石蜡切片

石蜡切片 石蜡切片初步实验方法: 石蜡切片的总程序: 石蜡切片一般需经过取材、固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、脱蜡、复水、染色、脱水、透明、封藏等步骤。 实验仪器与试剂 石蜡切片机、烘片机、光学显微镜、烘箱、冰箱、试管以及青霉素小瓶等 冰醋酸、甲苧、纯酒精、蒸馏水、二甲苧、石蜡，熔点为54?-56?，、番红、固绿等 一、取材 二、固定以及固定液配置 1、单一固定液:仅由一种化学药品配成的固定液 1，酒精(ethyl alcohol) 分子式: C2H5OH 常用浓度:70～100, 性能: 渗透速度快,脱水性强 缺点: 能使原生质发生轻微收缩 用途: 可用于各种细胞和组织 注意事项:不用于脂类,高尔基体,线粒体,核;不易做冷冻切片的固定剂;酒精是还原剂,不能与 铬酸、锇酸及重铬酸钾等氧化剂配合成固定剂。 2，福尔马林(formalin) 37,40,的甲醛(HCHO)水溶液 常用浓度: 10,; 性能: 穿透力强,固定均匀; 缺点: 细胞质染色稍差; 用途: 各种细胞和组织;还适用于病理组织检验快速制片和冰冻切片的固定;还可用于保存大的标本; 注意事项: 强还原剂,不能与铬酸、锇酸及重铬酸钾等氧化剂配合成固定剂。 3，醋酸(acetic acid) 分子式: CH3COOH; 常用浓度:5,; 性能: 穿透速度快,不会硬化; 缺点: 使组织膨胀; 用途: 核固定效果最佳; 注意事项:不用于脂类,糖类,高尔基体,线粒体。 4，苦味酸(picric acid) 分子式: C6H2(NO2)3OH,黄色针状结晶; 常用浓度:5, 性能: 穿透速度中等 缺点: 使组织收缩 用途: 能沉淀一切蛋白质 注意事项:不用于脂肪,类脂体,糖类;固定后材料被染成黄色,可用70,酒精洗掉。 5，铬酸(chromic acid) 分子式: CrO3,3,红褐色结晶; 常用浓度:0.5,2.0,; 性能: 穿透速度较慢,硬化程度中等,沉淀作用强烈; 缺点: 使组织收缩; 用途: 细胞学材料,高尔基体,线粒体,肝糖原;注意事项:强氧化剂,不能与酒精、福尔马林等还原剂配合成固定剂;材料固定后必须流水冲洗。 6，重铬酸钾(potassium dichromate) 分子式: K2Cr2O7,橙红色结晶,有毒; 常用浓度:0.5,2.0,; 性能: 穿透速度中等,硬化组织; 缺点: 对碱性染色剂染色较差; 用途: 细胞质固定效果好,类脂体,高尔基体,线粒体; 注意事项:固定情况随固定液的pH值不同而异;强氧化剂,不能与酒精、福尔马林等还原剂配合成固定剂;材料固定后必须流水或亚硫酸液冲洗。 7，氯化贡(mercury bichloride) 分子式: HgCl2,白色粉末或结晶,剧毒;饱和水溶液或70,酒精饱和溶液; 性能: 穿透速度较慢,硬化强烈; 缺点: 使组织收缩; 用途: 能沉淀所有蛋白质; 注意事项:材料固定后必须流水冲洗,冲洗后用0.5,的碘酒精溶液脱汞。 8，锇酸(osmic acid) 分子式: OsO4,淡黄色结晶,剧毒; 1,2,水溶液 性能: 穿透速度慢 缺点: 组织固定不均匀 用途: 细胞质,脂类,高尔基体,线粒体;制作电子显微镜的超薄切片的常用固定剂。 注意事项:材料固定后必须流水冲洗;强氧化剂易被光热还原,用棕色瓶配制,避光冷藏。 单一固定液优缺点: 2、混合固定液: 利用各种药品的优点互补不足;平衡各药品的作用,使其缺点互相抵消。 