实验一植物分生区细胞染色体制片与有丝分裂过程的观察 - 植物生产

实验一植物分生区细胞染色体制片与有丝分裂过程的观察 - 植物生产 目 录 实验室工作规程............................................ 1 实验一 植物分生区细胞染色体制片与有丝分裂过程的观察 ..... 4 实验二 核型分析 ........................................ 10 实验三 植物同源多倍体的人工诱发与鉴定 .................. 12 实验四 植物性状遗传率估算 .............................. 17 实验五 性状杂种优势与显性程度估算 ...................... 19 实验六 控制性状最少基因数目估算 ........................ 21 实验七 过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳 .............. 23 附 录 .................................................. 32 附录? 常用试剂的配制 ................................ 32 附录? 常用染色液的配制 .............................. 35 附录? 常用缓冲液的配制 .............................. 38 2附录? X值 ......................................... 39 实验室工作规程 为保证遗传学实验能正常进行并获得理想的实验结果，避免在实验中发生差错和意外事故，实验操作者必须严格遵守实验室规则，认真做好实验前后和实验过程中的各项工作。 一、基本规则 1(实验前必须预习，明确本次实验的目的、原理、内容和方法。实验时须保持安静，按实验教材和指导教师的要求进行操作，并详实实验中出现的情况和获得的实验结果，对资料进行整理分析，得出结论，写出实验报告。 2(实验室、工作台、各种仪器、用具、玻璃器皿等必须保持清洁整齐，工作台要严防酸、碱腐蚀。各种化学药品、试剂等必须贴上标签，分门别类，放置一定位置，便于取用。 3(正确使用显微镜及各种仪器，切勿使染料或试剂沾污镜头、镜台和所用仪器。如有沾污，须立即用镜头纸擦拭干净。 4(取用药品时，所用各类量具必须分开，严禁混用，用后须立即冲洗干净。称量固体药品时，必须在秤盘上铺垫清洁白纸或蜡光纸，调试平衡后再称，以防药品腐蚀秤具。称量纸要做到一称一换，以防药品混杂，导致所配试剂不纯。 5(遵守化学实验的操作要求，注意药品配制和使用时的安全。 6(实验完毕，须做好清洁整理工作，所用仪器、物品应放还原处。实验过程中如有损坏或丢失仪器用具，应如实填写报告单，视情况进行相应处理。 7(全班实验结束后，值日生安排整个实验室的全面清理打扫。离开实验室前，必须关闭所用仪器和灯具的电源，关紧水龙头和门窗。 二、显微镜的清洁和保养 显微镜是遗传学实验的重要仪器，使用时必须防尘、防高温、防湿、防药品侵蚀，在清洁保养中要做到以下几点: 1(取镜时必须一手提镜臂，一手托镜底，防止显微镜滑落损坏。 2(取出显微镜后，先用软毛刷、纱布拂擦镜身的防尘污物，用洗耳球吹去缝隙及镜头上的灰尘和纤维等物，再用镜头纸擦拭物镜和目镜，最后用细白丝绸把镜头再擦一次。 3(镜检时物镜只能由低倍镜到高倍镜，在高倍镜下只能用微调螺旋调焦，细心操作，以防压碎玻片，损坏镜头。 4(若发现镜头被药物或脏物污染，立即用擦镜纸醮少许二甲苯(以刚湿润纸为度)擦 1 掉污物，再用擦镜纸擦干。 5(用完显微镜后进行清洁整理，将载物台放至最低处，转动物镜使之不要对着聚光镜，将显微镜放回原处。 6(严禁将显微镜与化学药品混藏。 三、玻璃器皿的清洁 实验室所用玻璃器皿的清洁与否直接影响实验结果，实验前必须对玻璃器皿彻底清洗。 (一)初用玻璃器皿的清洗 1(新购置的玻璃器皿表面常附有游离的碱性物质，可先用肥皂水或去污粉洗刷，再用清水冲洗干净，然后用1,,2,的盐酸浸泡4h以上，再用清水冲洗后用蒸馏水冲洗2,3次，100?,130?烘干备用。 2(新载玻片和盖玻片分别在盐酸乙醇[70,,95,工业乙醇(CHOH)100ml加浓盐酸25 (HCl)2ml]中浸泡4h，流水冲净，蒸馏水荡涤、晾干，置95,乙醇中加盖，以便随时取用。 (二)使用过的玻璃器皿的清洗 1(使用过的器皿应在未干前洗涤，如不能及时清洗，应浸在凉水中。洗涤方法:放入洗衣粉水中煮沸半小时，刷洗，清水冲净，蒸馏水荡涤，晾干或烘干;或在洗涤液中浸泡半小时，清水冲洗，蒸馏水荡涤，晾干或烘干。 2(对移液管、滴定管、量筒、量器等，使用后应立即浸泡于凉水中，避免残留的溶液干涸，难以清洗。工作完毕后用流水冲洗，除去附着的试剂、蛋白质等物质，晾干后浸泡在铬酸洗液中4,6h或过夜，再用清水充分冲洗，最后用蒸馏水冲洗2,4次，风干后备用。 注:铬酸洗液配制方法 重铬酸钾,KCrO, 20g～浓硫酸,HSO～工业用～比重1.84,22724 或废硫酸100ml～清水100ml。先将重铬酸钾溶于温水～冷却后徐徐加入浓硫酸～避免发热。此液呈红色～加盖防氧化变质～反复使用至变蓝黑色为止。器皿玻片洗净后再用此液浸泡～可延长其使用时间。 3(陈旧或用过的永久制片的玻片，可先在肥皂水中煮沸5,10min，或将玻片微热后浸入二甲苯中脱胶，洗去残留的树胶和浆糊，并用清水冲洗干净。然后放入洗液中浸泡30min，再用清水冲洗掉残留的洗液，最后用蒸馏水洗净，置95,乙醇中保存备用。 四、玻璃器皿的干燥和灭菌 遗传学实验中以微生物为实验材料时，实验所用的玻璃器皿必须干燥和高温灭菌，防止杂菌污染。 2 (一)干燥 干燥的方法有自然晾干和烘干两种。自然晾干所需时间长，但器皿上无水渍。烘干是将器皿及其它用具置60?,80?烘箱中干燥，但器皿上可能留有水渍，因此，在干燥之前应尽可能除去器皿上的水滴。 (二)灭菌 因高温能使微生物蛋白质变性，所以高温处理能达到灭菌的目的。高温灭菌的方法有干热灭菌法和湿热高压灭菌法两种。 1(干热灭菌法 将器皿及用具置160? 2h，即可利用热空气杀死所有微生物及芽孢。在干热灭菌过程中要注意: (1)烘箱内忌放易燃、易挥发物品，物品不能装得太满，棉塞等物品不能接触烘箱壁，以免发生燃烧事故。 (2)烘箱温度达100?以上后，切忌打开烘箱玻璃门，否则新鲜空气进入会引起燃烧，或因剧烈的冷热变化而使玻璃器皿爆裂。 2(湿热高压灭菌法 此法高温与高压结合，蒸汽传热均匀，灭菌时间短，效果好。常用各种高压蒸汽灭菌锅 2进行灭菌。一般当蒸汽压力达15,20 lb/in、温度达121?,125?时，保持20,40min即可达到满意的效果。用此法灭菌应注意: (1)灭菌锅内水量要适当，过少会烧干而发生事故，过多会导致消毒物品水湿。 (2)灭菌开始时打开放气阀，加热使蒸汽将锅内的冷气排出，然后再关上放气阀继续加热。否则灭菌效果不好。 (3)灭菌加热时要随时注意压力变化，如压力指针超过红色警戒线而安全阀仍未放气，则可能是安全阀失灵，应立即停止加热，以防爆炸。 (4)溶液或培养基灭菌后不能立即放气， 以免器皿炸裂或溶液喷出，需待其自然冷却，压力降至零时才可打开放气阀，揭开锅盖。 3 实验一 植物分生区细胞染色体制片与有丝分裂过程的观察 [实验目的] 1. 学习并掌握根尖或叶片材料处理、染色、压片及制片观察的方法。 2. 观察有丝分裂各时期染色体的形态变化，了解有丝分裂全过程。 [实验原理] 熟悉有丝分裂过程、掌握有丝分裂染色体制片方法与技术是研究染色体形态结构、检查染色体数目、进行核型分析与带型分析的基础。 高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎尖生长点及幼叶等器官的分生组织(分生区)，这些分生组织均可以用作制片材料;另外愈伤组织、悬浮培养物等分生组织也可用作制片材料。其中根尖是最常用的材料，其原因有以下几个方面:?根尖取材容易，操作和鉴定也比其它器官与组织方便;?实验室内采用种子萌发后所长出的新鲜幼嫩根尖，不受植物生长季节的影响和限制，并且可以大量获得;?对于某些珍贵而又稀少的试验材料，取用自然条件下生长植株的根尖，比取用茎尖、花器等对材料的伤害要小得多;?采用实验室内种子发根，切取根尖后的种苗通常还可以进行正常种植，利于后续研究进行。 对于特别珍稀的材料，如转基因植株花药或花粉培养诱导出的花粉植株、孤雌生殖植株，以及通过克服远缘杂交的不亲和性和远缘杂种的不育性所获得的宝贵材料，没有种子或种子数目非常稀少，有时剪取幼根也会影响植株的生活力。另外，有些植物根尖小、取材不方便或根尖压片较难(如高梁)。这些情况下采用叶片压片法对材料的伤害是最小的，取材也非常方便，而且可以免去实验室发根工作。 有丝分裂期在整个细胞周期中所占的时间相对较短，有丝分裂制片的主要目的是进行染色体鉴定，希望观察到更多分裂相,尤其是分裂中期相，通常要对材料进行不同的预处理。预处理主要通过抑制和破坏纺锤丝的形成来获得更多的中期分裂相;同时，预处理还可改变细胞质的粘度，促使染色体缩短和分散，便于压片和观察。常用的预处理有物理法、化学法、混合处理法等。 植物细胞的细胞壁对细胞形态和结构起支撑和保护作用，分生组织的细胞壁结构将分生细胞结合成一个整体，因此在压片之前需要采用适当方法软化或部分分解细胞壁使细胞间易于分离，这一操作称为解离。同时，解离也可适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，便于观察染色体。常用的解离方法主要有酸解法和酶解法。 酸解法步骤简便、容易掌握。根尖分生组织经过酸解和压片后，都呈单细胞，但大部 4 分分裂细胞的染色体还包在细胞壁中间。酸解法广泛用于染色体计数、核型分析和染色体畸变的观察及相关分析。 酶解法常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交换研究。通过解离和压片，分生细胞的原生质体能够从细胞壁里压出，使染色体周围不带有细胞质或仅有少量细胞质，让后续制片处理直接作用于染色体。果树染色体的制备常用酶解法。 在普通光学显微镜下观察染色体形态结构还需要对材料进行染色，通常采用染色体染色效果好而细胞质着色少的碱性染料、酸性染料或孚尔根试剂染色。 [实验材料] , 2n=2x=12)、黑麦(, 2n=2x=14)、大麦(蚕豆(Vicia fabaSecale cerealeHordeum , 2n=2x=14)、普通小麦(Triticum aestivum, 2n=2x=42)、玉米(Zea mays, sativum 2n=2x=20)、豌豆(Pisum sativum, 2n=2x=14)、洋葱(Aillum cepa，2n,16)等根尖或幼叶，红桔(Citrus reticurata，2n=2x=18)、梨(Pyrus communic,2n=2x=34)等的幼叶或其它分生组织。 [实验器具、药品] 显微镜、恒温箱、水浴锅、计时器、培养皿、酒精灯、小烧杯、试管、载玻片、盖玻片、镊子、剪刀、刀片、解剖针、吸水纸、纱布、标签、铅笔、橡皮等常用工具。 醋酸洋红、醋酸地衣红、铁矾-苏木精、改良苯酚品红等染液， 0.1,秋水仙碱，0.002,0.004mol/L 8-羟基喹啉，饱和对二氯苯溶液或饱和α-溴萘，卡诺氏固定液，FAA固定液，冰乙酸，甲醇，无水乙醇，95,乙醇，0.1,升汞，,mol/L盐酸，,,果胶酶与纤维素酶混合液等。 [实验方法] 一、植物根尖压片法 1(发根 将蚕豆、玉米、黑麦等植物种子用0.1,升汞消毒10min，经流水冲洗，温水浸种浸泡1,2d后，置25?恒温箱中发根。待主根长到2cm左右时剪去主根(须根系植物的种子发出的主根不需剪掉)，让其充分长出侧根。待侧根长到1 ,2cm时，于适宜时间用蒸馏水洗净，将水吸干，剪取根尖0.5 ,1cm进行预处理。若以洋葱为材料，将洋葱磷茎置于盛水的烧杯口上，使洋葱鳞茎与水相接，在25?下发根。为获得尽可能多的分裂相，蚕豆根尖以上午9,10时剪取为宜，洋葱根尖以中午12:30,13:30切取为宜。 2(预处理 (1)0.1,秋水仙碱、或饱和对二氯苯水溶液、或0.002mol/L 8-羟基喹啉处理:将剪 5 下的根尖立即放入0.1,秋水仙碱、或饱和对二氯苯水溶液、或0.002mol/L 8-羟基喹啉中，以药液浸没根尖为度，处理3,4h。抑制和破坏纺锤丝的形成，使根尖细胞延迟其染色体的分离，增加中期分裂相，并使染色体分散于细胞中，以便观察计数。 (2)冷处理:将根尖放入盛有蒸馏水的指形管中，置0,4?的冰箱(或在冰水)中处理 40h，染色体数较多的实验材料可适当延长处理时间，但需注意勿使材料结冰。此法简便、24, 安全，效果也好，而且经冰水混合物处理后细胞破裂程度较小，染色体不致丢失;其染色体的收缩程度较小，常用于显带技术，有利于得到更细致丰富的染色体带型。 (3)混合药剂处理:在某些情况下，采用混合药剂处理可取得更好的效果。如:100ml对二氯苯饱和水溶液加1,2滴α-溴萘饱和液处理3,4h，0.2,秋水仙碱溶液加1滴α-溴代萘饱和水溶液处理1,2h等。应该注意采用药剂处理时温度不能过高，以10?,15?为宜。 3(固定 材料经预处理后，用流水冲洗，然后投入卡诺液?(3份甲醇?1份冰乙酸，现配现用)中固定20,24h，用95,的乙醇洗两次，转入70,乙醇中保存备用。固定的目的是将材料迅速杀死，并使染色体形态、结构尽可能保持不变和便于染色。 4(解离 常用酸解法:从70,乙醇中取出固定好的根尖?流水冲洗,min?吸水纸吸干?放入小试管中?加适量1 mol/L HCl于60?0.5?水浴解离10,15min(蚕豆根尖10min，玉米、黑麦、洋葱15min)。 对于玉米、黑麦和洋葱等，有时酸解后还可在25?下酶解20min。 5(染色 针对不同材料或希望获得不同的效果，可选择适当的染液和染色方法。用于常规染色体形态结构鉴定的染色方法很多，常用的有如下几种。 (1) 改良苯酚品红染色:若只作临时镜检观察，对解离后材料水洗并吸干，挑取根尖乳白色分生组织于载玻片上夹碎捣烂，滴加1,2滴染液，染色10,15min，压片。 (2)孚尔根反应染色:将解离材料洗净或直接转入席夫试剂于室温(最好在10?左右) 进行孚尔根染色反应1,5h或过夜，然后在漂洗液中漂洗3次，每次5,10min，再经流水冲洗5,10min，保存于45,乙酸中供压片。若材料染色不足，也可再用1,醋酸洋红复染压片。 孚尔根反应是鉴别细胞中DNA的一种组织化学方法，它仅对核及染色体中的DNA显色，颜色比较均匀一致而清晰，细胞软化较好。染色后染色体一般比较柔软，压片时较长的染色体容易相互纠缠而不便于分散。试验表明，蚕豆、小麦、黑麦、洋葱、葱、蒜、百合等均适合于孚尔根染色。 注:孚尔根染色反应材料必需采用酸解法进行解离～并且对前处理要求较高～解离时间过长～孚尔根反应会减退,减退程度还与固定剂种类有关～一般卡诺氏固定液的减退作用比FAA固定液明显。因此孚尔根反应染色可采用FAA固定材料～然后将固定材料经过50,乙醇转入水中～再转入1mol/L HCl中～于60?水浴中解离5，15min～并迅速换入1mol/L 冷HCl 6 中。解离材料经水洗1，2次或直接进行孚尔根反应。 ,3,1,醋酸洋红染色:若只作临时镜检观察，将解离水洗后的材料吸干，挑取根尖乳白色分生组织于载玻片上夹碎捣烂，滴加1,2滴染液，染色10,20min，压片。 (4)醋酸地衣红染色:将材料置盛染液的试管中，在酒精灯上加热3,5s，反复2,3 30min或更长时间。取出材料用染液压片，可在压片后稍加热以加深染色。 次，静置10, 注:由于醋酸地衣红易溶于乙醇～因此70,乙醇保存材料取出后应当充分洗净后浸入45,乙酸中再进行染色。 (5)铁矾-苏木精染色:经HCl解离后的材料用流水彻底冲洗后，转入新鲜配制的4,铁矾溶液媒染2,4h(如加温至30?,40?媒染，则可缩短至1h左右)，再用水冲洗20,25min，务必将残留的铁矾洗净。媒染后材料转入0.5,苏木精中染色2,4h或更长时间(如加入苏木精后，染液很快混浊、发黑，则表示铁矾未洗净，需重新冲洗，再行染色)，染色后用水冲洗5,10min，置45,乙酸内分色、软化10,20min(可再经1,氨水处理1min，使材料充分软化)，压片(若染色后暂时不压片，可将材料转入70,乙醇或蒸馏水保存于4?冰箱中)。 注:经染色后～除染色体能染上极深的蓝色外～细胞壁及细胞质也都能不同程度地着色,同时由于染色体吸附有媒染剂的金属离子～易变坚硬～压片后易分散。因此必需用45,乙酸处理～以使染色体呈深蓝色～而细胞质退淡～染色体软化。此法对各种植物的染色体均可染上较深的颜色、反差大、分色清晰～利于摄影和制片标本长期保存～为其他染色方法所不及。 6(压片 在经染色的材料上加一滴染液，盖上盖玻片，覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打，或以拇指垂直紧压盖片(注意勿使盖片搓动)，使材料分散压平，便于观察。 7(镜检 通常染色清晰而又分散得很好的分裂相只是少数，因此压片后要认真仔细地进行镜检。先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜或油镜仔细观察、记数或拍照。调节可变光栏与反光镜，使光线明暗合适，视场亮度适中。注意观察有丝分裂全过程的染色体形态变化，找出染色体分散好的中期细胞进行染色体计数，对好的分裂图像作上标记，以便再观察。 8(临时封片保存 制片短时间保存要防止玻片间的溶液干涸，空气进入，无法观察。临时片保存可在盖片周围滴上45,乙酸或染液，放入有湿滤纸的培养皿内，加盖后可保存数小时到一天。如制片标本符合要求，而又只需要短期(一般在一周以内)保存，可采用石蜡临时封片。用烧红解剖针挑取少量石蜡(或石蜡与凡士林等体积混合物)沿盖片周围封闭。 制作完成的制片标本要贴上标签，注明材料名称、可观察到的有丝分裂典型时期、制片 7 时间、制作者等信息。 二、植物叶片染色体压片法 1(取材 为排除叶绿素可能造成的干扰，又能取得叶片分生组织部分，各种植物均以取幼嫩的心叶或幼嫩的小叶为佳。取材时间一般于上午9:00,11:00(随植物种类而异)。 以麦类植物为例，在分蘖期取未拔节分蘖心叶，上午10:00左右逐层剥除外层绿色叶片，留下成筒状尚未伸展也无明显叶鞘结构的心叶和次心叶。剪去有叶绿素的部分，留下一段5 mm,10mm幼嫩的基部(基部为叶片分生组织区，细胞分裂活动旺盛)。为了便于区分材料的上下部位，要把两个断头剪成不同的形状，如上尖下齐。 2(预处理 取得叶片材料可采用下述方法之一进行预处理:(1) 将材料放入蒸馏水中，置1?,4?冰箱内20h左右;(2) 将材料放入0.002mol/L 8-羟基喹啉溶液内3h，然后用 将材料放入0.2,秋水仙碱溶液内2h，然后用水冲洗。 水冲洗;(3) 3(固定 经预处理以后的材料洗净后投入卡诺氏?液，固定12,20h。快速固定可在60 ?条件下，在15,60min内完成。也可采用FAA固定液进行固定。固定后用梯度浓度乙醇换洗，保存于70,乙醇中备用。 4(解离 一般叶片采用酸解法即可达到很好的解离效果，以下解离方法效果相当，可任选一种进行处理:(1) 1mol/L HCl，于60?水浴中内处理8,15min;(2) 5mol/L HCl，于室温(25?)处理8,15min;(3) 95,乙醇和浓盐酸(3:1)解离液，于室温(25?)处理5,10min，解离后流水冲洗材料。 5(染色 凡适用于根尖的染色方法均适用于叶片， 常用染色法有(1) 醋酸洋红染色;(2) 改良苯酚品红染色;(3) 铁矾-苏木精染色。通常直接用前两种染液之一进行压片即可达到较好的染色效果。采用醋酸洋红染色时可用酒精灯轻微加热来加快染色，并软化组织;如果染色不足，可在盖片四周加一滴染液，待其渗透后重新压片。采用铁矾-苏木精染色时，材料需经流水反复冲洗后，用4,铁矾溶液媒染约20min，再用流水反复冲洗后，用0.5,苏木精溶液染色1,2h，用水冲洗，保存于蒸馏水中即可压片。 6(压片 切取幼叶基部(材料齐头方)0.5mm左右，置于载玻片上用刀片切碎，加一滴染液(在用铁矾-苏木精染色时应滴加45,的乙酸)，加盖片，压片。 7(镜检 先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察。 8(临时封片保存 同根尖压片。 [注意事项] 本实验中使用的预处理化学试剂具有强烈的致癌作用，在使用过程中应严格按实验室安 8 全规则进行操作，废液应经专门回收处理以免造成环境污染。 [作业] ,(制作细胞有丝分裂前、中、后、末各期的制片一张，中期应能数清染色体数。贴上标签，注明材料名称，染色方法，制片日期和制作者姓名。 2(绘制所观察到有丝分裂典型时期的染色体图像，并简要说明各时期染色体的行为变化和特征。 9 实验二 核型分析 [实验目的] 1(学习和掌握核型分析的方法。 2(进一步了解染色体形态特征、在细胞分裂中的联会形象以及染色体组、核型及染色体数目、结构变异与生物进化的关系。 [实验原理] 因为核型分析能明确识别各个染色体的特征，通过核型分析可以了解不同物种、同一物种不同亚种、或家畜不同品种甚至同一品种不同个体之间染色体结构的差异，有助于基因定位及其它遗传分析。 [实验材料] 动、植物有丝分裂中期染色体相片。 [实验器具、药品] 不锈钢尺，小剪刀，小镊子，绘图纸，粘剂，座标纸等。 [实验方法] 1(准备染色体标本的相片 将制作的细胞轮廓清楚，染色体集中而不重叠，主、次缢痕和随体清晰，染色体长度适中而不弯曲的染色体标本，通过显微摄影(或描绘)、冲洗、放大成染色体相片。 2(染色体测量 目测相片上每条染色体长度，按长短顺序初步编号，写在每条染色体相片背面，用钢尺逐个测量每条染色体长度(长臂长、短臂长)，根据相片的放大倍数[放大倍数,某染色体相片上长度(μm)/ 某染色体实际长度(μm)]换算出各条染色体的实际(绝对)长度、相对长度、臂比及着丝粒位置，有随体的染色体，其随体长度和次缢痕长度可计入全长，也可不计入，但必须加以说明。将测量和计算的数据分别记录如表8-2和表8-3。 3(排列核型图 按上述及计算结果，将照片上的染色体剪贴配对，重新编号。着丝粒排在同一水平线上，短臂在上，长臂在下。排列好后进行分析比较，确定其核型是否正常。若要准确细致分析，必须进一步运用染色体显带技术。 4(绘制核型模式图 根据前面的计算结果和排列的核型图，用绘图纸和座标纸(座标纸放在绘图纸下面)绘制核型模式图。横座标为染色体序号，纵座标为染色体(臂)的相对长度，“0”为长、短臂的分界线，长臂在下，短臂在上。 10 [作业] 1(制作染色体核型图，并绘制染色体模式图。 2(简要描述实验所测核型的分析结果。 表2-2 核型分析实测记录表 实测长度mm 实测长度mm 序号 序号 (条) (条) 长臂 短臂 臂比 长臂 短臂 臂比 1 14 2 15 3 16 4 17 5 18 6 19 7 20 8 21 9 22 10 23 11 24 . 12 . . . 13 . . 表2-3 核型分析计算表 实测长度(mm) 相对长度(,) 序 号 染色体 臂比 (对) 类 型 长臂 短臂 全长 长臂 短臂 全长 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 . . . . . . 总 和 11 实验三 植物同源多倍体的人工诱发与鉴定 [实验目的] 1. 了解人工诱发同源多倍体植物的原理，初步掌握秋水仙碱诱发多倍体的方法。 2. 观察同源多倍体植物植株(器官)形态特征与细胞学特点，了解同源多倍体鉴定方法。 了解同源多倍体在生物进化与植物育种上的意义。 3. [实验原理] 植物同源多倍性变异可能通过减数分裂与有丝分裂产生。前者可能是自然界中多倍体形成的主要途径，而人工诱发植物多倍体主要通过有丝分裂过程加倍获得，秋水仙碱是最为常用而有效的处理药剂。秋水仙碱是从百合科秋水仙属的一个种——秋水仙(Colchicum L.)的器官和种子中提练出来的一种植物碱，化学分子式为CHON。纺锤丝主22256autumnala 要化学成分为蛋白质，而蛋白质分子之间由硫氢基形成二硫键聚合。秋水仙碱能抑制硫氢基，同时保持细胞活性，因此它能阻止蛋白质分子聚合，或使已构成纺锤丝的蛋白质分子间发生解聚，从而阻止分裂细胞形成纺锤丝或破坏纺锤丝。常用的有效浓度为0.01-1.0% ，木本植物采用的浓度相对较高，可达1.5% ，而蔬菜或处理幼嫩材料等适用的浓度则较低，一般不超过0.5% 。处理方法可用水溶液浸渍、涂抹或点滴植物的分生组织，使每个复制为二的染色体不能向两极分开，同时细胞也不能分裂成两个子细胞，每个细胞内染色体增加一倍，形成多倍体细胞。 经加倍的细胞，如无药剂作用，仍然能进行正常的有丝分裂，由此而产生的子细胞，一般说都是多倍性细胞。从这种细胞分化出来的植株就是多倍体。由于同一组织的不同细胞有丝分裂并不同步，如果已加倍的细胞在下一次细胞分裂时再次加倍可产生更高倍数的细胞，而出现混倍性现象。由多倍体的组织分化产生的性母细胞，经减数分裂和受精结合仍产生多倍性后代。 人工诱发的同源多倍体植物主要特征为:?器官和细胞的增大，如气孔、花器、花粉粒、种子、果实等部分明显增大;气孔数目减少而密度变稀;气孔内叶绿体数目增加。?减数分裂过程中染色体联会分离不正常、分配不平衡，配子育性降低。 鉴定多倍体植株的方法有形态学鉴定和细胞学鉴定两种。形态学鉴定是观测叶片气孔保卫细胞、花、果实、种子的形态、花粉粒大小及育性等性状的变异进行间接鉴定。细胞学鉴定观测根尖、茎尖分生组织或花粉母细胞的染色体数目，直接鉴定。 在显微镜下观测细胞或其内含物的大小时，通常需借助于目镜测微尺和镜台测微尺。一般目镜测微尺的刻度全长为5mm，分成50格或100格。镜台测微尺的刻度全长1mm，分为 12 100格，每小格长度为0.01mm。由于使用的显微镜放大倍数不同，目镜测微尺所代表的实际长度也不同，故使用前必须先求出目镜测微尺和镜台测微尺两者刻度间的换算值。具体方法是:在显微镜下把目镜中的目镜测微尺与放在载物台上的镜台测微尺两者的刻度线对准并重合，计数二者重合刻度线间的格数，然后按下式计算目镜测微尺每格的实际长度(μm)。 镜台测微尺格数，10目镜测微尺每格(m),, 目镜测微尺格数 在使用显微镜观测标本时，即移去镜台测微尺，根据目镜测微尺量出被测物体的格数，乘以换算值，即得实际长度(μm)。当变换显微镜的目镜或物镜放大倍数时，须重新计算换算值。注意不同的显微镜即使放大倍数相同，或同一显微镜非同一次使用，也必须分别测算其换算值。 [实验材料] 1. 玉米(Zea mays, 2n=20)、大麦(Hordeum vulgare，2n=14)、黑麦(Secale cereale, 2n=14)、西瓜(Citrullus vulgaris，2n=22)、蚕豆(Vicia faba，2n=12)、亚洲棉(Gossypium ，2n=26)等植物种子。 arboreum 2. 水稻(Oryza sativa, 2n=24)、大麦(H. vulgare)、西瓜(C. vulgaris)等植物幼苗(或种子)，葡萄等植物植株或插条。 3. 水稻(O. sativa)、大麦(H. vulgare)、黑麦(S. cereale)等植物二倍体和同源多倍体的种子、叶片等植株、器官新鲜材料、标本或照片。 [实验器具、药品] 普通显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺;剪刀，镊子，刀片，解剖针，载玻片，盖玻片;烧杯，广口瓶，培养皿，吸水纸，恒温箱，纱布，吸水纸等。 0.05%~0.1% 秋水仙碱溶液，无水乙醇，冰乙酸，1% I-KI溶液，1mol/L盐酸;改良苯酚品红染色液，苏木精-醋酸龙胆紫(或结晶紫);0.1%~0.2% AgNO等。 3 [实验方法] 一、植物根尖多倍体的诱发 1.将玉米、大麦、蚕豆、黑麦、西瓜等种子洗净后用水浸泡1,2d，然后摆放在铺有湿润滤纸(或纱布)的培养皿中置于25?,28?条件下发芽，芽越壮越好。当根长到1cm以上时取出洗净，将水吸干。 2.移至0.01%,0.2% 的秋水仙素溶液中，使根部浸在药液中，根尖朝下，25?条件下处理直到明显膨大为止(24h左右以至36h);另设一清水处理对照。