 8 78.2?0.11 2 5 10 77.6?0.10 3 4 8 77.6?0.08 4 5 10 77.6?0.09 平均 18 36 77.5?0.07 微生物蛋白质消化被吸收利用,其利用率为0.7 微生物蛋白质的净利用率=真蛋白%*消化率%*吸收利用率% 对产奶 =0.8*0.7*0.70=0.392 对生长 =0.8*0.7*0.65=0.364 对维持 =0.8*0.7*0.70=0.392 对妊娠 =0.8*0.7*0.60=0.336 非降解蛋白质的AA的比例为0.7~0.8,消化率0.7 反刍动物粗蛋白质(可消化粗蛋白质)体系的缺点 1. 评定表观消化率的误差 日粮的粗 小肠中蛋白质 粪中蛋白 表观消化率 蛋白水平% 占日粮的比例% 占日粮的比例% % 17 70 21 77 15 85 25 75 13 100 30 70 10 120 36 64 7 150 154 55 2. 该体系没有反映饲料蛋白质在瘤胃的降解特性(降解率) 既没考虑降解蛋白质和非降解蛋白质 3. 没有考虑饲料的氨基酸组成和微生物的氨基酸组成 4. 没有考虑瘤胃微生物对能量和降解蛋白质的需要 瘤胃的能氮平衡(E-N平衡) MCP=微生物蛋白质 =以瘤胃可利用能估测的MCP-以瘤胃降解蛋白质估测的MCP =能量的MCP效率×能量数量-降解蛋白质的MCP效率×降解蛋白质 尿素的有效用量(EAU)(Effective Allowance of Urea) =瘤胃的能氮平衡?(2.8×0.8) 第三章 反刍动物蛋白质营养 一、反刍动物蛋白质营养新体系 1现行粗蛋白质体系的缺陷 2各国的新蛋白质体系 70年代开始提出把粗蛋白体系改为小肠蛋白质体系 小肠蛋白质=微生物粗蛋白+非降解饲料蛋白质 小肠氨基酸=微生物氨基酸+非降解饲料氨基酸 降解率的评定,所有体系共同的基础是依赖饲料蛋白质降解率的评定, 常规方法主要有体内法,尼龙袋法,酶解法 瘤胃能氮平衡,考虑蛋白质和能量的配合和瘤胃微生物蛋白质的产量 3我国新蛋白质体系的原理和计算 小肠可消化(真)蛋白质 降解率的评定 尼龙袋法,酶解法 瘤胃能氮平衡 二、饲料蛋白质降解率的评定 1. 体内法 纯化日粮法 相差法 2. 瘤胃尼龙袋法 3. 体外法 溶解度法,短期人工瘤胃法,持续模拟人工瘤胃法,酶解法 三、蛋白质营养需要 1进入小肠的氨基酸 2蛋白质降解的保护 3蛋白质的需要量 小肠可消化真胃蛋白质和瘤胃能氮(E-N)平衡 微生物蛋白质产量，取决于瘤胃可利用能和氮的来源， 当氮充足时，与可利用能有关，27,32克微生物N/瘤胃发有机物(FOM) 40克MCP/NND 瘤胃能氮平衡=可利用能的微生物蛋白产量-降解蛋白质的微生物蛋白产量 =168×FOM,(MCP/RDP)×降解蛋白质 ==NND×40,(MCP/RDP)×降解蛋白质 其中，MCP/RDP是降解蛋白被微生物利用的效率， 与能量进食和降解蛋白质有关，一般为0.8,1.0,多取0.8. 尿素用量=瘤胃能氮平衡/(2.8×0.8) 微生物的氮基酸含量41个研究结果平均0.83，建设用0.8微生物的氯基酸的真消化率,12个研究结果平均为0.71，建设用0.7饲料非降解蛋白质的氨基酸量与原饲料的比例相似，但对粗饲料的研究较少, 非降解蛋白质的真消化率为0.7 饲养标准的新蛋白质体系 蛋白质新体系，自1972年以来已8个国家相发表了新体系 我国的蛋白质体系的建议: 1.饲料蛋白质降解率的评定，尼龙袋法,酶解法，体内法 2.瘤胃微生物蛋白质合成的估测,在氮源充足情况下,NND产生40克 3. MCP的MTP为0.8 4. MCP和UDP的为0.7 5. 