大肠杆菌转化实验(热击法)

大肠杆菌转化实验(热击法) 大肠杆菌转化可以:(1)将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制,增殖和表达,以获得目的基因;(2)验证大肠杆菌感受态细胞效果;(3)用于分子生物学其他研究。1原理: 质粒DNA粘附在细菌细胞表面,经过42°C短时间的热击处理,促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代,待质粒上所带的抗菌素基因表达,就可以在含抗菌素的培养基中生长。 2器材: 旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5ml 微量离心管,双面微量离心管架,干式恒温气浴(或恒温水浴锅),制冰机,恒温摇床,培养皿(已铺好固体LB-Amp),超净工作台,酒精灯,玻璃涂棒,恒温培养箱。 3材料和试剂: 质粒DNA,重组DNA,培养基(不加抗菌素),LB培养基(加抗菌素),无菌ddH2O, IPTG,X-gal。 4实验准备: 无菌ddH2O,1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌), 20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配)。 5操作步骤: (1)事先将恒温水浴的温度调到42℃。 (2)从-70℃超低温冰柜中取出一管(100μl)感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰上,冰浴5~10min。 (3)加入10μl连接产物(一般是全部连接产物)(DNA含量不超过100ng),轻轻震荡后放置冰上20min。 (4)轻轻摇匀后插入42℃水浴中90秒进行热休克,然后迅速放回冰中,静置3~5min。 (5)在超净工作台中向上述各管中分别加入900μl LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡30min到50min (6)在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl,分别滴到含合适抗菌素的固体LB 平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(注意:玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂)。 (7)如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话,滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal, 8μl 20% IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。 (8)在涂好的培养皿上做上标记,先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。 (9)在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面,写实验报告。 (10)观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。