处理过程中注意勿使药 13 液干涸。 注:在处理洋葱时，必须先剪去老根，然后置于盛满水的瓶口上，待长出新的不定根后，再行处理。 3.取出材料洗净，用卡诺氏液固定1h，以备镜检。 -1) 二、多倍体植物的诱发(参见表3 表3-1 用秋水仙碱处理部分植物诱发多倍体的技术 材 料 处理部位 药剂浓度(%) 处理时间 温度(?) 处 理 方 法 黑 麦 萌芽种子 0.1 3,5h 27 用刚张口的麦芽种子浸种。 小麦×黑麦 幼 株 0.05 4,5d 分蘖期中掘起幼苗，洗净根部浸于药剂中。 5,6片叶时洗净细根，在茎基用刀割一切口，不籼稻×粳稻 幼 株 0.05 10,11d 要损伤生长点。 油 菜 幼 苗 0.5,1.0 10d 子叶初张时滴药液于顶芽，每天2,3次。 将种子水浸24h之后，去掉种皮催芽4d，把种芽种 苗 0.5 6h 23,26 倒转幼根向上而嫩茎浸入药液。 棉 花 将种子播于纸制营养钵中，2,3片真叶时，将钵幼 株 0.5 6h 23,26 倒转使茎尖侵入药液。 西 瓜 幼 苗 0.2,0.6 2,7d 将药液滴在幼苗生长点上。 将种子放在灭过菌的盛有秋水仙碱溶液与2% 琼马铃薯 种 子 0.5 脂等量混合物的培养皿中发芽，种子萌发后洗净 并移植。 盆栽幼枝约高25cm时，去掉小叶暴露顶芽，将幼 枝 苹 果 1.0 秋水仙碱和入0.65% 琼脂内，涂到芽上，保持湿顶 芽 润，下部副芽要去掉。 甜 橙 萌芽种子 0.05,0.1 72,96h 1.种子处理 (1) 取蚕豆、亚洲棉等植物种子置0.05%,0.1% 秋水仙素溶液中(20?,25?)浸种24h，取出种子用自来水冲洗2,3次。 (2) 将种子移至放有被0.025% 秋水仙素溶液润湿下的吸水纸的培养皿中加盖，放入20?培养箱内发芽，一般处理两天就可长出幼苗。对干燥种子比浸过种的种子要多处理1天，种皮厚发芽慢的种子应先催芽后进行处理。由于秋水仙素能阻碍根系发育，所以对已发芽的种子应用较低的秋水仙素溶液处理较短的时间。 (3) 处理后取出幼苗，用自来水缓慢冲洗以免损伤，然后将幼苗移栽到大田或盆钵内，同时播种未经处理的种子幼苗作为对照。 2.幼苗处理 (1) 水稻、大麦 取已有5,6片叶的水稻或大麦幼苗，洗净根部，用刀片在分蘖处割一浅伤口，然后浸入0.05% 秋水仙碱溶液中，在20?,25?条件下处理4,5d，并保持足够的光线。处理后用水洗净幼苗进行盆栽，以便与对照观察比较。 (2) 西瓜 先将二倍体西瓜种子浸种催芽，当胚根长到1cm,1.5cm时，将胚根倒置于0.2%,0.4% 秋水仙素溶液的培养皿中置25?温度下浸渍20,24h，注意处理时需要用湿滤 14 纸将根盖好，避免失水。处理后的幼苗，经水洗进行栽种或砂培。另外也可以采用田间处理幼苗的方法，即当幼苗子叶展平时，每天早晚用0.25% 或0.4% 秋水仙素溶液滴浸生长点各一次，每次1,2滴，连续处理4d，遮阴保持湿度。以上两种方法获得四倍体西瓜，用四倍体作母本与二倍体西瓜杂交，在四倍体植株上就结出三倍体种子(3n=33)。为了保证所结的种子是三倍体，常用具有黑条纹瓜皮色显性基因作为标记性状的2n品种作为父本，这样在4n×2n的后代中，凡是长出黑条纹瓜的都是3n植株，以区别4n株间偶然授粉产生4n西瓜。 3.芽处理 选用葡萄植株或插条等果树的顶芽或腋芽生长点进行处理。将芽部固定一个蘸有0.5%,0.7% 的秋水仙素棉球(最好外罩一塑料袋防止蒸发)连续处理2,3d(也可将蘸有秋水仙素的棉球涂抹生长点)，处理后反复用清水冲洗生长点。待进一步生长后，再进行观察和鉴定。 三、多倍体鉴定 1.植株形态特征的观察与鉴定 观察比较水稻、大麦、黑麦等植物二倍体和同源多倍体植株、穗、种子等标本或照片;比较鉴定二倍体和多倍体在形态上的主要区别。 2.叶片气孔保卫细胞的测定 (1) 保卫细胞测量 仔细撕取二倍体和同源多倍体植株的叶片下表皮，置于载玻片上，并加1,2滴1% I-KI，盖上盖玻片。在高倍镜下用测微尺测量气孔保卫细胞的大小，分别测量10个保卫细胞的长度和宽度，求其平均值。保卫细胞的形态因物种而异，双子叶植物的保卫细胞多呈肾形，单子叶植物的保卫细胞多呈哑铃形。 (2) 气孔密度测定 将叶片表皮制片于显微镜下检查，计算每个视野气孔数，转换视野 2重复10次，求出平均值。视野面积的计算，用目镜测微尺量出视野直径，按公式S=πr求视野面积，得每平方毫米叶面积的气孔数。 (3) 保卫细胞内叶绿体数目测定 取叶片下表皮于载玻片上，滴加AgNO溶液，数秒后3加盖玻片，在显微镜下观测保卫细胞内的叶绿体数目。 3.花粉粒鉴定 取新鲜或已固定的二倍体和同源多倍体植株花蕾或颖花，以花粉涂抹于载玻片上，加1,2滴1% I-KI，盖上盖玻片。镜检观察花粉粒的形态和大小是否整齐，有无畸形。测量10,20个花粉粒直径的数值，求其平均值。 4.细胞学观察与鉴定 将秋水仙碱处理和对照材料的根尖固定，按根尖压片法(参见根尖压片法实验)进行解 15 离、染色、制片。镜检进行染色体数目鉴定。 取二倍体和同源多倍体植株的花蕾或幼穗分别固定(或取已固定材料)，采用压片或涂抹制片(参见花粉母细胞涂抹片制作)。镜检进行染色体计数及染色体联会配对行为的观察。 [注意事项] 秋水仙碱属剧毒药品，具麻醉作用，操作时切勿使药液接触皮肤和溅入眼内。 [作业] 1. 观察比较二倍体与多倍体在植株(器官)形态特征上的主要区别。 2. 观察比较多倍体和正常二倍体保卫细胞大小、气孔密度、保卫细胞内叶绿体数目以及花粉粒大小等特征。 3. 观察蚕豆根尖中期分裂细胞(15,20个/人)，记载其中染色体加倍及未加倍的细胞数目，综合全班(组)结果，测算秋水仙碱诱发多倍体细胞的频率。 4.绘制你所观察到的能够计数染色体数目的多倍性细胞图象。 5.秋水仙碱处理为什么会产生组织中细胞的混倍性(或细胞嵌合)现象?由此，秋水仙碱处理应注意些什么? 16 实验四 植物性状遗传率估算 [实验目的] 1. 学习数量性状遗传试验资料整理与基本统计参数计算方法。 2. 掌握植物性状遗传率估算的原理、方法。 了解遗传率在育种实践上的应用。 3. [实验原理] 遗传率是性状遗传方差占总方差的比率，用以度量遗传因素与环境因素对性状形成的影 响程度，是对杂种后代性状进行选择的重要指标。 植物数量遗传研究时，常用杂交亲本及杂种后代各世代群体方差估算性状的遗传率，并 2将遗传率分为广义遗传率和狭义遗传率。广义遗传率(h)指基因型方差占表现型方差的比B 2值;狭义遗传率(h)指加性方差占表现型方差的比值。 N 21. 广义遗传率(h) B''VVV,G2PE2h,，100%,，100%广义遗传率(h)的定义公式及其估算为: BB'VVPP 如供试材料为无性繁殖作物，由于个体的异质杂合性的特点，常用营养系方差(V)估计S0环境方差，以自交一代的方差(V)估计总方差，其基因型方差V,V-V，遗传率可用下式S1GS1S0估算: VV,2S!S0h,，100% BVS1 22. 