红凤菜抗氧化性及其中红色素的研究

红凤菜抗氧化性及其中红色素的研究 沈阳农业大学 硕士学位红凤菜抗氧化性及其中红色素的研究 姓名:杨秀娟 申请学位级别:硕士 专业:食品科学 指导教师:马荣山赵晓燕 20050501 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 本文采用邻苯三酚自氧化法和,,,,(,，卜二苯基一,一苦肼)法测定红风菜提取物抗氧化能力，并分别对溶于水和乙醇的活性物质进行了提取，并对同时溶于水和乙醇的一种色素进行了定性和稳定性研究。 ，(本文以动态的方式，采用邻苯三酚自氧化法测定红凤菜各种溶剂提取物对超氧阴离子自由基的清除作用，确定了水提物具有最强的清除超氧阴离子自由基的能力，并通过单因素及正交实验确定了红风菜水提物中活性物质的最佳提取工艺参数为:浸提温度,,?、同液比，:,,、浸提时间,(,,。 ,(文章采用,,,,法测定了红风菜的甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯提取物的抗氧化能力，得出甲醇提取物清除,,,,自由基的能力最强，但由于甲醇有毒，且其提取物的抗氧化能力仅仅略强于无水乙醇提取物的，所以以无水乙醇提取其中的活性物质，并确定了最佳提取参数为浸提温度,,?、固液比,:,,、浸提时间,,,,,。 ,(本文分别利用,,,,,酚比色法和,,,,:,,,，(,,,。比色法测定了红风菜中的总酚和总黄酮含量，结果为含有,(,,,的总酚，总黄酮含量为,(,,,。 ,(本文对其中的红色色素进行了定性实验，根据其溶解性、特征峰的波长范围以及色素随,,而发生的颜色变化等理化性质初步确定该色素属于花色苷类色素。 ,(本文通过测定,,对色素溶液的热稳定性和光稳定性，金属离子对色素溶液稳定性的影响和氧化剂、还原剂对色素溶液稳定性的影响，确定了红风菜红色素溶液在酸性条件下对热和光比较稳定;在测定的金属离子中，,,”?、,,“、;,”对色素溶液有较大影响，而其它金属离子的存在对其产生的影响不大;并且该色素对氧化剂和还原剂不稳定，应避免其与氧化剂和还原剂接触。关键词:红凤菜抗氧化自由基花青素 前言 国内外对自由基的研究现状 自由基是指外层轨道上带有不配对电子的系子、分子或基团。氧分子轨道上有两个未成对电子，很容易转变为自由基和活性氧，人体内的自由基以氧自由基(,,,,,, ,,,, ,,,椋悖幔欤埃疲遥?鳎跻趵胱樱ǎ埃玻ぃ?亲杂苫ぃ埃龋?趸夥肿樱迹龋玻埃摹?使趸铮ǎ蹋校铮?取,鹑颂迥氧自由基产生的原因很多，,方面，由紫外线和宇宙射线的照射，环境污染，以及农药、食物添加荆、酒精、吸烟等外来因素引发的自由基称为 “外源性自由基”。雨另一方面，在薪豫代谢过程中，人体所吸迸的氧气常有,,左右变成化学性质极其活泼的活性氧，这种称为“内源性自由基”。在生理情况下，自由基在体内不断产生，也不断被消除，不但对机体无害，而且还有有益的作用，表现在调节花生四烯酸的代谢，刺激吞噬细胞和嗜中性白细胞的吞噬和杀菌功能等方面;但在病理情况下，受营养应激导致自由基代谢紊乱，其结果是自由基过剩、活性氧增多，这些活性氧可引发脂质过氧化和线粒体损伤，造成机体过氧化损伤，导致不良的生物学效应。生物体内既有自由基生成体系(氧化系统)，也有自由基清除体系(抗氧化系统)。自由基能否对机体产生毒害作用，主要取决于体内抗氧化系统对自由基的清除能力。 (一)自由基与疾病 自由基对生物机体的作用应从两方面来看:一方面，适量的自由基是机体某些物质的生物合成所不可缺少的，机体防御体系、体内的解毒均需自由基的参加:另一方面，当各种因素打破了体内自由基生成和消除的动态平衡时就会使自由基超出生理限度，从而导致生物大分子的损伤、酶失, 沈阳农业大学顼士学位论文活等。由于这些损伤 作用，可造成机体的衰老，产生各种病变，甚至引起疾病。 自由基与癌症:癌症的发生与发展分为致癌、促癌、癌的形成与发展分三个阶段，每一个阶段均有自由基的产生与参与。