Id3基因在心肌营养素1促心肌成纤维细胞增殖中的作用

Id3基因在心肌营养素1促心肌成纤维细胞增殖中的作用 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 Id3基因在心肌营养素1促心肌成纤维 细胞增殖中的作用 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 作者,周瑞红 李菊香 夏子荣 颜素娟 谭秋波 【摘要】 目的 探讨在高静水压条件下分化抑制因子3,inhibitory of differentiation 3,Id3 )基因在心肌营养素1 (cardiotrophin1,CT1 ) 促心肌成纤维细胞增殖中的作用。方法 3,4代心肌成纤维细胞用于实验,分为对照组( C 组)、CT1反义寡核苷酸组 (ASODN组) 、 正义寡核苷酸组 ( SODN组)、高静水压组( P 组)。利用自制压力培养装置,将各组细胞置于160 mmHg压力下培养8 h。CT1活性通过 Western印迹法测定,Id3基因达通过RTPCR方法测定,MTT测定心肌成纤维细胞增殖 。结果 高静水压明显促进心肌成纤维细胞增殖 ,CT1表达上调,Id3 mRNA表达增加,CT1 ASODN干预后能抑制高静水压所致的细胞增殖,CT1表达下调,Id3 mRNA表达减少。结论 Id3 mRNA在心肌成纤维细胞中有明显表达,且与CT1促心肌成纤维细胞增殖密切相关。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 【关键词】 心肌营养素1 ,心肌成纤维细胞 ,分化抑制因子3 近年有研究发现心肌营养素1 ( CT1 )与高血压心室重塑有一定的关联,在12周龄的自发性高血压大鼠(SHR)的肥厚心室肌中,CT1 mRNA明显升高〔1〕。另有研究发现,内源性或外源性的CT1能刺激成纤维细胞合成DNA及胶原,促进成纤维细胞生长〔2〕 。分化抑制因子,Id,3作为血清诱导的立即早期基因在小鼠成纤维细胞系中被首次发现,其基因由3个外显子和2个内含子组成〔3〕。Id3参与多种细胞生物学过程,包括骨骼肌的分化、血管平滑肌的增殖、胚胎的神经形成、骨和血管发生等〔4,7〕,表明CT1与Id3均存在于成纤维细胞中,且都有促进细胞增殖的作用,但他们之间是否存在某种联系,Id3在心肌成纤维细胞中的表达情况及 CT1促心肌成纤维细胞增殖的作用是否与Id3有关尚未见报道。 1 材料与方法 1.1 材料 出生1,3 d的SD乳鼠(南昌大学医学院医学实验动物科),RTPCR试剂,Promega,USA,,Trizol( Invitrogen,USA),DEPC,二甲基亚砜,DMSO),Ameresco,USA,, DL2000 DNA Ladder Marker (上海生工) ,MTT增殖检测试剂盒(Sigma,USA) 。 1.2 方法 1.2.1 心肌成纤维细胞的原代培养及鉴定 在无菌条件下摘取4,5只大鼠心脏, 分离心室利用蛋白酶消化心肌组织, 差速贴壁法获得原代心肌成纤维细胞。第 3,4代细 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 胞用于实验。鉴定方法参照文献〔9〕。 1.2.2 CT1反义链与正义链的设计与合成 以硫代磷酸修饰反义和正义寡核苷酸链,由上海生物有限公司合成,各自序列为,CT1反义寡核苷酸链(ASODN),5′TGGCTCATGCTGGCCCCAGGCTGAT3, CT1正义寡核苷酸链(ASODN),5′ATCAGCCTG′GGGCCAGCATGAGCCA3′。 1.2.3 实验分组及干预 ?空白对照组(C) ,大气压下培养, ?高静水压组(P) ,160 mmHg 压力下培养8 h〔9〕,?CT1反义寡核苷酸组(ASODN组),160 mmHg压力培养下,加入终浓度为10 μmol,L的ASODN,?CT1正义寡核苷酸组(SODN),160 mmHg 压力培养下8 h,加入终浓度为10 μmol,L的SODN。 1.2.4 RTPCR法检测Id3 mRNA 的表达 按照Trizol试剂说明书提取心肌细胞总RNA。参照Promege公司提供的RTPC试剂盒说明书进行逆转录反应, PCR反应共35个循环。引物设计由 Gen Bank中获取目的基因全序列,借助primer primier 5.0软件设计完成,由上海生工合成,各引物序列,含参照序列?和目的序列?,见下 ,?βactin正义5′GTAAAGACCTCTATGCCAACA3′,反义5′ACTCATCGTACTCCTGCTTG3′,240 bp。?Id3正义5′CATCTCCCGATCCAGACA3′,反义5′ DOC格式论文,方便您的复制修改删减 TCATAATCAGGGCAACAGAG3′,494 bp。 