狭义遗传率(h) N 2F代性状狭义遗传率(h)的定义公式及其估算为: 2B 1'VAVA22h,，100%,，100%N'VVPP V，，VV2,，FBB212,，100%VF2 [实验材料] 植物(玉米、水稻、棉花等)杂交组合六个世代同年种植的田间群体、植株(器官)标本或 其遗传试验资料，如表4-1, 4-2, 4-3。 [实验用具] 米尺或钢卷尺等;计算器。 [实验方法] 1. 性状考察与数据整理 17 分组考察各世代田间试验群体、植株(器官)标本试验性状，如:玉米果穗长度、株高， 水稻生育期，小麦株高，棉花纤维长度等。综合全班获得试验资料，并可整理成次数分布资 料。 2. 基本参数估算 分别估算各世代各性状的基本统计参数——平均值、方差与标准差。 3. 遗传参数估算 分别估算各性状的广义遗传率、狭义遗传率。 [作业] 1. 估算所试材料或相应遗传试验资料的性状遗传率。 2. 比较分析三个环境方差公式估算的结果及适用范围。 3. 分析亲本(自交系)、F、F以及回交世代群体内个体间差异的来源。 12 表4-1 小麦Funllo×鉴15-1六世代株高频数分布资料 79 83 87 91 95 99 103 107 111 115 119 123 127 131 135 株数 方差 组限(cm) | | | | | | | | | | | | | | | N V 83 87 91 95 99 103 107 111 115 119 123 127 131 135 139 组中值x 81 85 89 93 97 101 105 109 113 117 121 125 129 133 137 P(Fun110) 2 13 8 1 1 P(鉴15-1) 2 0 3 12 7 2 F 2 2 13 5 1 1 1 F 3 2 10 8 31 23 15 17 8 3 2 B 1 1 2 7 14 13 5 4 0 1 1 B 2 2 5 11 8 8 3 1 2 表4-2 水稻(矮脚南特×莲塘早)抽穗期(以6月1日为起点) 世 代 株 数 (N) 方 差 (V) 标准差 (S) (x)(d) 平均数 P(矮) 138 38.36 4.8652 2.1645 1 P(莲) 135 28.13 5.6836 2.3843 2 F 15 32.13 4.8380 2.1995 1 F 471 32.49 8.9652 2.9942 2 B 102 35.88 9.1740 3.0289 1 B 56 30.96 5.3804 2.3196 2 表4-3 烟草株高及叶长试验资料 世代 株高方差(V) 叶长方差(V) P 15.46 0.68 1 P 22.63 0.81 2 F 39.18 0.63 1 F 99.19 1.08 2 B 40.28 1.10 1 B 101.50 0.95 2 18 实验五 性状杂种优势与显性程度估算 [实验目的] 掌握性状杂种优势程度以及显性程度的估算方法与特点。 [实验原理] 杂种优势是指杂种一代(F)在产量、生活力、生长势、抗逆性及适应性等方面优于双亲1 的现象。一般用杂种优势率(RH)或杂种优势指数(IH)进行度量，并可用势能比值和平均显性度表示杂种一代与亲本数量性状之间的相互关系(显性程度)。 优势率(RH) 性状杂种优势率是杂种F性状表现优于亲本的百分率，有平均优势和1.1 超新优势两种表示方法。平均优势:F平均值同双亲的平均值比较，用百分比表示。超亲优1 势:F平均值同较好的一个亲本(HP)平均值比较，用百分比表示。 1 1F,P，P，，1122平均优势,，100%1P，P，，12 2 F,HP1超亲优势,，100%HP 2.优势指数(IH) F平均值与双亲平均值之比为优势指数，用下式估算: 1 F1IH, 1，，P，P122 3. 势能比值 在多基因系统下，假定:?基因加性效应(a)作用方向相同，且效应相等;?所有显性效应(d)作用方向也相同，并且效应相等;?双亲均为纯合体，具有k对基因差异。则F离1中亲值的差数为: 11，，，，F,P，P,dP,P,a;且两亲本的差数平均为:. ,,1121222 由于上述两个假定不能证实，所以一般将F离中亲值的差数与其两亲本的差数平均的1 比值，称为势能比值，用下式估算: 1F,P，P，，112d,2,,势能比值 1a,，，P,P122 实际应用中，令势能比值,?0.05为无显性;?0.06,?0.95为正向或负向部分显性;?0.96,?1.05为正向或负向完全显性，>+1.05或<-1.05为正向或负向超亲优势。 224.平均显性度 因加性效应方差V,?a，显性效应方差V,?d，故V和V值不受基ADAD 19 因相联度的影响，也不受显性方向的影响。平均显性度就是对显性度的直接估算，其算式如下: 2dV,D,,平均显性度 2Va,A 性状加性效应方差V和显性效应方差V可由各世代方差估计: AD V′,4V-2(V+V) AF2B1B2 V′,4(V+V-V-V) DB1B2F2E 当平均显性度,0，为无显性;>0和<1，为部分显性;,1为完全显性;>1为超显性。 [实验材料] 植物(玉米、水稻、棉花等)杂交组合六个世代同年种植的田间群体、植株(器官)标本或其遗传试验资料，如表4-1, 4-2, 4-3。 [实验用具] 米尺或钢卷尺等;计算器。 [实验方法] 1. 性状考察与数据整理 分组考察各世代田间试验群体、植株(器官)标本试验性状，如:玉米果穗长度、株高，水稻生育期，小麦株高，棉花纤维长度等。综合全班获得试验资料，并可整理成次数分布资料。 2. 基本参数估算 分别估算各世代各性状的基本统计参数——平均值、方差与标准差。 3. 遗传参数估算 分别估算各性状的杂种优势率、优势指数、势能比、平均显性度。 [作业] 1. 分析所试材料或相应遗传试验资料的性状杂种优势率及显性程度。 2. 比较分析不同杂种优势率与显性程度估算方法得到的结果。 20 实验六 控制性状最少基因数目估算 [实验目的] 了解控制性状最少基因数目的估算原理，掌握估算方法。 [实验原理] k11,,，受k对非连锁基因控制的数量性状，F基因分离与组合符合二项分布:，有2k,,222,,，1种基因型。设基因间无显隐性关系和上位性作用，即无显性方差与上位性方差，基因型 22,,,。此时如果双亲均为极端类型:一个亲本中全为正向基因，方差仅由加性方差构成:ga 另一个亲本中全为负向基因;且各个基因效应大小相同，均为a。则有: aa122npq2kka,,,,,,期望基因型方差为:; g222 22P,P,ka,(,ka),2ka两亲本之差为:。且: ; ，，，，P,P,2ka1212 1222ka,，，P,Pg212由此可得:。 ,,k,2228,，，2ka，，P,Pg12 22',,,V,V,V'其中可由各群体的基因型方差V估计，即:。 GggGFE2 在假定无显性效应及上位性效应存在的情况下，采用上式可利用P、P及F资料估计基122因数目k。但是实际上数量性状基因也常有一定程度显性，由于没有消除显性方差的影响，F代的遗传方差可能包括显性方差而加大分母值，低估基因数目。显性作用大，误差也就大。2 2,可用狭义遗传率从遗传方差中消除显性效应方差，仅用加性效应方差估计基因数目。