【word】 中国人遗传性高铁血红蛋白血症患者中一个新的突变基因型的鉴定

【word】 中国人遗传性高铁血红蛋白血症患者中一个新的突变基因型的鉴定 中国人遗传性高铁血红蛋白血症患者中一 个新的突变基因型的鉴定 ? 830? 第20卷第8期 2007年8月 医学研究生 JournalofMedicalPostgraduates Vol-20No.8 Aug.2006 ? 论着? 中国人遗传性高铁血红蛋白血症患者中 一 个新的突变基因型的鉴定 郑德柱,兰风华,黄梁浒,谢飞,吴玉水,朱忠勇 (南京军区福州总医院解放军医学检验中心,福建福州350025) 摘要:目的:报道一例遗传性高铁血红蛋白血症患者还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素b5还原酶(b5R)基 因突变情况.方法:采用逆转录-聚合酶链反应产物直接测序法,分析 遗传性高铁血红蛋白血症患者b5R基因的 eDNA全部编码序列;PCR结合限制性内切酶(PvuI和4I)酶切,分析 患者和她的家庭成员b5R基因组DNA扩 增片段.结果:两个b5R等位基因中,一个存在M176T(ATCACG)突变, 另一个存在C203Y(TGC—TAC)突变, 其中M176T(ArACG)为新发现的b5R基因突变.结论:本研究鉴定的 M176T/C203Y复合杂合子突变是该 遗传性高铁血红蛋白血症患者的致病基础. 关键词:高铁血红蛋白血症;细胞色素b5还原酶;突变;杂合子 中图分类号:R556.7文献标识码:A文章编 号:1008-8199(2007)08-0830-03 AnovelmutationidentifiedinaChinesehereditaryme~emo#obinemiapatie nt ZHENGDe—zhu,LNFeng—hua,HUANGLiang—hu,XIEFei,WUYu—s hui,ZHUZhong—yong (P ,.4CenterforLaboratoryMedicine,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilit aryCommand,P,.4, Fuzhou350025,Fujian,China) Abstract:Objective:ToreportthemutationinNADH—cytochromeb5reduetasegeneobtainedfroma Chinesepatientwithhereditarymethemoglobinemia.Methods:Codingregi onsofbSRcDNAfromthe patientandnormalsubjectswereanalyzedbydirectsequencingoftheRT—P CRproducts.ThePCR amplifiedgenomicDNAfragmentsoftheb5Rgenefromthepatientandherfamilywerealsoanalyzed byrestrictenzymePvuIandAfaI.Results:AcompoundheterozygoteM176T(ATG—?.ACG)/C203Y (TGC—AC)wasfoundintheb5Rgeneofthepatient.Conclusion:Itisrevealedforthefirsttimethat thecompoundheterozygotemightcausehereditarymethemoglobinemiatypeI. Keywords:Methemoglobinemia;Cytochromeb5reduct~,e;Mutation;Heterozygote 0引言 遗传性高铁血红蛋白血症是一种常染色体隐性遗 传病,通常是患者的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸.细 胞色素b5还原酶(cytoehromeb5reductase,b5R)缺陷 所致.编码b5R的基因全长约31kb,有9个外显子和 8个内含子,定位于22号常染色体长臂.迄今为止,国 内外在患者中已发现26种不同的基因突变,其中包括 我科在中国患者中发现的3种突变类型(即R57Q, L72P和c203Y)D-5].最近,我们在福建省福鼎市的一 名遗传性高铁血红蛋白血症I型患者中发现了一种以 复合杂合子形式存在的基因突变,现报道如下. 收藕日期:2006-04-19;修订日期:2006-06.02 基金项目:南京军区”十一五”计划课题基金资助项目(批准号:06MA136) 作者简介:郑德柱(1964-),男,安徽全椒人,主管技师,医学本科,从事临床遗传学专业. 