组成人体的细胞

组成人体的细胞 第一篇 组成人体的细胞 第二章 基于抗体的细胞化学显示 在生命科学研究领域，抗体已被成功地应用于捕获靶分子(抗原)、亲和层析纯化蛋白、组织细胞中靶分子定位研究等诸多方向。这些技术所利用的其实就是抗体与抗原发生特异性结合的特性，所有这些基于抗体的研究技术主要可被分为四种类型:?利用抗体“示踪”靶分子;?利用抗体去捕获靶分子;?利用抗体进行蛋白功能学研究;?通过和芯片技术的结合用于蛋白达谱研究。 第一节 抗体的标记 在绝大多数情况下，当抗体分子被应用于研究时均需要被标记。依据实验目的之不同，所采用的标记方法和标记物通常也是不同的。 一、抗体的标记的直接法与间接法 (一)直接法 直接法是将纯化后的抗体先与一标记物直接结合，然后再与靶分子(抗原)结合，通过抗体所携带的标记物来对靶分子(抗原)进行定性、定位、定量测量的方法。 (二)间接法 间接法与直接法不同，抗体既不需纯化也不需标记，而是在抗体与相应靶分子(抗原)结合后，洗去未结合抗体，然后通过利用已标记好的第二抗体(二抗)与一抗的结合来间接标记出靶分子(抗原)的存在情况。此方法带有比直接法更多的标记物，因此较直接法灵敏。 二、标记物的选择 无论是直接法还是间接法，标记物的选择至关重要。表1-2-1所列出的就是一些常用标记物及其相应的检测方法和优缺点等。 表1-2-1 标记物的选择 标记物 检测方法 优点 缺点 应用 生物素 与各种标记物偶保存时间长，灵步骤过多，存在免疫组化、免疫 联的亲和素与链敏度高，检测手内源性生物素干印迹 霉亲和素 段多样 扰，有些底物对 人体有害 荧光色素 荧光显微镜或荧保存时间长，分自发荧光，易淬免疫组化 光计 辨率高 灭 酶 底物显色 保存时间长，灵步骤过多，存在免疫组化、免疫 敏度高，肉眼直内源性酶的干印迹 接可见，检测手扰，分辨率低， 段多样 有些底物对人体 有害 125131I或I γ计数仪、放射易于直接标记，半衰期短，对人免疫印迹、定性 自显影 灵敏度高 体有害 定量免疫分析 生物合成 放射自显影、β不损伤抗体、操半衰期短，敏感免疫印迹、定性 计数仪 作简便 性低，需杂交瘤定量免疫分析 细胞 胶体金 显微镜、电镜、特异性强、灵敏对试剂、玻璃器免疫组化、流式 肉眼 度高、应用范围皿内的要求极细胞术、定性定 广、可用于双重高，标记物浓度量免疫分析 和多重标记 较高 第二节 免疫组织(细胞)染色技术 一、基本概念 免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)是用经标记的特异性抗体在组织细胞原位通过特异性抗原抗体反应和化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。它将抗原抗体免疫反应的特异性、组织化学的可见性结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像与放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种细胞组织成分，如蛋白质、多肽、核酸、部分类酯、多糖、激素、病原体(寄生虫、细菌病毒)、受体、神经介质、肿瘤的标记物(抗原或相关抗原)等。是免疫学、病理生理学和蛋白质研究的重要技术手段。 免疫组织化学的全过程包括:?抗原的提取与纯化;?免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化;?将显色剂与抗体结合形成标记抗体;?组织 细胞标本的制备;?免疫细胞化学反应及呈色反应;?结果的观察与分析。 二、组织(细胞)标本的制备 (一)细胞标本的取材 1(体细胞取材方法 (1)印片法:主要用于从活组织检查标本和手术切除标本中获取细胞。首先将标本剖开，最大程度暴露组织病变区，然后将载玻片轻压于病变组织区，吸附脱落的细胞。 (2)穿刺取样涂片法:用细针穿刺从实质性器官(如肝、肾、脾、淋巴结、软组织、骨髓)的病变区吸取病变区的体液，然后进行涂片。 (3)体液沉淀涂片法:主要适用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等含细胞较少的标本，先通过离心获取细胞沉淀，经适当稀释后再进行涂片。 2(培养细胞取材方法 (1)细胞爬片法:适合于贴壁生长的培养细胞。将干净(消毒处理)的盖玻片放置入培养液中，细胞便会自然贴附在其上。 (2)涂片法:适合于悬浮生长的培养细胞。直接取悬浮生长的培养细胞或通过离心收集细胞，再经适当的洗涤和稀释后进行涂片。 3(组织材料的获取 主要通过组织切片技术获得。根据包埋剂的不同可分为:冰冻切片、石蜡切片、塑料切片、超薄切片、碳腊切片等类型。 (二)细胞和组织的固定 固定的目的是为了更好地将细胞和组织的原有形态结构及成分保留下来，让蛋白质变性，使内源性消化酶失活。