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重组人干扰素α2b软膏(假单胞菌) (新增)

2017-09-19 4页 doc 38KB 36阅读

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重组人干扰素α2b软膏(假单胞菌) (新增)重组人干扰素α2b软膏(假单胞菌) Chongzu Ren Ganraosu α2b Ruangao (Jiadanbaojun) Recombinant Human Interferonα2b Orintments (P. putida) 本品系由高效表达人干扰素2b基因的腐生型假单胞菌,经发酵、分离和高度纯化后,加入软膏基质制成。 1. 基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2.制造 2.1 工程菌菌种 2.1.1名称及来源 重组人干扰素2b工程菌株系由带有人干扰素2b基因的重...
重组人干扰素α2b软膏(假单胞菌) (新增)
重组人干扰素α2b软膏(假单胞菌) Chongzu Ren Ganraosu α2b Ruangao (Jiadanbaojun) Recombinant Human Interferonα2b Orintments (P. putida) 本品系由高效达人干扰素2b基因的腐生型假单胞菌,经发酵、分离和高度纯化后,加入软膏基质制成。 1. 基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2.制造 2.1 工程菌菌种 2.1.1名称及来源 重组人干扰素2b工程菌株系由带有人干扰素2b基因的重组质粒转化的腐生型假单胞菌菌株(Pseudomonas putida VG-4)。 2.1.2种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。 2.1.3菌种检定 主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。 2.1.3.1划种LB琼脂平板 应呈典型的腐生型假单胞菌集落形态,无其他杂菌生长。 2.1.3.2 染色镜检 应呈棒状,可运动,有荚膜,无芽孢。涂片染色应呈典型的革兰阴性。 2.1.3.3 对抗生素的抗性 应与原始菌种相符。 2.1.3.4 电镜检查(工作种子批可免作) 应为典型的腐生型假单胞菌形态,无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。 2.1.3.5 生化反应 不液化明胶、不水解淀粉和聚β-羟基丁酸酯(附录ⅪⅤ), 不能利用反硝化作用进行厌氧呼吸,能够合成荧光色素。应符合腐生型假单胞菌生物学性状。 2.1.3.6 干扰素表达量 在摇床中培养,应不低于原始菌种的表达量。 2.1.3.7 表达的干扰素型别 应用抗2b型干扰素参考血清做中和试验,型别无误。 2.1.3.8质粒检查 该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。 2.1.3.9  目的基因核苷酸序列检查(工作种子批可免做) 目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。 2.2 原液 2.2.1 种子液制备 将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基(可含适量抗生素)中培养,供发酵罐接种用。  2.2.2发酵用培养基 采用适宜的不含任何抗生素的培养基。 2.2.3 种子液接种及发酵培养 在灭菌培养基中接种适量种子液。在适宜的温度下进行发酵,应采用经批准的发酵工艺,并确定相应的发酵条件,如温度、pH值、溶氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查(附录Ⅸ G)。 2.2.4  发酵液处理 用高速离心法收集处理菌体。收集到的菌体可在-20℃以下保存,应不超过1年。 2.2.5  初步纯化 采用经批准的纯化工艺进行初步纯化,使其纯度达到规定的要求。 2.2.6  高度纯化 经初步纯化后,采用经批准的工艺进行高度纯化,使其达到3.1项要求,即为干扰素原液。除菌过滤后保存于适宜温度,并规定其有效期。 2.2.7  原液检定 按3.1项进行。 2.3软膏剂制备 采用的基质应符合软膏剂基质要求(附录I G)。 2.3.1 配制 按经批准的配方进行配制。 2.3.2软膏制备 按经批准的工艺进行。软膏质地应均匀、细腻、涂展性良好,排除气泡。 2.4成品 2.4.1分批 应符合“生物制品分批规程”规定。 2.4.2 规格 应为经批准的规格。 2.4.3 包装 应符合”生物制品包装规程”和附录ⅠG的规定。 3. 检定 3.1 原液检定 3.1.1生物学活性 依法测定(附录X C)。 3.1.2蛋白质含量 依法测定(附录VI B第二法)。 3.1.3比活性 为生物学活性与蛋白质含量之比,每1mg蛋白质应不低于1.0×108IU。 3.1.4纯度 3.1.4.1 电泳法 依法测定(附录IV C)。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,分离胶胶浓度为15%,加样量应不低于10μg (考马斯亮蓝R250染色法)或5μg (银染法)。经扫描仪扫描,纯度应不低于95.0%。 3.1.4.2 高效液相色谱法 依法测定(附录III B)。色谱柱以适合分离分子质量为5~60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂;流动相为0.1mol/L磷酸盐-0.1mol/L氯化钠缓冲液,pH7.0;上样量应不低于20g,于波长280nm处检测,以干扰素色谱峰计算理论塔板数,应不低于1000。按面积归一化法计算,干扰素主峰面积应不低于总面积的95.0%。 3.1.5分子量 依法测定(附录IV C)。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,分离胶胶浓度为15%,加样量应不低于1.0μg,分子质量应为19.2kD±1.92kD。 3.1.6外源性DNA残留量 每1支应不高于10ng每1μg蛋白质应不高于2ng(附录IX B)。 3.1.7宿主菌蛋白残留量 应不高于总蛋白质的0.02%(附录IX D)。 3.1.8残余抗生素活性 依法测定(附录IX A),不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。 3.1.9等电点 主区带应为5.7—6.7, 供试品的等电点与对照品的等电点图谱一致(附录IV D)。 3.1.10紫外光谱扫描 用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至约100μg/ml~500μg/ml,在光路1cm、波长230nm~360nm下进行扫描,最大吸收峰波长应为278±3nm(附录II A)。 3.1.11肽图(至少每半年测定一次) 依法测定(附录VIII E),应与对照品图形一致。 3.1.12  N-末端氨基酸序列(至少每年测定一次) 用氨基酸序列仪测定,N-末端序列应为: Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Arg-Thr-Leu。 3.2 成品检定 除外观、装量检查外,应按经批准的方法预处理供试品后,进行其余各项检定。 3.2.1鉴别试验 按免疫印迹法(附录VIII A)或免疫斑点法测定(附录VIII B),应为阳性。 3.2.2物理检查 3.2.2.1外观 应为无色半透明膏体。 3.2.2.2. 装量 依法检查(附录V F),应符合规定。 3.2.3 pH值 取本品10g,加入20g的水溶解,搅拌均匀。pH值应为5.0-6.5(附录V A )。 3.2.4生物学活性 应为标示量的80%-150%(附录X C)。除另有规定外,用测定培养基充分溶解供试品后测定。 3.2.5微生物限度检查 依法检查(附录XII G),应符合规定。 4 保存、运输及有效期 于2~8℃避光保存及运输。自生产分装之日起, 按批准的有效期执行。 5. 使用 应符合 “生物制品包装规程”规定和批准的内容。
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