第8期郑德柱,等中国人遗传性高铁血红蛋白血症患者中一个新的突变基因型的鉴定?831? 1资料和方法 1.1临床资料患者女,23岁,福建省福鼎市人, 已婚育一女孩.父母非近亲婚配.该患者出生后数 月即发现颜面部发紫绀,尤以口唇为甚.23岁时, 因疑为心肺疾息住院检查,体检未见心肺和神经系 统异常.实验室检查:Hegesh改良法未检测出患者 红细胞的bSR酶活性[正常对照为(2.10土0.23) U],高铁血红蛋白含量占全部血红蛋白的16.2% (正常参考值<1%),其他实验室指标未见异常. 临床诊断为遗传性高铁血红蛋白血症I型. 1.2主要试剂和仪器DNA,RNA提取试剂盒为 QIAGEN公司产品.反转录试剂盒为Promage公司 产品.Taq酶,限制性核酸内切酶(?I,AfaI)和 DNA参照(100bpDNALadderMarker)为TaKaRa公 司产品.引物合成:所有引物均由上海生工公司合 成.PCR扩增仪为PE2400型,美国PE公司产品. DNA,RNA定量仪为Biophotometer,Oppendorf公司 产品.凝胶成像仪为Fluor?sMmuhilmager.系美国 Bio-Rad公司产品. 1.3方法 1.3.1bSR全长编码序列的RT-PCR扩增提取白 细胞总RNAeDNA第一链的合成:采用Promage公司 的反转录合成剂盒.PCR扩增b5ReDNA全部编码 序列为上游引物P1:5.GGGAA1-rCATG(AC. CCAGCTCAGCACG-3,下游引物P2:5’-GGGGATC. CCCTCAGACG-3.扩增条件:以逆转录合成的 eDNA(20)为模板,取P1/P2各60pmol,2.5mmoL/L dNTP8,10×PCR缓冲液1O,Taq酶2.5U,在100 反应体积中行PCR扩增.反应条件为94?45S, 60?45S,72?60S,共30个循环. 1.3.2PCR产物直接测序最终反应产物经 15g/L的琼脂糖凝胶电泳后纯化回收.回收后的 PCR产物由上海博亚公司按末端终止方法,在ABI 377全自动DNA测序仪上行正反向测序. 1.3.3b5R基因组DNA第6,7外显子的扩增采 用QIAGEN公司DNA提取试剂盒,提取患者及正常 人外周血白细胞基因组DNA.用引物扩增b5R第 6,7外显子,扩增长度为455bp.所用引物为上游引 物(F_A/7-F):5-CCGGGCCrI?ACCCCI’rc1?-3,引物序 列位于第6外显子5端内含子上;下游引物(E6/7.R): 5?G0四AAJG;CTGA帆CC-3,引物序列位于第7 外显子3端内含子上.扩增条件:以患者和正常人基 因组DNA20为模板,取E6/7.F及E6/7.R各60 pmol,2.5mmol/LdNTP8,10×PCR缓冲液1O,Taq 酶2.5u,在100反应体积中行PCR扩增.反应条件 为94?45S,65?45S,72?60S,共30个循环. 1.3.4bSR基因组DNA第7外显子的扩增设计 一 内引物(E7UP),引物序列为:5-GCGGCTCATGT- TAAGGGT.3,引物序列位于第7外显子5端内含 子上.用引物E7UP与E6/7.R行巢式PCR,扩增出 bSR第7外显子.扩增长度为314bp.PCR条件同 上,模板为第6,7外显子纯化回收后的产物1. 1.3.5b5R基因组DNA第6,7外显子酶切分析 扩增出的第6,7外显子,最终反应产物经2Og/L的 琼脂糖凝胶电泳后纯化回收,DNA定量后取1g, 用PvuI酶切,25g/L的琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像 后分析结果.扩增出的第7外显子的最终反应产物 经25g/L的琼脂糖凝胶电泳后纯化回收,DNA定量 后取l用AfaI酶切,25g/L的琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像后分析结果. 1.3.6分子建模(molecularmodeling)采用Swiss. Pdbviewerv3.7132软件和b5R蛋白三维结构模型, 对M176T/C203Y复合突变的生物结构病理学进行 建模分析. 2结果 2.1PCR产物直接测序引物P1/P2扩增产物长 9O2bp.序列分析显示,患者bSReDNA在两个碱基 位置上呈杂合状态.一个为第527位碱基呈T/C杂 合状态,其中T为正常碱基,c为突变碱基,导致第6 外显子的第176位密码子ATG变为ACG,原来的T 被C替换(Met176Thr)(图1A,见后插页);另一个为 第608位碱基呈G/A杂合状态,其中G为正常碱基. A为突变碱基,导致第7外显子的第203位密码子 TGC变为TAC,原来的G被A替换(Cys203Tyr)(图 1B,见后插页). 