在a这种情况下: 222,,a,ka性状的期望基因加性方差为:; ,a 22P,P,ka,(,ka),2ka两亲本之差仍为:。且:; ，，，，P,P,2ka1212 222,，，P,Pkaa12,,k,由此可得:。 2224,，，2ka，，P,Pa12 2'2,,V,4V,2，，V，V,上式中基因加性效应方差由V估计，即:。此法采用AaAFBBa212P、P、F以及B、B两个回交世代资料，在一定程度上消除了显性方差的影响，因此可以12212 更准确地估计基因数目。 但是由于以下原因，得到的基因数目一般仍然偏低。首先，加性方差与显性方差不易分开，遗传方差中包含了显性方差而夸大了分母值。即使加性方差与显性方差能分开，各基因 21 效应也可能不完全相等。其次，两亲可能分别具有正(+)向基因及负(-)向基因，而使两亲本平均数的差数小于2ka，这些都降低分子值。另外，上述估计均假定k对基因间不连锁，但事实上可能很多基因有连锁关系，以上公式是将同一连锁群的若干基因当作一个遗传单位来分析。综上所述，两种估计得到的结果实际上都只能是控制数量性状的最少基因数目。 [实验材料] 植物(小麦、水稻、烟草等)杂交组合六个世代同年种植的田间群体、植株(器官)标本或其遗传试验资料，如表4-1, 4-2, 4-3。 [实验用具] 米尺或钢卷尺等;计算器。 [实验步骤] 1. 性状考察与数据整理 分组考察各世代田间试验群体、植株(器官)标本试验性状，如:玉米果穗长度、株高，水稻生育期，小麦株高，棉花纤维长度等。综合全班获得试验资料，并可整理成次数分布资料。 2. 基本参数估算 分别估算各世代各性状的基本统计参数——平均值、方差与标准差。 3. 基因数目估计 分别采用遗传方差(未排除显性效应)及加性方差(排除显性效应)进行基因数目估计。 [作业] 1. 采用两种不同的方法估计所试材料或相应遗传试验资料的性状所涉及的最少基因数目。 2. 分析用遗传方差和加性方差两种方法得到的结果，并加以解释。 22 实验七 过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳 [实验目的] (1)使学生掌握聚丙烯酸徽凝胶垂直板电泳的原理和操作技术;学会从植物材料(小麦幼苗)分离过氧化物酶同工酶。(2)根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，签定小麦幼苗过氧化物酶同功酶。 [实验原理] 同工酶是催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。同工酸与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，测定同工酶在理论上和实践上都具有重要的意义。本实验测定的过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与植物的光合、呼吸作用以及生长素的氧化等有关;在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定过氧化物酶的生物活性或其同工酶可以了解某一时期植物体内代谢的变化。 1(电泳 带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。多年来，电泳作为一项有效的分析、分离和制备技术发展很快，在生产、科研和医疗工作中得到了广泛应用。利用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分利率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。 2(电泳具有的特点 ?凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可进行定性或定量分析 ?样品量极少 ?设备简单 ?操作简便 ?分辨率高 ?便于观察、记录和保存。 3(电泳的基本原理 在溶液中任何一个带电颗粒在电场作用下的移动大致要受到三方面的影响:?颗粒的性质，如:实际电荷，大小及形状，解离强度的难易等。?所处的环境，如:电解质或缓冲液的浓度，离子强度，pH，粘度，温度等。?应用电场的性质，如:电场强度。不同带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同，常用泳动度或迁移率来表示，迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度。其数学表达式如下: µ= v/E =(d/t)/(U/I) =dI/Ut 式中:µ 是迁移率; v 是颗粒迁移速度(cm/s或min); E 是电场强度或电势梯度(V/cm); 23 d 是颗粒移动距离(cm); I 是支持物的有效长度(cm); U 是支持物两端实际电压(V); t 是通电时间。 、I、U、t 计算出。 颗粒的迁移率可通过测量d 影响迁移率的主要因素具体讨论如下: (1)带电颗粒的性质 即净电荷数量，颗粒大小及形状。一般来说，颗粒带净电荷多，直径小而近于球形，则泳动速度快，反之则慢。 物质在电场中所受到的力(F)为: F,EQ ? 式中:E是电场强度，即单位长度支持物的电位降; Q是物质颗粒的净电荷。根据史氏定律(Stoke’slaw)。 球形分子在液体中泳动所受到的阻力(磨擦力)Fˊ为: Fˊ,6 π r η υ ? 式中:r是分子半径; η是介质粘度; υ是分子泳动速度; 6π是常数。 当颗粒半径较大时，则常数为4π，即此常数在4π,6π之间，视颗粒半径大小而定。 当物质在电场中受到的力与物质在液体中受到阻力平衡时，F,Fˊ，与?合并，即: EQ,6 π r η υ ? 2由于υ是电泳速度 (cm,s)，E 是电场强度(V,cm)，所以µ的单位是(cm/ s?V)。将?代入上式中，则: µ=Q/(6 π r η) 这就是迁移率公式。由此可见，迁移率与分子的形状、介质粘度、颗粒所带电荷有关。其与颗粒表面电荷成正比，与介质粘度及颗粒半径成反比。然而在实际电泳中，带电颗粒的迁移率总是比理想的稀溶液中要低些。因为电泳中使用的是具有一定浓度的缓冲溶液。带电荷的生物分子在电解质缓冲溶液中将带有相反电荷的离子吸引到其周围，形成一离子扩散层。在电场中，当颗粒向相反电极移动时，离子扩散层所带有的过剩电荷向颗粒泳动的反方向移动，结果，颗粒与离子扩散层之间的静电引力使颗粒的泳动速度减慢。另外，分子颗粒表面有一层水，在电场影响下，它与颗粒一起移动，可以认为是颗粒的一部分。 24 (2)电场强度 电场强度也称电位梯度，是指单位长度(每1cm)支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用，例如纸电泳，测量25cm长纸条两端电压降为250 V，则电场强度为250 V,25 cm,10 V,cm。一般电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度大小，可 100,500 V，电场强度一般是 2,10 V,cm，将电泳分为常压电泳和高压电泳。