大部分的致癌物如苯、苯并芘、亚硝基化合物等，都是由较惰性的物质经生物转化成能与细胞成分反应的高活性物质，其转化的过程常常会产生一些自由基中间物，在有氧的条件下，进一步形成反应活性很强的羟基自由基和单线态氧，从而对细胞成分引起损伤，诱发癌症。,(自由基与衰老 英国,(,,,,,,(,,,,)提出了衰老的自由基学说。自由基衰老理论的中心内容认为，自由基对生物具有损害作用，它直接或间接地引起生物衰老，或为衰老原因，或为衰老结果。由自由基引起机体衰老的主要机制可以概括为以下三个方面。 (,)生命大分子的交联聚合和脂褐素的累积:自由基参与脂质过氧化反应，其氧化反应终产物会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，该现象是衰老的一个基本因素。 (,)器官组织细胞的破坏与减少:生物膜上的不饱和脂肪酸极易受自由基的侵袭发生过氧化反应，氧化作用对衰老有重要的影响，自由基通过对脂质的侵袭导致了器官组织细胞的破坏和减少，加速了细胞的衰老进程，而器官组织细胞的破坏与减少正是机体衰老的症状之一。 (,)免疫功能的降低:自由基作用于免疫系统或作用于淋巴细胞使其受损，引起老年人细胞免疫与体液免疫功能减弱，并使免疫识别能力下降出现自身免疫性疾病。 前言,(自由基与炎症和免疫 ,,?作为细胞信使分子，具有舒张血管，抑制血小板聚集、调节神经 递质传递、参与巨噬细胞介导的细胞毒素等生理功能，在炎症与免疫中具有细胞毒作用和扩张血管皮潜在性保护作用的双重特性。有证明，,,,,浓度水平的,,?主要引起细胞毒作用。而, ,,,或, ,,,浓度水平的,,?则参与免疫及炎症过程中的信息传递。,,?与,,快速反应生成,,,,，迅速灭活,,、而铡,,进一步分解成叫和,,,，,,,,氧化巯基引起膜脂质 过氧化，呈现细胞毒索性。它的分解产物,,和,,(比,,?更活泼，毒性更 大。,,可氧化,,,造成链断裂，交叉联结和碱基修饰等几种类型的,,,损伤，,一羟基鸟嘌呤是,,,碱基被氧化的产物之一。其增多是氧化引起,,, 损伤的主要特征。此外，,,?可直接氧化成,,(导致,,,损伤，,,?和,:,, 反应生成具有细胞毒性的,,,?炎症激活巨噬细胞生成的,,?及其衍生物在致癌阶段中亦起重要作用。 另外，自由基还与肺炎、肝炎、糖尿病、光损伤、白内障、肌肉损伤、 毒物侵害甚至疲劳等疾病密切关系。 (二)自由基的 自由基都含有未成对电子，具有顺磁性和很高的反应活性，故自由基 的检测方法都是基于这两个特性而发展起来。目前，自由基的检测方法主要有电子自旋共振捕集法、比色法和化学发光法等。,。电子自旋共振撼集法(,,,) 自由基上的电子具有自旋特性，其旋转过程会产生一个自旋磁矩。如果自由基处于一个外磁场中，其电子的自旋磁矩与外磁场平行时，能量最低:而当电子的自旋磁矩与外磁场反平行时，能量最高。用辐射的方法给, 鎏塑奎兰～:查主要圭兰垒兰兰处在低能级的电子一个相当于能级差的能量，使跃迁至高能级，此过程称为共振。将此共振信号收集并放大，即可得到,,,波谱，可用作判定自由基的存在和浓度。因为自由基的寿命非常短，将一种不饱和的抗磁性物质 (称为自旋捕集剂)加入到研究的反应体系中，生成寿命较长的自旋加成化合物，即可用自旋共振仪对自由基进行检测。,(化学发光法 自由基在反应过程中，释放能量，产生化学发光，利用高灵敏度发光仪可直接观察。为了提高观察效果，通常加入鲁密诺(,,,,,, ,)等作为光增效剂。活性态氧可使增效剂氧化激发，回到基态时释放特定波长的光，测定其发光强度即可推算自由基的浓度。,(比色法 该方法主要用来测定?,,自由基。其原理是?,,,可以使细胞色素,,,,，;,,(;(,,)——,盯，;,,(,(?)由还原型转化为氧化型。还原型的细胞色素;,,(;(，，)呈浅红色，而氧化型的细胞色素;,,(;(,)呈浅黄色。