对免疫组化而言，可用的固定剂种类多样，性能也不尽相同，在使用时应注意考虑不同固定剂对抗原的影响，防止抗原的弥散以及活性的丢失。 常见的固定剂有醛类(如10,的中性缓冲福尔马林，4,的多聚甲醛等)、非醛类(如碳化二亚胺、对苯醌等)、丙酮及醇类固定剂。常见的固定方法有浸入法和灌注法等。 三、免疫荧光细胞化学技术 免疫荧光细胞化学技术是利用抗原与抗体可发生特异性结合的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，进而再利用这种荧光抗体(或抗原)去检查细胞 或组织内的相应抗原(或抗体)。根据检测目的以及待检物的不同特点，免疫荧光细胞化学技术有直接法、间接法、补体法、双重荧光标记法等不同形式。 (一)荧光抗体的制备 常用的荧光素分子主要有异硫氰酸(fluorescein-5-isothiocyanate，FITC)、四乙基罗丹明(tetraethylrodamine B200，RB200)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamine isothiocyanate)、藻红蛋白(phycoerthrin，PE)等，它们在不同波长激发光的作用下可发出不同颜色的荧光。 1(异硫氰酸荧光素标记抗体的制备 (1)所需试剂及设备 1)试剂:被纯化过的单克隆抗体或多克隆抗体、FITC、pH 9,9.5的碳酸盐缓冲液(NaCO 4.3g、NaHCO 8.6g溶入到终体积为500ml的蒸馏水中)、PBS233 缓冲液(pH7.2)、DMSO; 2)材料与设备:透析袋、紫外分光光度计、Sephadex G25柱等。 (2)操作步骤 1)将纯化过的抗体放入透析袋中，在加有pH 9,9.5的碳酸盐缓冲液容器中4?透析过夜，透析后抗体被转移到一小烧杯中备用。 2)配制FITC-DMSO溶液:称取适量FITC，加入DMSO溶解，使FITC终浓度保持在1mg/ml左右。 3)按照适当比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入到透析后的抗体溶液中。(通常，当IgG的浓度为1mg/ml时，FITC的加入量为50µg,ml;当IgG的浓度为5,10mg/ml时,FITC的加入量则降为25µg,ml)。 4)将上述标记物用PBS稀释至2.5ml，室温下避光搅拌2h。 5)用Sephadex G25柱除去游离荧光素分子，收集第一个PBS洗脱峰(荧光素蛋白结合峰)，按照下式计算F/P值。 F/P,2.87×A495/A280-0.35×A495，其中A495、A280分表代表495nm、280nm下的光吸收值, 适当的F/P值应在2,4之间。 6)分装，4?避光保存备用。 2(四乙基罗丹明标记抗体的制备 (1)所需试剂与设备:四乙基罗丹明(RB200)、无水丙醇、生理盐水、pH 9,9.5的碳酸盐缓冲液(同上)、透析袋和Sephadex G50柱等。 (2)操作步骤 1)称取1g RB200和2g PCl(五氯化磷)于研钵中仔细研磨5min后加入5 10ml 无水乙醇不断搅拌5min，再用滤纸过滤上述溶液，所得滤液将被用于抗体标记。(注:RB200可在 PCl的作用下转变成磺酰氯SOCl，后者在碱性条件下52 可与蛋白质的ε-氨基结合从而实现对抗体的标记。) 2)取抗体(浓度一般在20mg/ml左右)适量，按照每ml抗体各加入1ml生理盐水和碳酸盐缓冲液的比例稀释，然后逐滴加入0.1ml RB200溶液,边加边搅拌。 3)0,4?结合12,18h，再用生理盐水透析5,7h。 4)经Sephadex G50柱层析，除去游离荧光素。 5)分装，4?避光保存备用。 3(藻红蛋白标记抗体的制备 (1)所需试剂与设备:纯化过的抗体(2.5mg/ml)、纯化过的藻红蛋白、异双功能试剂(SPDPH和SMCC):SPDP[3-(2-pyridyldithio)propionic acid N-hydroxysuccinimide ester]、SMCC [succinimidyltrans-4-(N-maleimidylmethy)cyclohexane-1-carboxlate](注:SPDP用甲醇配成1.3mg/ml浓度，SMCC用甲醇配成1.7mg/ml浓度备用)、77mg/ml二硫苏糖醇(DTT)、0.1mM N-乙基顺丁烯 ，，22二酰亚胺(N-ethy maleimide，NEM)、不含Ca、Mg的PBS、甲醇、DMSO、Sephadex G25柱和Sephacryl S-300柱等。 (2)操作步骤 1)取0.25ml保存在60,(NH)SO中的PE(4mg/ml)，经离心弃掉上清，44 并用0.25ml PBS重悬。 