分析实验报告 高效液相色谱

华南师范大学实验 学生姓名：杨秀琼            学号：  20082401129          专业：    化  学          年级班级：08化二                  课程名称：仪器分析实验      实验项目：液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯 实验类型：综  合          实验时间：2010/416            实验指导老师 曹立娟老师    实验评分：                      一、[实验目的:] 1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法 2、了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术 二、[实验原理:]    高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分析技术。具有分离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。 其基本原理：利用欲分配的诸组分在固定相和流动相间的分配有差异（即由不同的分配系数），当两相做相对运动时，这些组分在此两相中分配反复进行，从几千次到百万次，即使组分的分配系数只有微小差异，随着液体流动相却可以有明显的差异，最后使这些组分都得到分离，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。 三、[仪器和试剂:] 1.主要仪器：岛津液相色谱仪(LC-10AT)[配有紫外检测PhenomenexO柱]； 10μL微量注射器 2、试剂： 甲醇、水 苯和甲苯混合待测溶液 苯溶液：2.0μL/mL 甲苯标准溶液：2.0μL/mL 苯、甲苯混合标准溶液：1.0μL/mL、2.0μL/mL、5.0μL/mL、10.0μL/mL 四、[实验步骤] 1、按操作开机。 2、.选择合适的流动相配比，优化色谱条件 通过调节溶剂甲醇和水的混合比例，从而来优化色谱调剂。 调好最佳色谱条件，控制流速为1ml/min。柱温30℃，检测波长354nm 3、苯、甲苯定性分析 在最佳条件下，待基线走稳后，用10μL微量注射器分别进样10μL苯和 甲  苯混合待测溶液，10μL苯标准溶液（2.0μL/mL）和10μL甲苯标准溶液（2.0μL/mL）(微量注射器用甲醇润洗3～5遍)，观察并记录色谱图上显示的保留时间，确定苯和甲苯的峰。 4、苯、甲苯定量分析 在最佳条件下，待基线走稳后，用10μL微量注射器分别进样1.0μL/mL、2.0μL/mL、5.0μL/mL 10.0μL/mL的苯和甲苯混合标准溶液10μL。观察并记录各色谱图上的保留时间和峰面积。绘制苯和甲苯混合标准溶液峰面积与相应浓度的标准曲线 5、苯和甲苯混合待测溶液分析 根据得到的苯和甲苯混合待测溶液的液相色谱图上显示的峰面积值，从绘制的标准曲线上查出苯和甲苯混合待测溶液中苯和甲苯的各自的浓度。 六、实验数据处理及分析 1、色谱条件优化 70% 60% 80% 分析：本次实验分别选择了甲醇：水=60%：40%，70%：30%，80%：20%的溶剂配比，通过比较不同溶剂配比条件下，甲苯和苯的峰宽、保留时间从而确定采用甲醇：水=80%：20%作为本次实验的最佳色谱条件。 2、定性分析 样品 苯 甲苯 保留时间 3.708 4.804       分析：在同一色谱操作条件和进样量下，分别测定试样溶液中苯和甲苯组分及已知苯和甲苯纯物质的保留时间，并将其色谱峰、保留时间与对应的已知苯和甲苯纯物质进行比较，两者基本相同，从而确定混合样品中含有苯和甲苯。 3、定量分析 苯、甲苯混合标准溶液浓度分别为：1 ul/ml, 2 ul/ml, 5 ul/ml, 10 ul/ml。 10 ul/ml 1 ul/ml 苯 甲苯     浓度 峰面积 浓度 峰面积 1 ul/ml 80331 1 ul/ml 237101 2 ul/ml 211055 2 ul/ml 509019 5 ul/ml 806721 5 ul/ml 1378851 10 ul/ml 1692218 10 ul/ml 2815005 Y = aX + b a = 181668.7 b = -119927.9 R^2 = 0.9989202 R = 0.9994599 Y = aX + b a = 287133.8 b = -57107.93 R^2 = 0.9999710 R = 0.9999855         4、未知样品浓度 未知样品 苯 甲苯 样品1 4.9ul/ml 4.5ul/ml       七、结果讨论 1、实验中为什么采用标准曲线法作为定量的方法？ 答：因为实验中待测溶液的组分只有苯和甲苯两种物质，组分比较简单。只要在实验过程中，严格控制且定量进样，就能采用操作、计算简便的标准曲线法得出准确的实验结果。若采用归一化法或内标法，虽然能得到准确更高的实验结果，但由于实验操作、计算复杂，不能快速分析，故实验中采用标准曲线法作为定量的方法。 2．在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 3．选择流动相时应注意的几个问 （1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和        使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。 4．影响分离的因素与提高柱效的途径 1）．液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径，降低固定相粒度可提高柱效。 2）．液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质；（恒温） 3）．改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。 5. 高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点： (1)进样方式的不同：高效液相色谱只要将样品制成溶液，而气相色谱需加热气化或裂解； (2)流动相不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力； (3)由于液体的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中约小4~5个数量级； (4)由于流动相的化学成分可进行广泛选择，并可配置成二元或多元体系，满足梯度洗脱的需要，因而提高了高效液相色谱的分辨率（柱效能）； (5)高效液相色谱采用5~10Lm细颗粒固定相，使流体相在色谱柱上渗透性大大缩小，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相； (6)高效液相色谱是在液相中进行，对被测组分的检测，通常采用灵敏的湿法光度检测器，例如，紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光光度检测器等。 6．高效液相色谱的定性和定量分析的方法 定性：①利用纯物质定性的方法 利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。 利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。 ②利用文献保留值定性 相对保留值r21：相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。在色谱中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。 定量：有归一法、内标法、外标法 在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等，但高效液相色谱在分离复杂组分式样时，有些组分常不能出峰，因此归一化法定量受到限制，而内标法定量则被广泛使用。