在删体系中加入细胞色素;,,(;(,,)，在一定温度下培育一段时间，然后用分光光度测定一定波长下的吸光度，与空白对照，即可确定体系中?伽的量。 (三)自由基清除剂 自由基清除剂或抗氧化剂是指能清除自由基或能阻断自由基参与氧化反应的物质。自由基清除剂可分为酶类清除剂和非酶类清除剂两大类。酶类清除剂一般为抗氧化酶，主要有超氧化物歧化酶(,,,)，过氧化氢酶 (,,,)和谷胱甘肽过氧化酶(,,,—,,)，非酶类自由基清除剂一般是一些 , 前言抗氧化剂，如,,、,，、,一胡萝,素、茶多酚、黄酮类化合物和还原型谷胱甘肤(,,,)等。,，酶娄自由基清除粼 ,,,存在于几乎所有靠氧呼吸的生物体内，是一类含金属的酶。对氧 自由基有强烈清除作用，特别对于町?,,,可将其催化歧化而生成,,仉和,，故,,,)又称为清除,,?韵异酶。由于,,,对自由基有强烈的清除作用，它可以保护脂质不受自由基作用而发生氧化，帮助人体抵抗衰老，,,,还可以增强人体自身的免疫力，治疗由于免疫功能下降而引起的疾病。在癌症病人的放射治疗过程中，,,,可清除放疗所诱发的大量自由基。从而减少放射对人体其它正常组织的损伤。,,,对治疗各种炎症及缺血再灌注损伤等也有良好的功效。 ,,,几乎在所有能呼吸的生物体内存在，它的主要作用是清除,:,,，从而防止生成羟基自由基。,，非酶类自由基清除剂 (,)维生素 对自由基具有清除作用的维生素主要有,,、,;及,，的前体,一胡萝卜素。 ,,又称为生育酚，是强有效的自由基清除剂。它经过一个自由基的中间体氧化生成生育锟，从而将,,,?转化为化学性质不活泼的,,,,，中断了脂类过氧化的链锁反应，有效地抑制了脂类的过氧化作用。 ,,可清除自由基，防止油脂氧化和阻断亚硝胺的生成，故在提高免疫能力，预防癌症等方面有重要作用。同时在预防和治疗缺血再灌注损伤等疾病有一定功效。, 沈阳农业大学硕士学位论文 ,。又称为抗坏血酸。在自然界中存在还原型抗坏血酸和抗氧化脱氢抗坏血酸两种形式。抗坏血酸通过逐级提供给电子而转化变成半脱氢抗坏血酸和脱氢抗坏血酸，在转化的过程中达到清除,,„、?,,、,,,?等自由基的作用。 (四)抗氧化剂的夭然植物来源 抗氧化剂近几年来在国内外发展很快，用途越来越广，可以作为食品添加剂，不但能阻止或延缓食品中的油脂自动氧化，延长食品的货架寿命期，而且能防止食品由于氧化而造成的营养损失、褐变、褪色等;可以用于医药和保健食品，以清除体内的过剩自由基:还可以应用于化妆品行业，以延缓人类肌肤因氧化、紫外线的照射所引起的老化过程。长期以来，食品工业主要使用人工合成的抗氧化剂，如丁羟基茴香醚(,,,)、二丁基羟基甲苯(,,,)、没食子酸丙酯(,,)和特丁基对苯二酚,,,,,)等，由于其潜在的毒性和致癌作用愈来愈受到人们的摔斥，国外不少发达国家已经明令禁止在食品或部分食品中使用人工合成的抗氧化剂。尽管我国目前没有明文禁止，但对其使用量也进行了严格的限制，尤其是我国加入了,,,，食品行业也要与国际接轨，因此寻找天然、高效、低毒的抗氧化剂成为必然的趋势。 天然食用植物是安全、可靠、价廉、源广的抗氧化剂的重要来源。因为天然植物也是 生命有机体，在其生命活动过程中同样也会由于外源或内源性因素产生自由基。因此在漫长的生物进化过程中，天然植物体内产生了一套精细的防护、清除和修复过量自由基的体系。包括酶体系:如,,,、,,,、,,，卜,,、过氧化物酶等等:非酶体系:如,。、,。?一胡萝卜素、硒、蛋白质及其衍生物类、酚酸类、生物类黄酮、内酯、植酸等。 中国农科院茶叶研究所于,,,,年开始研究茶叶天然抗氧化剂，分离 , 前言出了茶叶抗氧化成分，并证明其具有优异的抗氧化活性、过氧化值和酸价的抑制率都在,,,以上，抗氧化的效价比、『,高,倍，与,。和,,并用有协同增效作用。,,,,年,月,日至,日，卫生部在天津召开的全国食品添加剂卫生标准协作会第十三次会议上，承认了茶叶天然抗氧化剂为我国食品添加剂之一。 香辛料植物是天然植物抗氧化剂的重要来源。