2)将上述重悬的PE溶液在室温下用150ml PBS透析30min，期间换液两次。 3)调整透析后的PE溶液浓度在1.4mg/ml(共约有0.7ml体积)，加入16µl SPDP，室温孵育2,3h。 4)取纯化的抗体1ml(2.5mg/ml)，加入20µl SMCC溶液，室温孵育1h，制备SMCC-抗体交联物。 5)加入30µl DTT溶液到第三步交联好的SPDP,PE中，室温孵育30min。 6)用Sephadex G25柱层析纯化SPDP,PE和SMCC-抗体交联物。 7)将纯化后的SPDP-PE和SMCC-抗体交联物混合，4?振荡过夜。 8)加入80µl的0.1mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺室温振荡孵育30min，终止反应。 9)利用Sephacryl S-300柱层析分离纯化PE标记的抗体，用PBS洗脱，收集第一个洗脱峰。 10)分装，4?避光保存备用。 4(四甲基异硫氰酸罗丹明标记抗体的制备 (1)所需试剂与设备:纯化过的抗体、四甲基异硫氰酸罗丹明、0.01M PBS(pH 8.0)、DMSO、pH 9-9.5的碳酸盐缓冲液(同前)、透析袋、Bio-Gel P-6层析柱等。 (2)操作步骤 1)取10ml抗体(6mg/ml)入透析袋在pH 9-9.5的碳酸盐缓冲液中透析过夜，将透析后的抗体转移自一小烧杯中。 2)称取四甲基异硫氰酸罗丹明1mg，用DMSO溶解制成浓度为1mg/ml的溶液。 3)取上述四甲基异硫氰酸罗丹明溶液300µl逐滴加入到透析过的抗体溶液中，室温下避光搅拌2h。 4)Bio-Gel P-6层析柱，用PBS洗脱，收集先流出的红色结合物。 5)分装，4?避光保存备用。 (二)免疫荧光细胞化学染色方法 1(直接法 (1)染色:给经过固定的细胞或组织材料滴加稀释至染色效价的荧光标记抗体，在室温或37?孵育30min。染色的整个过程，切片应被放置在湿盒中。 (2)洗片:首先倾倒掉存留的荧光抗体，然后用pH 7.2或pH 7.4的0.01M PBS洗涤两次，每次5min，最后再用蒸馏水洗去结晶盐。 (3)用50,缓冲(0.5M的磷酸盐缓冲液，pH 9,9.5)甘油封固玻片，镜检。 2(间接法 常用的间接法主要有两种:双层法和夹心法。 (1)双层法 1)吸取经适当稀释的一抗加在经过固定的组织细胞切(涂、爬)片上，在染色用的湿盒中37?孵育30min。 2)用pH 7.2的0.01M PBS洗涤两次，每次5min，最后再用吸水纸洗去残留的液体。 3)滴加荧光标记的二抗，置于湿盒中37?孵育30min，再用 PBS洗涤两次，每次5min，用吸水纸吸去残留的液体。 4)缓冲甘油封固，镜检。 (2)夹心法:是一种用未标记的抗原检测组织或细胞中的抗体的方法。 1)滴加经适当稀释的特异性抗原于经过固定的组织细胞切(涂)片上，在染色用的湿盒中37?孵育30min。 2)用pH 7.2的0.01M PBS洗涤两次，每次5min，最后再用吸水纸洗去残留的液体。 3)滴加可与抗原结合的特异性荧光标记抗体，置于湿盒中37?孵育30min。 4)用pH 7.2的0.01M PBS洗涤两次，每次5min，最后再用吸水纸洗去残留的液体。 5)缓冲甘油封镜，镜检。 (三)免疫荧光染色的检测 免疫荧光标记的组织细胞玻片可用荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜等进行检测。 四、免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是最常用的免疫细胞化学技术，借助于酶细胞化学技术而非荧光标记来检测抗原的存在。主要有酶标抗体法和非标记抗体酶法两种主要形式。 (一)酶标抗体法 1(酶标抗体的制备 可用于抗体标记的酶一般应具有以下几点:?酶催化的底物必须是特异性的，容易被显示，易于在光镜下或电镜下观察;?用于免疫化学的酶要易于获得，便于商品化和标准化;?在中性pH值时，酶应比较稳定， 标记在抗体上的酶应在1,2年内活性不变;?所形成的终产物沉淀必须稳定，不能从酶活性部位向周围组织弥散，而影响组织学定位;?酶与抗体的连接不能影响抗体的活性;?在被检测的细胞或组织中，不能存在与标记酶相同的内源性酶或作用相似的酶。常用的标记酶有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)等。 酶标抗体的制备与荧光素标记抗体的制备不同，它需借助偶联剂的作用将酶链接到抗体分子上。常用的偶联剂有戊二醛、过碘酸钠、maleimide等。这些偶联剂与抗体的结合借助于共价键相互作用，因而是不可逆的，同时，偶联剂的加入还应不影响酶和抗体的活性，不会导致酶标抗体与细胞组织的其他成分发生非特异性结合。 