2.2限制性酶切分析65R基因第176密码子 ATACG突变后,在该位点引入了PvuI酶识别 序列,使PCR扩增产物(含第6,7外显子)的?I 酶切片段由455bp改变为357bp,98bp.如图2所 示,患者的455bp片段酶切后显示455bp,357bp,98 bp等3个片段,证明其确实是M176T突变杂合子. 患者母亲和两个弟弟也显示455bp,357bp,98bp等 3个片段,为M176T突变携带者;患者父亲和患者 女儿不存在此突变.bSR基因第203密码子TGC TAC突变后,在该位点引入MaI酶切位点.使第7 外显子扩增产物的AfaI酶切片段由115bp,199bp 改变为115bp,135bp,64bp.如图3所示,患者的 314bp片段酶切后产生199bp,135bp,115bp,64bp ? 832?医学研究生2007年8月第20卷 共4个片段,证明其为C203Y突变杂合子.患者父 亲和女儿也显示4个片段,为C203Y突变携带者, 患者母亲和患者弟弟不存在此突变. 酶切前鹤切后 7654321M1234567 图2患者家系b5R基因组DNA片段(含第6,7外显子)的 PvuI酶切分析 Figure2RestrictionenzymeanalysisofgenomicDNAfrag— ments(containingexons6and7)oftheb5Rgeneof thepatientandherrelativeswithPvuI M:MBI50bpDNALadderMarker;l:患者;2:患者父亲; 3:患者母亲;4:患者大弟;5:患者小弟;6:患者女JL; 7:正常人 图3患者家系b5R基因组DNA片段(含第7外显子)的 afaI酶切分析 Figure3RestrictionenzymeanalysisofgenomicDNAfrag— ments(containingexon7)oftheb5Rgeneofthepa— tientandherrelativeswitlIafaI M:100bpDNALadderMarker;l:患者;2患者父亲;3:患者 母亲;4:患者大弟;5:患者小弟;6:患者女JL;7:正常人 2.3患者家系的调查分析见图4. AI AII AIII 无突变 MI76T突变 田C203Y突变 图4患者家系调查分析图 Figure4Pedigreeanalysisofthepatient 2.4家系生化分析结果和分子诊断结果见表1. 表1患者家系生化分析和分子诊断结果 Table1Resultsofbiochemicalanalysisandmoleculardiagno— sisofthepatient’Sfamilymembe~ 3讨论 b5R是一种具有重要生理功能的氧化还原 酶6J.由b5R缺陷导致的遗传性高铁血红蛋白血 症临床上分为两型.I型患者的酶缺陷仅限于 红细胞,主要临床表现为皮肤黏膜紫绀,患者寿命一 般不受影响;II型患者则以体内所有细胞存在酶缺 陷为特征,临床症状除紫绀外,还有智力发育迟缓, 神经系统功能紊乱及多脏器功能损伤等,大多数患 者生存期短J.国内未见?型遗传性高铁血红蛋 白血症的病例报道.目前对该病的确诊主要依靠 RBC中酶活性的检测.寻找和分析b5R的基因突 变类型,有助于阐明该单一基因突变可导致临床上 不同遗传性高铁血红蛋白血症表型的分子机制. 本研究应用PCR相关技术及DNA序列分 析-9’加J,发现并鉴定了福建省福鼎市一遗传性高铁 血红蛋白血症家系患者的b5R基因为 M176T/C203Y复合杂合子.经文献检索,国内外尚 未见有该种突变类型的报道.在I型遗传性高铁血 红蛋白血症的患者中存在b5R基因复合杂合子的 报道也较少.对于遗传性高铁血红蛋白血症I型杂 合子携带者来说,由于一条染色体上的b5R基因为 野生型,体内红细胞的酶活性水平约为正常人的 70%,满足其发挥生化功能所需,所以临床上无紫绀 症状;而两条染色体同时受累(双重杂合子),即各 有不同的等位位点发生错义突变(相当于单一位点 纯合型突变),将导致b5R基因编码有双分子缺陷 的酶蛋白.因此,可以推断本研究鉴定的 M176T/C203Y复合杂合子突变是该遗传性高铁血 红蛋白血症患者的致病基础. 为了探讨基因突变对b5R结构和功能的影响, 我们对176Met---~Thr突变的分子结构病理学进行了 分析,通过氨基酸序列比对(alignment)分析发现猪 肝的b5R与人的b5R有94%的一致性,176Met及其 (下转第846页)