吸收后AA的利用效率，MCP和UDP相同，维持为0.7,生长为0.65 蛋白质的需要和计算 新蛋白质体系蛋白质需要的计算是以产品的AA为基础,即净蛋白质。 在吸收的AA平衡的情况下吸收的利用效率最高。 维持需要主要根据内源氮损失的确立。国外研究相差较大,从98至311毫克N/千克W0.75,Orskov等(1981)认为是300,400毫克N/千克W0.75, 法国取311,英国取98, 根据国内所做的氮平衡试验结果推算以270毫克N/千克W0.75为合适, 这样根据以上的参数,600千克体重产奶30千克的奶牛的蛋白质需要 可以计算: 维持需要 270毫克N/千克W0.75×6.25×6000.75=205克 产奶的净蛋白质需要 30千克奶×3%=900克净蛋白 共需要净蛋白 205，900=1105(1110克 所需的能量为 13.73，30千克奶×0.93=41.63 NND 由能量估测的微生物蛋白质产量=进食NND×40 =41.63×40=1665.2克 合成1665.2克MCP需要的RDP=MCP/0.9=1850.3克 另10%的安全含量为2035克 由微生物提供的净蛋白质=1665.2×0.8×0.7×0.7=652.75(650克 还差1110,650=460克 相当非降解蛋白质为 460?(0.7×0.7)=938.7克 另10%的安全含量为1032.6克(1040克 , 瘤胃日粮可利用能和降解氮与微生物蛋白质合成量的关系 瘤胃微生物对日粮瘤胃降解氮(RDN)的利用效率，我们的研究发现，与瘤胃日粮降解氮和可利用能之比(RDNg/FOMkg、RDNg/DOMkg或RDNg/NND)呈对数回归关系: MNg/RDNg=3.4066-0.7368lnx,r=-0.9908,n=7 其中x为RDNg/FOMkg MNg/RDNg=3.2869-0.7368lnx,r=-0.9908,n=7 其中x为RDNg/DOMkg MNg/RDNg=2.3585-0.7368lnx,r=0.9908,n=7 其中x为RDNg/NND 根据瘤胃日粮降解氮和可利用能的不同比例，用作者的回归式计算的MNg/RDNg见表 表 瘤胃微生物对日粮降解氮的利用效率与瘤胃日粮降解氮和 可利用能之比的关系 RDNg/FOM 40 35 30 25 20 RDNg/kgDOM 34 30 25.5 21.25 17 RDNg/kgNND 9.65 8.51 7.23 6.03 4.82 MNg/RDNg 0.69 0.79 0.90 1.03 1.2 , 瘤胃日粮的能氮平衡(冯仰廉,1989) 饲养实践中，常由于瘤胃中可利用能或降解氮的量较高，故当单独用可利用能或降解氮去估测瘤胃微生物蛋白质合成量时，会发生两者所估测结果不一致，这是因为瘤胃中的能和氮的不平衡所致，因此提出了瘤胃能氮平衡的观点和应用方法: 瘤胃能氮平衡,用可利用能估测的MCP,用RDP估测的MCP 如能氮平衡的结果为零，则表明平衡良好;如为正值，则说明能量有多余，这时应增加RDP;如为负值，则表明应增加能量，使达到日粮的平衡，避免能量或降解氮的浪费。由于用对数回归式计算的MN/RDN对单个饲料是非加性的，故对单个饲料可用平均值先作初步评定: 瘤胃能氮平衡,用可利用能估测的MCP,用RDP估测的MCP ,FOM×168.9-RDP×0.9 或 ,DOM×144-RDP×0.9 或 ,NND×40-RDP×0.9 其中0.9为RDP转化为MCP的平均效率 因此每种饲料均有两个评定值，即NND.MCP和RDP.MCP，可同时列入饲料成分表中，以备配合平衡日粮之用。 