2(染色方法 酶标抗体的染色同样包括直接法和间接法两种，以间接法为主。间接法的染色程序主要包括以下步骤。 (1)细胞组织切(涂、爬)片的准备与固定。 (2)用PBS或其他缓冲液洗涤切片三次，每次2min，溶解除去冰冻切片上的OCT包埋剂。(但当应用ALP标记的抗体时，应禁用二甲胂酸钠缓冲液洗涤，因为后者可使ALP失活。石蜡切片在洗涤后直接进行第四步)。 (3)根据需要，用甲醇，0.3%过氧化氢处理切片15,30min，封闭内源性氧化酶的作用，PBS洗涤两次，每次2min。(应用ALP标记的抗体时可省略此过程)。 (4)在室温条件下，将切片放入到含0.05%Tween-20的PBS缓冲液中处理5min，以增强组织的通透性。 (5)用4,的Block Ace或0.01%,1%的BSA在适合中孵育切片15,25min，以阻断抗体与组织的非特应性结合。 (6)轻轻弃掉上述孵育液，根据需要滴加含0.2%BSA，0.05% NaN的经3PBS稀释的一抗。通常，每片滴加50,80µl，室温下湿盒中孵育1,2h，免疫电镜标本需要在4?下过夜。(注:此处漂洗时应与对照组分开洗涤以防交叉污染)。 (7)PBS洗涤三次，每次2min，以除去非特异性结合的吸附抗体。 (8)用含0.05%Tween-20的PBS缓冲液洗涤2min后，滴加含0.2%BSA， 1,正常血清的经PBS稀释的HRP酶标二抗，室温下湿盒内孵育45,60min。 (9)PBS洗涤三次，每次2min。 (10)显色:HRP标记抗体的显色剂为含有0.01-0.1%H0、0.01-0.05%DAB、22 0.01-0.1M Tris-HCl(pH7.4)的缓冲液。切片经PBS漂洗后，在室温黑暗条件下置入上述显色液中显色，镜检控制显色时间与速度。 (11)流水或PBS终止显色。 (12)系列乙醇脱水、Hemo-De透明、DPX封固、镜检。 (二)非标记抗体酶法 非标记抗体酶法由Sternberger等在酶标法的基础上发展而成，能有效降低背景，能最大程度保留抗体的活性，灵敏度高。主要有酶桥法(enzyme bridge method)和过氧化物酶抗过氧化物酶法(peroxidase antiperoxidase method, PAP)，又以后者的应用较为广泛。 这两种方法均需先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后在第二抗体(亦称桥抗体)的作用下，将抗酶抗体与和组织抗原结合在一起的第一抗体连结起来，进而再将酶结合在抗酶抗体，最后经呈色反应来显示抗原的分布。所不同的是，在PAP法中，通常先让抗酶抗体与酶形成复合物(如PAP复合物)，然后在桥抗体的帮助下，一次性将抗酶抗体、酶与一抗结合。 在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，同时还提高了方法的敏感性，且能节省第一抗体的用量。 1(PAP的制备 在离体条件下制备HRP与抗HRP的复合物(PAP复合物)的主要步骤如下。 (1)按常规免疫学方法制备抗HRP血清。 (2)制备PAP复合物。所需试剂包括:1mg/ml HRP溶液、2mg/ml HRP溶液、生理盐水、0.1M HCl、1M HCl、0.1M NaOH、1M NaOH、饱和硫酸铵溶液、50,硫酸铵溶液、透析液(48.6g NaCl, 1.5M NaOOCCH 30ml, 1.5M (NH4)SO 32430ml, 水5.94L)等;其步骤为: 1)取10.50ml抗HRP血清，加7.60ml HRP水溶液(1mg/ml)，混匀后，室温放置1h。 2)4?，16000g离心15min，小心弃掉上清。 3)用预冷的生理盐水溶解沉淀，4?，16000g离心15min，重复4次。 4)加15.3ml HRP水溶液(2mg/ml)，室温，持续搅拌1h。 5)用1M HCl及0.1M HCl调pH至2.3，沉淀物全部溶解变清，立即用1M及0.1M NaOH调pH至7.2。 6)慢慢加等体积的饱和硫酸铵，0?放置45min。 7)0?，35000g离心15min，所得沉淀用50%硫酸铵洗涤两次。 8)用10.50ml水溶解沉淀，置入透析袋中4?透析过夜。 9)4?离心，收集上清，加适量透析液使体积至10.50ml，分装后于4?保存。 2(PAP染色方法 染色步骤包括:?切片准备及第一抗体孵育前处理步骤同酶标抗体染色间接法的1,5步;?切片与特异性一抗4?孵育24h;?用过量的桥抗体孵育;?用离体制得的PAP复合物(常作1:30,300稀释)室温下孵育1,1.5h，使其能够被桥抗体连结在第一抗体上;?用DAB-HO液显色，镜22下控制显色程度;?系列酒精脱水，二甲苯透明，DPX封固，镜检。 五、亲合组织化学 随着免疫组织化学方法的广泛应用，一些新的技术创新也不断涌现。