这类植物有迷迭香、鼠尾草、百里香、牛至革、丁香、薄荷、胡椒、生姜、大蒜等。,,,,年至,,,,年，，,,,,,,和,,,,,,,,等从迷迭香干叶的正己烷提取物中分离得到三种酚系二萜化合物:迷迭香酚、表迷迭香酚和异迷迭香酚，他们对猪油和亚油酸都有很强的抗氧化能力，尤其对猪油的抗氧化能力是,,,和,,,的 四倍。迷迭香酚和鼠尾草酚同样能从鼠尾草中提取得到，并且鼠尾草酚有 比,,,、,,,和,更强的抗氧化能力。唇形科百里香的精油中含有百里香酚和香芹酚等抗氧化成分。,,,,，,,,,,,,,等人从百里香的丙酮提取物中分离得到六种类黄酮物质及五种联苯化合物，发现,种类黄酮化合物和,种联苯化合物的抗氧化能力与,,,相当。大蒜中含有的多种烯丙基化合物也有一定的抗氧化活性。余世望等从,,多种药食两用植物中筛选发现:丁香、小茴香、生姜、藿香、香椽、芝麻、薄荷等的抗氧化活性都较高。 在我国资源丰富的中草药也是高效、低毒、经济的天然抗氧化剂的重大来源。近年来，我国科学家在此方面的研究、开发、应用都成绩斐然。王以群(,,,,)等人经过对一些传统中草药的抗氧化筛选后首次报道了丹参的良好抗氧化性能。王斌贵(,,,,)等对,,多种具有体外抗氧化效能可能性的中草药进行了在油脂中抗氧化筛选实验，发现过路黄和荔枝具有较好的抗氧化性能。同时，美国、日本、韩国和我国台湾省、香港行政区的一些同行对中草药的抗氧化性方面也做了大量的研究。我国台湾学者,,等发现，金锦香、三七草、芡实、钩藤的乙酸乙酯提取物的抗氧化能力均强于,,,。,,,,,,等的研究发现甘草乙醇提取物的抗氧化能力强于,,,。韩国, 沈阳农业大学硕士学位论文,,,(,,,,)等人在,,,种中药中发现,,种中药的甲醇提取物有显著的抗氧化能力，进一步筛选出乌附子、白屈菜、细辛等,,种中药有极强的抗氧化能力。 许多果蔬类植物也表现出优异的抗氧化性能。许申鸿等研究表明，葡萄籽和葡萄皮水提物对町?、?伽及,,,,?自由基均有较强的清除作用，且抗自由基活性均为鲜葡萄籽,葡萄皮,千葡萄籽。国外对葡萄提取物的抗氧化性研究及应用亦十分活跃，法国等不少国家已将葡萄籽作为原料制备葡萄籽提取物，并将其加入到红葡萄酒中，以提高其抗氧化活性物质的含量。并且国外许多科学家实验发现葡萄籽中的天然抗氧化剂能防止动脉粥状硬化、抗凝血(,,,,, ;,,,,,,,)、增加高密度脂蛋白或高密度脂蛋白胆固醇(,,,,,)、抑制低密度脂蛋白(,,,)的氧化，清除自由基(,,,,,,,,;,, ,;,,,,,,,,)。防癌抗肿瘤等多种功效。张佃志等对,,种蔬菜抗氧化性的比较研究中发现茄子对町?的抑制率最高。国外,,,,,等、,,,等测定了,,种水果对,, ,?的清除能力，表明大蒜、羽衣甘蓝，菠菜等最强。郭长江对坚果类食物清除,,,?作用研究发现，葵花子具有较强的清除,,,?的作用，花生、核桃次之。因此以天然植物抗氧化剂取代合成抗氧化剂是今后食品工业发展的趋势，同时从天然植物中寻找清除体内自由基的物质也将是现代医药、保健行业的趋势。二、花青素研究进展 花青素(,,,,,;,,,,,,,)是一类广泛存在于植物中的水溶性色素，属于类黄酮化合物，也是植物的主要呈色物质。自然条件下游离的花青素极少见，而常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等通过糖苷键形成花色苷(,,,,,;,,,,,)，花色苷中的糖苷基和羟基还可以与一个或几个分子的香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸等芳香酸和 , 删 嗣 脂肪酸通过酯键形成酰基化的花色苷。已知天然存在的花色苷有,,,多种， 存在于,,个科，,,个属的植物中。 (一)花色苷的结构特点 花色苷是花青素的糖苷衍生物，基本结构如图,。 ,, 图,花色苷基本结构 ,,,(, ,,,,, ,,,,;,,,, ,, ,,,,,;,,,,, 注:,,和,是,、,,或者,;,,，,，是糖基或,，,。