由于非蛋白氮在瘤胃能氮为正平衡的条件下才能被瘤胃微生物有效地利用,根据以上能氮平衡原理,作者提出了尿素的有效用量(ESU, Effective Supplementation of urea)的计算模式: ,,,(克), 瘤胃能氮平衡?(2.8×0.8) 其中2.8为尿素的粗蛋白质当量,0.8为尿素氮被瘤胃微生物利用的合理效率。 例如，一个日粮的能氮平衡为，100克MCP,则: ,,,=100?44.6克=2.8×0.8 表明该日粮当添加44.6克尿素时比较合理。 如果瘤胃能氮平衡为负值，则饲喂尿素无效。 根据饲料蛋白质降解率和瘤胃微生物发酵的能氮平衡，即有效尿素用量等于 能量微生物蛋白产生量,降解蛋白转化微生物蛋白量 = ----------------------- 尿素含氮量(45%)×6.25×0.8 计算黑白花育成母牛的尿素有效可利用量。 表1 黑白花育成母牛实验组日粮的瘤胃能氮平衡 日粮组成 数量 奶牛能 粗蛋白 降解率 降解蛋 非降解 能 氮 平 衡 量单位 质数量 % 白RDP 蛋白质 NND×40 RDP×0.9 平衡 千克 NND (克) (克) (克) 豆 粕 0.069 0.184 31.1 54.62 17.0 14.1 7.38 15.30 -7.94 菜 籽 粕 0.133 0.310 45.0 46.19 20.8 24.2 12.40 18.72 -6.32 棉 籽 粕 0.138 0.324 48.4 37.89 18.4 30.0 12.96 16.56 -3.60 玉 米 1.295 3.108 106.2 47.29 50.2 56.0 124.32 45.18 +79.14 麸 皮 0.478 0.914 67.7 72.88 49.3 18.4 36.56 44.37 -7.81 大麦青贮 9.000 3.600 178.8 58.94 105.4 73.4 144.00 94.86 +48.14 干 草 2.000 2.760 123.6 51.56 63.7 59.9 110.40 57.33 +53.07 骨粉食盐 0.115 / / 硫 酸 钠 0.002 / / 合 计 11.200 600.8 324.8 276.0 448.00 292.32 +155.68 瘤胃能氮平衡=NND×40,RDP×0.9 尿素有效用量=瘤胃能氮平衡?(2.8×0.8)(克) 故日粮中加入尿素有效用量为(+155.68)?(2.8×0.8)=69.5克 表 2 黑白花育成母牛实验组和对照组日粮的精料配方 玉米 麸皮 豆饼 豆粕 菜籽饼 棉仁粕 尿素 骨粉 食盐 硫酸钠 实验组 56.3 23.8 / 3.0 6.0 5.8 3.0 3.0 2.0 0.1 对照组 59.5 21.2 15.0 / / / / 2.6 1.7 / 细菌蛋白酶与胃蛋白酶法评定饲料蛋白质降解率的研究 ,., 单一胃蛋白酶法与细菌蛋白酶法相关 2.2.1 精饲料、青干草类 单一胃蛋白酶法与细菌蛋白酶法结果比较(k=0.06) 饲料名称 cp% 胃蛋白酶(Y) 细菌蛋白酶(X) 农大豆粕 45.28 61.40 56.90 老芒麦 11.22 65.90 60.40 棉仁饼 34.62 58.80 56.70 胡麻饼 34.84 56.80 51.00 武库豆粕 44.73 72.30 65.70 青豆秸 8.64 55.00 51.40 谷 草 5.41 65.50 61.80 花生饼 45.31 76.60 79.90 苜 蓿 20.16 78.20 77.40 野大麦 23.11 73.60 70.20 鸭 茅 8.53 66.40 70.20 