其中最具代表性的就是一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素(lectin)、生物素(biotin)和葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A，SPA)等被应用于免疫细胞化学技术，从而建立了SPA-HRP法、ABC法、BRAB法和LAB法等一些新的细胞组织化学技术。这些技术一方面区别于古老的组织化学的分解、置换、氧化和还原，另一方面在本质上又不属于抗原抗体反应。因此，Bayer在1976年将其命名为亲合组织化学(affinity histochemistry)。 目前，亲合组织化学包括植物凝集素与糖类、抗生物素与生物素、葡萄球菌A蛋白与IgG、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位和受体等。由于抗原与抗体的相互作用从本质上讲也是一种亲和作用，所以，抗原抗体反应亦属于亲和组织化学范畴。亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使得免疫细胞化学的敏感性得到进一步提高，更有利于在细胞或亚细胞水平对微量抗原(或抗体)的定位进行研究。 现以抗生物素-生物素免疫细胞化学染色为例，简要介绍亲和组织化学技术。 (一)抗生物素-生物素免疫细胞化学染色的原理 人们对抗生物素-生物素亲和作用的发现源于养殖实践。研究发现，来自饲料中的鸡蛋白成分中的抗生物素(又称卵白素，avidin)能和生物素(又称维生素H)结合，从而导致“维生素H缺乏症”的发生。进一步研究发现，抗生物素与生物素的这种亲和力远比抗原与抗体间的亲和力要高出100万倍，且不会影响彼此的生物活性。免疫细胞化学工作者受这一特殊现象的启发，便建立起来了抗生物素-生物素免疫细胞化学染色方法。 (二)抗生物素-生物素免疫细胞化学染色方法 常见的抗生物素-生物素免疫细胞化学染色方法主要有抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术(avidin biotin-peroxidase complex technique，ABC法)、桥抗生物素-生物素技术(bridged avidin-biotin technique，BRAB法)、标记生物素-抗生物素技术(labelled avidin-biotin technique，LAB法)三种，其中以抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术最为常用。 1(抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术(ABC)的原理 利用抗生物素分别将生物素标记的二抗和生物素标记的酶连接起来。与LAB法和BRAB法不同之处在于:?一抗不被标记物所标记;?生物素标记的二抗与ABC复合物相连接。ABC复合物是通过先将过氧化酶结合在生物素上、再将生物素-过氧化酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的。 ABC法具有特异性强、敏感度高、背景染色浅等优点。 2(所需试剂 特异性抗体(单克隆或多克隆);生物素标记的二抗;ABC复合物〔经验表明，当生物素与抗生物素的摩尔浓度之比为1:4时，能获得最佳满意效果，宜在应用前30min用0.05M 的Tris-HCl液(pH7.6)进行配制〕;丙酮;0.01M PBS(pH 7.2-7.6);DAB-HO液〔含0.05,DAB、0.05M的TB液(0.5M Tris-HCl22 液+8.5g NaCl, 加水定容到1000ml， pH7.6)、0.01% HO〕;0.05M Tris-HCl液22 (pH7.6);抗体稀释液(含0.1%BSA、0.02%KHPO、0.29%NaHPO?12HO、242420.8%NaCl、0.02%KCl、0.05%Tween-20溶液 50μl);DPX(Distren 10g+5ml酸二丁+35ml二甲苯)。 3(操作步骤 (1)切片的处理:细胞涂(爬)片用含丙酮的福尔马林固定液固定30s;冰冻切片可用丙酮固定10min左右，0.01M PBS洗涤3次，每次5min;石蜡切片需先经脱蜡，然后用系列酒精脱水。 (2)加入一抗，室温孵育15min或4?孵育24h。 (3)用PBS洗涤3次，每次5min。 (4)加生物素标记的第二抗体，室温孵育2h。 (5)用PBS洗涤3次，每次5min。 (6)加ABC复合物室温作用30min。 (7)用PBS洗涤3次，每次5min。 (8)用DAB-HO液显色，镜下控制显色程度。 22 (9)苏木素复染。 (10)系列酒精脱水，二甲苯透明，DPX封固，镜检。 第三节 免疫沉淀与免疫共沉淀 一、基本概念 免疫沉淀(immunoprecipitation)是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原(常为靶蛋白)从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。 免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。与酵母双杂交技术不同，免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应，是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。 不难看出，免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。 二、抗体的选择 (一)多克隆抗体 多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多，常会导致反映本底(是否是背景)升高和一定的假阳性结果。 (二)单克隆抗体 与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。但反过来，单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。 三、免疫沉淀方法 免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。若为前者，免疫沉淀后再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，只需压片即可检测到靶蛋白的存在;若为后者，经免疫沉淀和聚丙烯酰凝胶电泳后，尚需借助银染或免疫印迹进行鉴定。 (一)所需试剂及溶液 改良的RIPA液(细胞裂解液)、稀释缓冲液(常用PBS溶液)、TSA溶液、0.05mol/lTris(pH6.8)、2×SDS蛋白上样缓冲液、抗体与Sepharose或抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白G的交联物。 改良的RIPA液的组成(100ml体系):Tris-HCl: 50 mM(pH 7.4)、NP-40: 1%脱氧胆酸钠(0.25%)、NaCl(150 mM)、EDTA(1 mM)、PMSF(1 mM)、抑肽酶、亮肽酶素、抑肽素(各1µg /ml)、NaVO(1 mM)、NaF(1 mM)。 34 (二)方法 1(用冰冷的PBS溶液洗涤贴壁细胞两次，弃干净PBS。(对于悬浮细胞则用台式离心机以800-1000rpm转速通过离心洗涤)。 72(给细胞培养瓶中加入冰冷的改良RIPA液，RIPA液的用量:按照1 ml/10 262细胞/100mm 培养面/150cm瓶或 0.5 ml每5×10 细胞/60mm 培养面/75cm 瓶计算。 3(用经蒸馏水预冷的橡皮或塑料细胞刮棒将贴壁细胞转移至一离心管中，轻轻混匀细胞悬液，用振荡器在4?振荡15min以裂解细胞。 4(于4?，14000g离心裂解液15min，迅速转移上清至另一离心管中，弃掉沉淀。 5(准备蛋白A(蛋白G或Sepharose):用PBS洗涤蛋白A(蛋白G或Sepharose)珠子两次，并将其用PBS调制成50,悬液。 6(每1ml细胞裂解液上清加入100µl蛋白A，4?，振荡10min，进行预清除。 7(4?，14000g离心10min移去蛋白A(蛋白G或Sepharose)珠子，转移上清至一新离心管中。 8(用Bradford法(考马斯亮蓝染色法)测定蛋白浓度。(应至少将细胞裂解液作1:10稀释后再测定，这是因为存在于裂解液中的去污剂成分会干扰考马斯亮蓝的作用)。 9(根据所测得的细胞裂解液蛋白浓度，用PBS将其稀释至1mg/ml以降低缓冲体系中去污剂的浓度(但对于那些在细胞中表达水平较低的蛋白而言，10mg/ml这样更高的浓度可能对免疫沉淀更有效一些)。 10(加入推荐体积的免疫沉淀抗体至500µl细胞裂解液中。(抗体的最适用量要根据每一细胞模型中免疫沉淀靶蛋白的数量来确定)。 11(将细胞裂解液与抗体轻轻混匀后孵育2h，或置摇床上振荡4?过夜。(选择孵育2h常用于免疫沉淀与激酶或磷酸酯酶作用的活化酶。)加入100µl蛋白A(蛋白G或Sepharose)轻轻振荡1h或4?过夜以捕获免疫沉淀复合物。(在多数情况下，加入2µg像兔抗小鼠IgG这样的桥连抗体可以增强对免疫复合物的捕获能力，这对于像小鼠IgG或由鸡所产生的低亲和力抗体尤为重要)。 