1.2.5 蛋白表达的检测 Western 印迹法检测细胞裂解液中CT1蛋白表达情况,用 Lab Work 3.0 UVP软件分析条带的积分吸光度值, 相对蛋白含量用积分吸光度值表示。 1.2.6 心肌成纤维细胞增殖检测( MTT法) 在各种条件培养下的96孔板实验结束前4 h ,每孔加入5 g,L的MTT ( 四氮唑盐) 20 μl,实验结束后,弃去各孔中的培养基, 每孔加入DMSD 150 μl,振荡10 min,酶标仪测490 nm吸光度。 1.3 统计学处理 实验数据以x?s表示,应用 SPSS12.0软件。组间比较采用独立样本t检验,多组均数间比较采用单因素方差分析( ANOVA) ,两组均数间比较采用 LSD检验。 2 结 果 2.1 高静水压对心肌成纤维细胞Id3 mRNA表达的影响 在160 mmHg高静水压下,Id3 mRNA表达明显增加(P0.05),ASODN组Id3 mRNA的表达明显低于P组和C组(P0.05),SODN组与P组相比无显著差异(P0.05)。见图1,表1。 2.2 高静水压对心肌成纤维细胞CT1蛋白表达的影响 在160 mmHg高静水压下,CT1蛋白表达明显增加(P0.01),ASODN组CT1蛋白表达明显低于P组(P0.01),SODN组与P组相比无显著差异(P0.05)。见表1,图2。表1 各组Id3 mRNA、CT1 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 蛋白表达灰度值及心肌成纤维细胞增殖,mTT法,比较(略) 2.3 MTT检测CT1的ASODN对高静水压刺激成纤维细胞的影响 成纤维细胞经160 mmHg的压力作用8 h后,明显增殖(P0.05) ,CT1ASODN能抑制高静水压所致的细胞增殖(P0.05),而CT1 SODN组对高静水压的促细胞增殖作用无影响,表1。 3 讨 论 CT1主要存在于心脏组织中,是心脏正常生长、发育所必需的物质。心肌细胞和成纤维细胞都能表达CT1,且心肌中CTl mRNA 浓度和蛋白水平在 Dahl盐敏感大鼠的左室肥厚阶段和充血性心力衰竭阶段均明显增高。另有研究发现,内源性或外源性的CT1能刺激成纤维细胞合成DNA及胶原,促成纤维细胞生长。因此CT1在心室重塑,包括心肌成纤维细胞增值、心肌细胞肥大、胶原沉积等,中发挥重要作用,而其作用途径尚有待进一步研究。Id又称DNA结合抑制因子( inhibitor of differentiation,DNA binding),包括Id1,Id4,属于螺旋环螺旋( HLH) 转录因子家族成员之一,主要通过与A类碱性HLH( bHLH) 蛋白(如E蛋白) 结合而发挥作用,因其本身缺乏DNA结合必需的碱性氨基酸序列,Id蛋白和E蛋白结合形成异二聚体后能够阻止E蛋白和其他bHLH蛋白结合,对bHLH转录因子活性起负调节作用〔8,10〕。Id3作为血清诱导的立即早期基因在小鼠成纤维细胞系中被首次发现,其表达受多条信号转导途径的调控,诱导Id3表达的因素有,血小板衍生生长因子、甲状腺刺激素、 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 表皮生长因子、肝细胞生长因子、骨形态发生蛋白、转化生长因子、肿瘤坏死因子等,不同的刺激因素作用于不同的组织细胞,通过不同的信号途径,可导致Id3表达水平不同程度的升高或降低,其表达呈细胞特异性和双向调节性。因此Id3参与多种细胞生物学过程,包括骨骼肌的分化、血管平滑肌和肿瘤细胞的增殖、胚胎的神经形成、骨和血管发生等〔4,7〕。 笔者以往的研究发现心肌成纤维细胞在160 mmHg高静水压下培养8 h后,与对照组相比心肌成纤维细胞达到最大增殖效果〔11〕,本研究发现在此条件下CT1的表达亦明显增加,同时发现Id3 mRNA在心肌成纤维细胞中也有明显表达,当使用CT1ASODN干预后,心肌成纤维细胞增殖明显减弱,CT1的表达明显减少,Id3 mRNA在心肌成纤维细胞中的表达也明显下调,这表明CT1的作用与Id3 mRNA的表达有关,而使用CT1 SODN干预后,心肌成纤维细胞增殖、CT1和Id3 mRNA的表达均无明显变化,由此推断 Id3可能也在CT1促心肌成纤维细胞增殖或者促心肌重塑过程中发挥作用。 【参考文献】 1 Takimoto Y,Aoyama T,Iwanaga Y,et al.Increased expression of cardiotrophin1 during ventricular remodeling in hypertensive rats〔J〕. 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