Y=17.4093+0.7682X n=11, r=0.9444. ,.,., 粗饲料: 表 单一胃蛋白酶法和细菌蛋白酶法对粗饲料 蛋白质降解率评定结果的比较(k=0.06) 饲料名称 cp% 胃蛋白酶法(X) 细菌蛋白酶法(Y) 氨化稻草 9.20 58.00 70.00 白薯秸 3.78 48.60 64.00 复合麦穗壳 8.31 53.10 67.40 花生秸 8.42 49.70 62.70 复合麦秸 6.68 68.80 78.20 氨化麦秸 6.48 63.60 73.80 羊 草 6.97 57.10 65.40 稻 草 3.33 58.50 67.10 麦 秸 5.42 63.20 73.00 复合稻草 6.07 48.50 64.00 Y=27.57958+0.6847X n=10 r=0.9422 单一胃蛋白酶分解法在不同时间点饲料蛋白质降解率及动态模型处理的结果 培养时间 苜蓿干草 红三叶草 豆腐渣 啤酒糟 高梁青贮 羊草 雀麦草 3 小时 78.30 72.22 65.50 49.56 64.96 43.71 58.54 7 小时 78.50 71.27 68.94 55.92 65.24 46.03 62.57 12小时 79.77 72.31 69.75 64.22 65.37 47.92 66.80 24小时 82.35 74.31 68.83 70.66 66.20 50.68 67.54 36小时 82.74 78.89 75.06 75.56 73.24 57.85 73.11 48小时 84.34 77.62 73.06 77.60 73.52 61.57 71.91 快速降解a 77.32 70.63 66.17 43.20 62.43 42.08 55.63 慢速降解b 09.84 22.06 11.83 35.91 37.54 57.89 17.49 b降解速率c .0253 .0093 .0238 .0649 .0075 .0084 .0529 RSD 00.44 01.35 01.96 00.93 01.81 01.11 01.37 有 K=0.02 82.81 77.66 72.60 70.66 72.70 59.23 69.54 效 K=0.04 81.13 74.81 70.58 65.42 68.38 52.15 66.76 降 K=0.06 80.24 73.61 69.53 61.86 66.62 49.21 64.97 解 K=0.08 79.68 72.94 68.88 59.29 65.66 47.60 63.71 率 K=0.10 79.30 72.52 68.45 57.34 65.06 46.58 62.79 尼龙 a值 47.03 31.03 47.36 5.53 37.74 17.44 25.31 袋法 降解率 77.47 80.08 84.40 46.02 66.28 40.24 65.07 ,.,人工瘤胃测定氨的释放速度: A、采取瘤胃液600ml, 并用双层纱布过滤, 以等量的人工唾液混合。 B、每个发酵罐(培养瓶, 瓶内为含氮量62.5mg的样品)倒入混合液200ml, 并置于39?恒温水浴振荡床中。 C、厌氧: 分别在每个发酵罐中通入CO2 5分钟,启动振荡器, 培养发酵。 D、分别在培养前及培养后1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,12小时取样定氨。 