混合固定液配制注意事宜: 了解各种药剂的理化性质和作用;混合固定液中各种药剂对组织的作用平衡;易于氧化的药剂一般不与还原剂混合应用,需应用时,也必须在临用前加入。 1) 铬醋酸弱液 配方: 10,铬酸水溶液2.5毫升,10,醋酸水溶液5.0毫升,蒸馏水加至100.0毫升,适合固定容易渗透的植物组织,如藻类、菌类、苔藓植物、蕨类植物的原叶体; 固定时间:藻类、原叶体为几分钟至几小时,其他材料12,24小时;不能用作保存液; 2，FAA固定液，福尔马林,醋酸,酒精混合液， 配方: 50,或70,酒精90毫升,冰醋酸水溶液5毫升,福尔马林5毫升,适合固定植物组织，除单细胞和丝状藻类，,也适用于昆虫及甲壳类动物,但不适合作细胞学研究。用此液固定坚硬的材料，如木材，,可略减冰醋酸,增加福尔马林;如固定易收缩的材料可稍增冰醋酸; 固定时间:5,20小时,可无限期延长; 优良保存剂。 3，纳瓦兴氏液(Navaschin’s Fluid) 研究组织学和细胞学的优良固定剂;根据材料柔嫩或坚硬程度选择配方; 固定时间:12,48小时;柔嫩多水可用原液、改良液1或2;坚硬少水可用改良液3,4或5。 4，李庆特氏液，Lichent’s Fluid， 配方:1,铬酸水溶液15毫升,冰醋酸5毫升,福尔马林80毫升,适合固定丝状藻类和真菌。 5，波恩氏液，Bouin’s Fluid， 配方: 苦味酸饱和水溶液90毫升,冰醋酸5毫升,福尔马林25毫升,适合固定一般的植物和动物材料;能迅速渗入组织,保存组织的细微结构,并有助于组织块的整染,细胞核着色鲜艳; 固定时间:12,24小时;固定后用70,酒精冲洗。 6，卡诺氏液，Carnoy’s Fluid， 配方1:100%酒精:冰醋酸,3:1 配方2:100%酒精:冰醋酸:氯仿,6:1:3 配方3:甲醇30ml,乙酸5ml,氯仿15ml 适合固定细胞质和细胞核,尤其适宜于染色体研究,多用于细胞学制片; 固定时间:12,24小时,根尖10,20分钟,花药1小时;固定后95,酒精洗涤,可放入70,80,的酒精保存。 用于根尖、花药的压片及子房的石蜡切片,固定时间15—30分钟,其他材料不超过24小时,做组织化学,显示DNA和RNA效果好。 保存:95%—85%—70%酒精长期保存。 7，肖丁氏液，Schaudinn’s Fluid， 配方: 甲液升汞饱和水溶液66毫升,95,酒精33毫升,乙液冰醋酸1毫升,适合固定具鞭毛的单细胞藻类、植物的精子、游动孢子和原生动物; 固定时间:6,16小时;固定后50,或70,酒精浸洗几次,加入碘溶液可除去沉淀的汞。 三、冲洗 固定后的材料必须进行冲洗,除掉其中的固定剂,否则妨害染色和保存。冲洗剂的应用依固定液的性质而定。 冲洗注意事项: 固定液为酒精或酒精混合液,一般不冲洗。若需洗涤则必须用与固定的酒精浓度相近的酒精洗涤。 含有苦味酸的固定液的材料,用70,的酒精反复浸洗。 含有铬酸、重铬酸钾的,必须用流水冲洗。冲洗时间应与固定时间相同或更长。 用福尔马林固定的,一般可以不清洗,但长期固定的材料应充分水洗。 含四氧化锇的固定液用水冲洗。 固定液含氯化汞的,应根据溶剂的性质用水或酒精冲洗。 四、脱水 各种材料经固定与洗涤后,组织中含有大量水分,由于水与石蜡不能互溶,所以必须将组织中的水分除去。 1，常用脱水剂 正丁醇、叔丁醇、二氧六环脱水效果好;很少引起组织收缩和变脆;也是石蜡溶剂,因此脱水后的材料不必经过透明即可浸蜡。 2，酒精、丙酮 最常用的脱水剂; 从低浓度向高浓度逐级进行脱水,最后一步为纯酒精;纯酒精，纯丙酮，脱水后放入二甲苧中透明,如果产生乳白色,则表明脱水不彻底,应重新进行;丙酮脱水力和收缩力比酒精强,适用于快速石蜡切片。 