1 12(通过脉冲离心(14000 rpm，5s)收集琼脂糖/Sepharose珠子，弃掉上清，用800µl冰冷的改良RIPA缓冲液洗涤珠子3次。 13(将琼脂糖/Sepharose珠子重悬于60µl 2×SDS蛋白上样缓冲液中，轻混均匀后煮沸5min，200g离心1min弃掉珠子。 14(将上清转移至一新离心管中-20?冻存或进行SDS-PAGE电泳。 第四节 免疫印迹 一、概述 免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该方法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术，既具有凝胶电泳的高分辨率又具备固相免疫测定的高特异性和高灵敏性，可检测1,5ng的中等大小蛋白。其优点是方法简便、标本可长期保存、结果便于比较，故被广泛应用于分子生物学等领域，成为一种常用的一种研究方法。 在此法中，首先将含有靶蛋白(抗原)的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或非变性电泳(Native-PAGE)等分离后，再通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后再通过抗原抗体反应对膜表面的靶蛋白进行特异性检测。 二、实验方法 免疫印迹的实验程序包括以下5个主要步骤:?样品的制备;?凝胶电泳分离样品;?电转移;?封闭膜上的非特异性结合部位;?靶蛋白的检测。 (一)样品的制备 用于免疫印迹的蛋白样品主要有三个来源:?蛋白溶液;?细胞裂解液;?免疫沉淀蛋白。现以如何从细胞中获取蛋白样品为例介绍样品的制备方法。 1(所需试剂 (1)不含DTT的Laemmli样品缓冲液(裂解液):20% SDS，10,甘油，60mM Tris(pH 6.8)，0.01,溴酚蓝; (2)1M DTT(,20?冻存); (3)0.01M PBS(pH 7.2)。 2(实验步骤 (1)用适量PBS洗涤细胞两次，弃干净洗液; (2)根据培养细胞的数量加入相应体积的裂解液。通常，每1g细胞(约910个)加入1ml裂解液，并用细胞刮棒将细胞刮入到离心管中; (3)加入10倍体积的样品缓冲液，强力混匀; (4)最大强度超声4次，每次15,30s，在每次超声间隔期，将样品置于冰浴中15s; (5)70?水浴至少5min; (6)10000g离心10min，取上清液并转移置一新离心管中(若不需立即使用，可将样品在,20?稳定保存数月)。 (二)凝胶电泳 SDS-PAGE是分离蛋白最常用的方法，但其他方法如等电聚焦(IEF)、双向电泳(IEF和SDS-PAGE)同样可用。在选择电泳方法及电泳条件时应注意以下几个问题;?凝胶电泳缓冲液一定要与印迹膜的类型相匹配;?上样蛋白总量应不能使电泳条带发生变形;?分离胶的浓度要与待分离样品的分子量相适应。 SDS-PAGE电泳的方法请参考常规分子生物学实验方法。 (三)电转移 1(所需试剂 (1)转移缓冲液:39mM甘氨酸，48mM Tris-HCl, 0.037,SDS，20,甲醇; (2)考马斯亮蓝染液; (3)蒸馏水或去离子水。 2(实验步骤(半干电转法) (1)用蒸馏水淋洗半干装置的平板电极; (2)将凝胶切成适当大小用于电转，除去无关部分凝胶和未使用的泳道，做好凝胶标记; (3)剪取6张吸水纸(Whatman 3MM 或替代品)和一张硝酸纤维素滤膜(戴手套操作); (4)将硝酸纤维素滤膜浸入蒸馏水中2,5min; (5)将吸水纸放入转印缓冲液中浸湿; (6)将凝胶、硝酸纤维素滤膜、滤纸放在平板装置底部，在检查极性、有无气泡后接通电源进行转印; (7)转印结束后，给膜作上标记，用考马斯亮蓝对凝胶进行染色以验证转印的效果。 (四)封闭 1(封闭液 5,脱脂奶粉，0.01的防沫剂(antifoam)，0.02,叠氮钠溶于PBS中。 2(实验步骤 (1)将硝酸纤维素滤膜放在一张干净的滤纸上，室温干燥30,60min; (2)将硝酸纤维素滤膜转移至一平皿中，加入可以浸末滤膜量的封闭液室温振荡1,3h。 (五)抗原抗体反应检测靶蛋白 免疫印迹试验中对靶蛋白的检测既可以采用直接法，也可以采用间接法。用标记的一抗直接检测的优点在于:膜的背景较低、简单、快捷，并且减少了交叉反应的机会，但其灵敏度明显低于间接法。除非在特殊情况下使用直接法，通常免疫印迹均采用间接法:一抗通常未标记，而是借助二抗的酶标记进行放大显色，借以显示靶蛋白。 1(所需试剂 (1)一抗的稀释(用封闭液) 多克隆抗体:1:100,1:5000 杂交瘤细胞培养上清:不作稀释或1:100 荷瘤小鼠腹水:1:1000,1:10000 (2)漂洗液I:0.01M PBS(pH7.2) (3)漂洗液II:150mM NaCl，50mM Tris-HCl(pH7.5) (4)封闭液:同前。 