氨的测定, 测定被测样液氨的含量: 方法: 应用MgO直接蒸馏法, 即利用MgO水溶液的弱碱性与培养液的铵态氮 的作用, 在定氮蒸馏装置中, 通过蒸馏, 使铵离子交换成NH3而逸出, 再被硼酸吸收, 用标准酸进行滴定, 计算样品的NH3含量。 V*N*17(NH3分子量) NH3(mg/100ml)= -------------------- ×100 定氨的培养液量(ml) V:滴定所用HCl体积(ml)(扣除空白滴定), N:HCl浓度 尼龙袋法 , 实验动物及饲养管理:三头瘤胃瘘管牛，基础日粮CP(13%,精粗比为1:1。 动物每天饲喂2次，自由饮水。 , 被测样本的制备:样本在自然风干状态下通过2.5mm筛孔粉碎。 , 尼龙袋的规格:选择孔眼为53μm的尼龙布(上海产),制成长×宽为 8cm×12cm的尼龙袋。 , 放袋:准确称取4克精料(粗料2克)，放入一个尼龙袋内，每2个袋 夹在一根长约50cm的软性塑料管上，于上午饲喂后,小时放入瘤胃中。 , 放置时间:尼龙袋在瘤胃的停留时间为放袋后2,6,12,24,36,48小时 (粗料为6,12,24,36,48,72小时),即在每个时间点每头动物各取出一根管(2个袋)。 , 冲洗:取出袋后连同管一起用手洗，直至滤出水澄清为止。 , 测定残留物的蛋白质含量:将袋从管中取下置于65 ?烘箱内，烘至恒重 (约48小时)。原样的干物质测定也是在65?下烘干。将每头牛同一时间的 两个袋内残渣混合，取样测定其蛋白质含量。 , 蛋白质消失率的计算: 被测样本某一时间点的蛋白质消失率(,) 放入袋的总蛋白质,残渣的蛋白质 , ??????????????? 放入袋的总蛋白质 , 被测饲料蛋白质降解率的计算: 饲料蛋白质在瘤胃的降解规律符合数学模型dP=a+b(1-exp(-ct))， 其中dP是t时间的蛋白质降解率， a是快速降解部分， b是慢速降解部分， c是b的速降速率。 根据最小二乘法的原理，应用计算机将被测饲料的的a、b、c求得， 结合饲料在瘤胃的外流速度K用公式P=a+(bc)/c+K)计算该饲料的动态降解率。 瘤胃微生物蛋白质(MCP)合成与瘤胃的可利用能和降解蛋白质有高度相关， 当能量充足时，降解蛋白质(RDP)越少， RDP转化为MCP的效率越高。即降解蛋白与能量比 (即RDP/NND)与降解蛋白转化为微生物蛋白质的效率 (MCP/RDP)呈高度负相关。 MCPg/RDPg=2.3585-0.7368lnx,r=0.9908,n=7 其中x为RDPg/NND 不同RDP/NND与MCP/RDP的关系: RDP(g)/NND MCP/RDP RDP(g)/NND MCP/RDP 35 1.17 51 0.82 40 1.06 52 0.80 45 0.98 53 0.78 46 0.93 54 0.76 47 0.91 55 0.73 48 0.89 56 0.71 49 0.86 57 0.69 50 0.84 58 0.67 冯仰廉,1990 不同进食水平对母牛瘤胃MCP合成的关系 OM进食 日粮CP 进食FOM MCP (kg/日) (%) (kg/日) g/日 g/100gFOM 7.7 12.4 3.71 842 22.7 7.9 19.1 3.76 838 22.3 7.1 24.3 3.41 759 22.3 11.6 13.4 5.23 1206 23.1 11.5 19.1 5.17 1032 20.0 12.2 24.3 5.06 1201 23.7 Tamminga，et al. 1979。 