3，脱水的一般方法 梯度酒精:30%、50%、70%、85%、95%、100,。 脱水注意事项: ?脱水必须在有盖的玱璃品中进行,防止吸收空气中的水分; ?在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料以免损坏,可用吸管吸出器中的脱水剂,再用吸水吸尽器皿内剩余液,然后于皿中加入高一级脱水剂; ?在低浓度酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体; ?在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片; ?如需过夜,应停留在70%酒精中; ?脱水必须彻底,否则不易透明,甚至使透明剂内出现白色混浊现象。 五、透明 材料在脱水后,脱水剂不能与石蜡相混合,而透明剂既可以与脱水剂相混合又能和石蜡相混合,因而可通过透明剂的作用把脱水剂替换出来,使石蜡能顺利地进入材料中。当材料中全部为透明剂占时,材料可呈现不同程度的透明状态。 1、透明剂 二甲苧是最常用的透明剂,脱水完成后,须经过二甲苧与纯酒精的混合液,一般不能直接移入纯二甲苧中。 其他透明剂:甲苧、苧、氯仿、丁香油、香柏油、苧胺油。 透明方法 2、 低浓度到高浓度;由纯酒精和透明剂混合液,转换到纯透明剂中,在纯透明剂中应更换二次。每次处理时间可视材料情况而定,一般30min左右。 3、 注意事项 使用透明剂时,要随时盖紧盖子,以免空气中的水分进入; 更换每级透明剂,动作要迅速,一方面为了不使材料块干涸,另一方面能避免吸收湿气; 在透明过程中, 如果材料周围出现白色雾状,说明材料中的水未被脱净,应退回纯酒精中重新脱水,然后再透明。 六、透腊 透蜡的目的是除去组织中的透明剂，如二甲苧等，,使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。 1、 透蜡的方法 放入二甲苧和石蜡的混合液,再放入纯石蜡两次透蜡; 透蜡时间根据组织的薄厚、大小来进行; 透蜡应在恒温箱内进行,并保持箱内温度在55~60?左右,注意温度不要过高,以免组织发脆。置于恒温箱0.5h。 2、 注意事项 尽量保持在较低温度中进行,以石蜡不凝固为度; 透蜡温度要恒定,不可忽高忽低; 操作要迅速,力求在最短的时间内完成石蜡透入过程,以免引起组织变硬、变脆、收缩等。 七、包埋 包埋就是把石蜡浸透的材料放入熔化的石蜡,待冷却后凝固成蜡块,以备切片。 1、 包埋剂 石蜡最常用的包埋剂;熔点为42～60?。4微米以下的片子,用熔点58～60?,切较厚的片子可用熔点52～54 ?的石蜡; 坚硬、易碎或容易变脆的材料,如枝芽、眼球、脑等不宜用石蜡包埋; 可回收使用。 2、其他包埋剂 棉胶:由浓硝酸与浓硫酸作用于脱脂棉形成,能溶解于纯酒精或乙醚中,不宜用石蜡作包埋剂的材料,多利用棉胶溶液包埋。 乙二醇硬脂、酯蜡、明胶。 3、 包埋方法 将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡,一起倒入包埋盒内,然后包埋盒底部接触冷水中,使其立刻降温凝固成蜡块。 包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素,选择不同熔点的石蜡。 一般动物材料常用的石蜡熔点为52~56?,植物材料用的石蜡熔点为54~58?。