2(实验步骤 (1)从封闭液中将膜取出，用PBS冲洗两次，每次5min; 22(2)加入抗体，抗体用量为10ml,15×15cm膜，0.5ml,15×0.5cm膜，置一塑料袋中封存。抗体在使用前已经封闭液稀释; (3)室温下轻轻振荡孵育1h; (4)漂洗液I洗涤1次，10min; (5)将膜转移到另一塑料袋中，加入标记好的且经封闭液稀释的二抗，抗体用量同第2步; (6)室温下轻轻振荡孵育1,2h。 (7)取出滤膜，用大量漂洗液II洗涤3,5次，每次10min，以除去未结合之二抗。 (8)显色:(以辣根过氧化物酶标记的抗体为例，常采用二氨基联苯胺(DAB)为底物:称取6mg DAB 溶于10ml 50mM 的Tris-HCl中,经Whatman滤纸过滤后,加入10μl 30%过氧化氢即可)。 2(9)方法:将膜置入一适当容器中，按照10ml/15×15cm膜加入底物溶液，在室温下摇动显色至样品带出现时，随后用含20mM EDTA的PBS停止反应，室温晾干保存滤膜用于结果分析。 第五节 抗体芯片 一、蛋白芯片与抗体芯片 (一)蛋白芯片概述 由于基因转录水平的研究只能在一定程度上反映基因表达产物的变化，而真正发挥功能的蛋白要经过转录后加工、翻译调控以及翻译后加工等许多步骤和调控才能形成，因而对蛋白质的直接研究才能真实的解释各种生命现象。但是目前研究蛋白质的手段和方法还没有很大的发展，所以寻找有效、快捷的蛋白分析技术成为了至关重要的一个环节。蛋白芯片技术的出现给蛋白组学研究带来新思路。蛋白质芯片也叫蛋白质微阵列 ( protein microarray)，是将大量蛋白质有规律地固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、受体与配体、抗原与抗体、蛋白质与其他小分子之间的相互作用，借以检测和分析蛋白质的一种技术。 蛋白质芯片的应运而生既是基因芯片功能的延续又是进行蛋白组学研究的需要。作为一种高通量的生物芯片技术，蛋白质芯片被广泛应用于构建蛋白质表达谱，进行抗原-抗体筛选，药物靶点筛选，蛋白质-蛋白质相互作用等蛋白组学研究。 蛋白质芯片主要有无活性(non living)和活性(living)两种形式。无活性的蛋白质芯片是通过将已经合成好的蛋白质探针点在芯片上制成，而有活性的芯片则是在芯片上直接点上生物体 (如细菌 ) ，通过在芯片上原位表达蛋白质来 发挥作用。活性芯片可以提供模拟的机体内环境，对于蛋白质功能分析更为有利一些。 (二)抗体芯片 利用蛋白质芯片分析蛋白质功能已成为一种趋势。通常，一个蛋白质芯片上可以容纳一种蛋白质的所有变异体，一个蛋白质家族的所有成员，一条信号通路中的所有蛋白质，甚至是来自一种组织、器官或有机体的所有蛋白。蛋白质芯片利用位于芯片表面上的探针来捕获各种待检测的蛋白质，最常用的探针是抗体，这是由于抗原-抗体的反应有着非常强的特异性。这种以各种抗体为探针的蛋白质芯片常被称作抗体芯片。 作为一种重要的蛋白质芯片类型，抗体芯片已经成为蛋白芯片中发展最快、技术更成熟的生物芯片。第一张商品化的抗体芯片是由美国BD Clontech公司推出的Ab Microarray 380。这是一张用于研究的抗体芯片，该芯片上排列了378种已知蛋白的单抗，这些单抗对应的蛋白都是细胞结构和功能上十分重要的蛋白，涉及信号传导、肿瘤发生、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡等广泛的领域。Ab Microarray 380上所点的抗体都是经过精心挑选的，这些抗体不仅可以识别人源的蛋白，对小鼠和大鼠样品同样有效。同时，每个抗体的结合亲和力都经过了实验测定，从多种抗体来源的克隆中筛选出反应特异性好，交叉反应程度小，信号明显的抗体，保证了信号与抗原浓度有着良好的线性关系。通过这张芯片，我们在一次实验中就能够比较几百种蛋白的表达变化。目前，已有一大批抗体芯片面市，其中有的抗体芯片已经在向临床应用上发展，成为重要的诊断工具，如肿瘤标志物抗体芯片等。 二、常规抗体芯片制作与检测的 常规的活性抗体芯片制作与检测的流程主要包含以下步骤:?利用噬菌体展示技术制备抗体文库;?利用机器人将抗体文库以阵列形式固定在芯片载体上;?分别从对照(如正常组织)和待检样品(如病变组织)中提取蛋白质组;?利用不同的标记物对所提取的蛋白质组进行适当的标记;?将标记过的蛋白质组与芯片进行抗原-抗体反应，再经洗脱除去未反应(结合)的蛋白;?通过酶联免疫吸附(ELISA)、荧光扫描、质谱仪等检测分析结果。 图1-2-1 抗体芯片检测流程 常用的抗体检测芯片与上述活性抗体芯片的差别在于，直接将抗体点样而制 成的无活性蛋白质芯片，这种芯片的检测的流程如图1-2-1所示。 (潍坊医学院 潘智芳、高志芹、于文静)