饲料非降解蛋白瘤胃后段消化道消化率的评定 (1) 体内法 直接测定消化率 (2) 试验动物模拟法 Johson等(1944)首次用小鼠来预测 微生物蛋白质的消化率，UDP消化率的预测开始较晚. (3) 小尼龙袋法又叫运动尼龙袋法，最初用于猪消化率的测定(Satter 等,1981),Kirkpatrick和Kennelly(1984)首次将它用于生长母牛的 UDP肠消化率的测定。 将大约0.5g瘤胃未降解饲料残渣封闭在3.5×5.5cm 的小尼龙袋内， 经胃蛋白酶处理后，通过十二指肠瘘管以一定的速度塞入肠道， 从粪中收集小尼龙袋，分析小尼龙袋内蛋白质残留来计算蛋白质消化率。 (4) 体外法:胃蛋白酶,胰蛋白酶最早被人们用来测定猪的饲料消化率， 用于反刍动物UDP消化率的测定起步于八十年代, 酶解法可作为 反刍动物UDP消化率测定的常规方法的可行性。 胃蛋白酶,胰蛋白酶法评定饲料非降解蛋白瘤胃后段消化道消化率 材料与方法 , 缓冲液的配备: (1)胃蛋白酶缓冲液 pH=1.4， 0.05M，KCl-HCl (2) 胰蛋白酶缓冲液NaHCO3 98g Na2HPO4 93g NaCl 4.7g KCl 5.7g MgSO4.7H2O 1.2g CaCl2.2H2O 0.8g 加入蒸馏水使体积成10升，用0.2M的HCl调节pH=7.0 , 酶解法的步骤: (1) 称取0.5克UDP饲料残渣于酶解管中; (2) 称取适量的胃蛋白酶(50IU/0.5g)于酶解管中; (3) 加入30ml的胃蛋白酶缓冲液; (4) 中速振荡，待管中温度升至40?时开始计时; (5) 培养4小时后取出加蒸馏水静置15分钟; (6) 利用减压抽滤装置，用300目尼龙布抽去上清液， 用胰蛋白酶缓冲液冲洗尼龙布及管壁使残渣无损地保留在酶解管中， 同时使管内液体保持在30ml; (7) 称取适量的胰蛋白酶(25IU/0.5g)于酶解管中; (8) 中速振荡，待管中温度升至40?时开始计时; (9) 培养6小时后取出加蒸馏水静置15分钟; (10) 利用减压抽滤装置，用300目尼龙布抽去上清液， 将全部残渣移入滤纸中; (11)残渣连同滤纸一起定氮; (12)计算UDP的消化率(即DUDP) DUDP=1-(滤纸残渣中的蛋白质含量/UDP的蛋白质含量)。 表 不同酶解法测定UDP消化率的结果 胃蛋白酶+胰蛋白酶 单一胰蛋白酶 花生饼12* 92.54 94.64 棉仁饼12 75.15 79.89 豆粕1.12 92.04 95.34 豆粕2.12 93.98 92.26 胡麻饼12 78.68 84.89 鱼 粉12 76.25 89.70 菜籽饼12 75.71 84.62 芝麻饼12 57.30 68.79 12*表示在瘤胃降解12小时后的残渣 蛋白质保护 蛋白质保护的目的 近几十年来，反刍动物蛋白质代谢有了很大的发展，人们普遍认识到日粮蛋白质在瘤胃中存在不同程度的降解。虽然蛋白质降解的有部分产生AA可直接结合微生物蛋白质中，但相对于绝大部分AA连续降解为NH3 。如果用降解率高的饲料作为反刍动物饲料时，则大部分被分解为NH3 ，从而会极大地降低日粮中蛋白质的利用率。所以人们为了给生产力高的反刍动物提供足够的小肠可消化蛋白质，发挥其遗传潜力;同时使生产力低的反刍动物能利用较多NPN，降低生产成本，科研人员经过多次科学实验证明:能用蛋白保护法来实现这一目的，使更多的蛋白质在小肠消化吸收而长的在瘤胃消化，使瘤胃能更多地利用非蛋白氮。 1.2 目前蛋白质保护的研究状况 1.2.1 物理性加工处理保护法,主要关于牧草,颗粒料加工方面,一般采用日光干燥、鼓 风干燥、冰冻干燥以及热处理等,这样可以显著降低蛋白质溶解度,减少饲料中过瘤胃蛋白质消化. 1.2.2 化学处理保护蛋白质 这种保护法主要是利用保护剂与蛋白质分子间的反应在酸性环境中的可分解性。