是糖基或,, ——————型垒墅～～唑兰垡蜜墅型唑～ 表,六种常见色素的结构特点 取代物 名称 英文名称 缩写 ,,,,,,,,,。 ,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,(—?—了——?—了——,—了,『 天竺葵色素,,,,,,,,,,,, ,, ,, ,, , ,, , ,, , 矢车菊色素？?,,,? ,, ,, ,, , ,, ,, ,, , 飞燕草色素,,,,,,,,,,, ,, ,, ,, , ,, ,, ,, ,, 芍药色素,,,,,,,, ,, ,, ,, , ,, ,,, ,, , 牵牛花色素,,,,,,,,, ,, ,, ,, , ,, ,,; ,, ,,』,墼,竺型～竺:竺竺～竺翌竺竺～竺旦～竺～ 已知有,,种花青素，在植物中常见的有六种，即天竺葵色素(,,)、矢车菊色素(,,)、飞燕草包素(,,)、芍药色素(,,)、牵牛花色素(,,)和锦葵色素(,,)，结构如表,。,, 沈阳农业大学硕士学位论文 (二)花色苷的生理功能 花色苷最突出的作用就是使植物呈现五彩缤纷的颜色，同时花色苷也是一类具有保健功能的活性成分，大量研究表明:花色苷具有很强的抗氧化作用，可以清除体内的自由基;降低氧化酶的活性;可以降低高血脂大鼠的甘油酯水平，改善高甘油酯脂蛋白的分解代谢:抑制胆固醇吸收，降低低密度脂蛋白胆固醇含量;抗变异、抗肿癌、抗过敏、保护胃粘膜等多种功能。 研究发现法国人心脏病的发病率相对较低，其原因是与法国人比较爱喝含有葡萄皮色素的红葡萄酒有关，从红葡萄中提取的花色苷能有效地清除町?和?,,，在体外实验中，花色苷能明显抑制低密度脂蛋白的氧化和血小板的聚集，这两种物质是引起动脉硬化和心血管疾病的主要因子。从红葡萄中提取的花色苷还能抑制胃癌细胞,，,,,,,的生长，并且效果要比其它药物好的多。,,,,,,,,,用从红葡萄酒中提取的花色苷和链唑霉素饲喂患有糖尿病的大鼠，发现患病大鼠尿和血浆中的含糖量明显降低，同时由链唑霉索引起的大鼠体重降低现象也不复存在。日本的,,,,, ,等用矢车菊素一,一葡萄糖苷进行大鼠饲喂实验，表明此花色苷可以降低血清蛋白和脂质体的过氧化作用，并且对重灌流诱发的局部贫血肝脏的氧化性损伤具有保护作用:,,,研究了从植物花瓣中提取的花色苷能够防止四氯化碳引起的大鼠的急性肝脏损伤:,,?是由,一精氨酸产生的双原子自由基，它在人体的组织和细胞中合成大量的氮的氧化物(;,,,和,,,,)，导致多种慢性炎症的发生，,,, ,和,,,,,(,,,,)研究发现花色苷能非常有效的抑制,,?的产生。 最新研究发现花色苷和,,,之间具有相互作用，牛的;,,,,和花色苷能形成一种复合花色营一,,,，并且当花色苷与牛的;,,,,混合时，其最大吸收波长会向红波方向移动,,,,,,,，如果将花青素或牛的;,,,,(单独置 前言于由二价铁离子反应产生,,?的体系中都受到不同程度的损坏，若将复合的花色苷一,,,置入时则都不会造成氧化损坏，因此，他们认为花色苷一,,,复合体可能是一种抵制,,,氧化损伤的机制和在活体内有可归因于花色苷抗氧化能力的生理功能。并且在,,,,年，,,提出花色苷稳定,,,三维结构的功能机理图,如图,所示, , ,, , ,一, 花色苷,,, 花色苷(,,, ,?,斡， ，,—, 图,花色苷与,,,的作用机制 ,,,(, ,,, ,,;,,,,,, ,,,,,;,,,, ,,,,,,, ,,,,,;,,,,, ,,, ,,, (三)花青素的提取和鉴别 花青素分子中存在高度分子共轭体系，具有酸性与碱性基团，易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂中。通常用含有少量盐酸或甲酸的甲醇做溶剂提取，其中的酸能防止非酰基化的花色苷的降解。然而在蒸发浓缩时这些酸会导致色素的降解。.