常用的保护剂有甲醛单宁、乙醇、戊二醛、乙二醛、氯化物、氢氧化物等，由于甲醛价格低廉、保护效果好，所以广泛被采用，用甲醛当调剂后可以提高家畜采食量、日增重、血浆中的,,浓度，以及粪氨排泄量，同时尚可降低瘤胃中,,,及血浆和尿液中尿等含量(扬诗兴,1977)。实验证明甲醛虽然在0.6g/100gCP时对生豆饼保护效果好，但仅是快速降解值A+B的变化并不大，而随着浓度的变化会发生过保护现象。 1.2.3 其他保护方法 (1)鲜猪血保护法，目前还有一种鲜猪血保护法，根据包被后样品的降解率和猪血的包被效率判断猪血水平为1.0L/KGDM时效果最好，这种保护法可以提高饲料营养价值，又可以利用屠宰副产品，同时不会发生过保护现象，但是这种方法只限于某些地区，况且费用大大提高(鲜血保藏、运输、加工等)，同时，长时间使用高温处理，势必影响其AA，特别是 LYS的利用率。 (2)包被保护 保护的原理是利用瘤胃pH=6左右和真胃pH=2左右的生理差别，选择在中性溶液中不分解而在酸性溶液中分解的材料包被饲料，从而使包被饲料在瘤胃中不能被消化而在真胃中被利用。 无论是那一种保护形式,都是为了降低饲料蛋白质在瘤胃内消化率.但是,以上所列举的各种保护剂各有各的缺点.因此,研究新型的无毒,高效,简便实用的蛋白质保护剂是很有必要的. 维持蛋白质需要: 评定方法:进食蛋白质为0，能量平衡，测定粪，尿氮， 用含氮日粮，外推至“0”蛋白质进食量时的尿氮排出量。 析因法 600kg 牛每天内源尿蛋白质的损失的不同结果 计算方法 内源N×0.25 效率 吸收AA Burrough,1975 0.88W^0.734 98 Chalupa,1978 0.938W^0.75 114 0.7 163 Kaufman,1977 110 1.00 110 NRC,1978 2.75 W^0.5 67 0.6 112 Dafaer,1979 0.75 W^0.73 80 1.00 80 ARC,1980 5.9206lg(W^-0.76) 61 0.75 81 Satter,1982 2.4W^0.75 291 1.00 91 Fox,1982 0.88 W^0.75 96 0.60 160 NRC,1985 2.75W^0.5 67 0.67 100 N平衡的实验综合评定: 法国1989，维持可消化真蛋白质=3.25W^0.75 (600kg牛为394g) 我国，北农大，维持可消化真蛋白质=2.41W^0.75 尿N，肌酐酸与尿N的相关 粪N:上皮脱落 ,粪总N,微生物N 600kg 牛的毛皮屑的蛋白质损失 来源 公式 g/日 效率 需吸收的AA g/日 NRC,1985 0.2W^0.6 9 0.67 13 ARC,1980 0.1125W^0.25 14 0.75 19 维持N,尿N，粪N，毛发皮屑N 主要是尿N，粪N，毛发皮屑N可以估计 生产需要: 奶蛋白质沉积和需要:ARC:1980，2.07，0.083F 牛乳蛋白质:=2.36+0.24×乳脂率(中国) 绵羊奶的蛋白质平均为7.66g/kg 妊娠:小肠可消化真蛋白用于牛妊娠的效率为 0.60 小肠可消化真蛋白用于羊妊娠的效率为 0.42 增重:小肠可消化蛋白质，用于体蛋白质沉积效率为0.60 (断奶~350kg) 哺乳期为0.7 400kg体重以后为0.5 增重的蛋白质沉积(g/日),?W(170.22-0.1721W+0.000178W^2)×(1.12-0.1258?W) 绵羊毛:成年羊 羊毛生长平均为总N的20, 生长羊 羊毛生长平均为总N的10, ARC，1980 羊毛蛋白质g/日,3+0.1×X(体蛋白质沉积g/日)