前者的电压在 分离时间需数小时至数天;后者电压可高达500,1000 V，电场强度20,2000 V,cm，电泳时间短，有时仅几分钟即可，主要用于分离氨基酸、肽、核着酸。由于电压升高，电流也随之增大，故需冷却装置。 (3)溶液的pH 溶液的pH决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少。对于蛋白质、氨基酸等两性电解质而言，溶液pH离等电点越远，颗粒所带净电荷越多，电泳速度越快，反之则越慢。例如，血清中几种主要蛋白质的等电点各不相同，白蛋白pI,4.0，α2球蛋白pI,5.06，β球蛋白等pI,5.1，γ球蛋白 pI=7.1。当在pI=8.6的缓冲液中电泳时，这些蛋白质都带负电荷，它们的泳动速度:白蛋白,α2球蛋白,β球蛋白,γ球蛋白。因此，当要分离一种蛋白质混合物时，应选择一种能使各种蛋白质所带电荷量差异明显的pH值，以利于各种蛋白质分子的解离。 (4)溶液的离子强度 溶液的离子强度是另一个重要条件。在保持足够缓冲能力前提下，离子强度要求最小。溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。通常缓冲液离子强度选择在0.05,0.1mol,L之间。在缓冲液中离子强度可用下式计算: 2 I,0.5?C?Z 式中:I一溶液的离子强度; C一离子的浓度; Z一离子的价数。 例如:求0.154 mol,L。NaCl 溶液的离子强度。 22I,0.5 ×(0.154 ×1，0.154 ×1)= 0.154 浓度大的缓冲液在合适电压下，有较低的电阻和较大的电流，产热较高。离子强度很高时要用低电压，避免过多产热，这样又导致电泳时间延长，增加变性和区带分离困难。 (5)电渗作用 在有支持物的电泳中，影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。所谓电渗就是指在电场中，液体对固体支持物的相对移动。例如在 pH 8.6时，血清蛋白质进行纸电泳时，γ球 25 蛋白与其他蛋白质一样带负电荷，应该向正极移动，然而它却向负极方向移动，这就是电渗作用的结果 滤纸的纤维间具有大量孔隙带有负电荷，如一束毛细管，进行电泳时蛋白质通过这些孔隙向前移动。由于纸的孔隙带有负电荷，与带电颗粒一样可以吸引正离子，因此介质沿管壁相对地带有较多的正电荷。在电场中，带负电荷的蛋白质向正极移动，而介质却向负阴极移动，从而对蛋白质颗粒的泳动起阻碍作用。由于γ蛋白分子颗粒大，净电荷较小移动速度慢，电渗作用大于颗粒向前泳动的力，结果γ球蛋白向后退。其他血清蛋白质因分子较小，净电荷较多，电渗作用小于分子向前移动的力，因此，电泳后γ球蛋白反而在点样位置之后(图:---电渗示意图)若电渗方向与样品电泳移动方向一致，则样品的表观迁移率就加快，反之则降低。所以电渗作用与电泳速度关系密切。根据支持介质的不同，可产生不同程度、不同方向的电渗流动。 [聚丙烯酸胺凝胶电泳] 1(聚丙烯酰胺凝胶的合成及特点 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamid gel electrophoresis, PACE)是以聚丙烯酸胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是由丙烯酰胺单体(Acrylamide，Acr)和交联剂N，Nˊ_甲叉双丙烯酰胺N，Nˊ一Methylene bisacrylamide， Bis)，在引发剂和催化剂的作用下聚合而成的。 化学聚合的引发剂是过硫酸铵(Ap)在形成中提供自由基，通过自由基传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应。催化剂是四甲基乙二胺(Tetramethyl ethylenediamine, TEMED)则可加快引发剂释放自由基的速度，具体反应是过硫酸铵在水溶液中形成一个过硫酸自由基，此自由基可以激活TEMED，TEMED作为一个电子载体提供一个未配对电子将丙烯酰胺单体转换化成丙烯酰胺自由基经反应多聚物聚合成网状结构的凝胶状，其网状孔径大小由聚合条件及单体浓度决定。 光聚合以核黄素(即VB2)作为引发剂，需要强光照射反应液和有痕量氧存在下进行。核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100毫升凝胶溶液中含有的单体(Acr) 和交联剂(Bis) 总克数称为凝胶浓度，用T,表示。凝胶溶液中，交联剂(Bis)占单体(Acr)和交联剂(Bis) 总量的百分数称为交联度，用C,表示。改变凝胶浓度(T,)和交联度(C,)，可获得不同密度、粘度、弹性、机械强度和孔径大小的凝胶，以便适应各种样品的分离。 注意事项: ?聚丙烯酰胺凝胶的基本结构是丙烯酰胺形成三维网状结构。使凝胶具有分子筛性质。 26 网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺特别适于作区带电泳的支持介质。 ?一般常用7.5,浓度的聚丙烯酸胺凝胶分离蛋白质，而用2.4,的分离核酸。但根据蛋白质与核酸分于量不同，适用的浓度也不同(见下表)。 ?Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基团体系时，他们就聚合。引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。 ?TEMED在低PH时失效，会使聚合作用延迟。冷却也可使聚合速度变慢。一些金属抑制聚合，分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制 ?光聚合时氧含量过高会抑制聚合反应。 表7-1 凝胶浓度选用 物 质 分子量范围 适用的凝胶浓度(%) 蛋白质 <104 20-30 1~104 15-20 4×104~1×105 10-15 1~5×105 5-10 >5×105 2-5 核 酸 <104 15-20 104~105 5-10 105~2×106 2-2.6 2(聚丙烯酸胺凝胶电泳的装置 电泳仪由两部分组成，即稳压稳流直流电源和缓冲液贮存系统(电泳槽)。板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽，凝胶在两块平行的玻璃板中间，因而称板状电泳(slabelectrophoresis)。板状电泳最大的优点是包括标准相对分子质量蛋白质在内的多个样品可以在同一块凝胶上在相同的条件下进行电泳，便于利用各种鉴定方法，直接比较各样品的区带，保证结果的准确可靠;还可以进行双向电泳。另外，板状电泳易散热，其结果便于照相和制干胶。板状电泳槽有垂直板和水平板电泳槽。 3(不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 本实验采用不连续的聚丙烯酸胺凝胶电泳分离小麦苗过氧化物酶同工酶。系统的不连续性表现在以下几个方面: (1)凝胶层的布连续性:凝胶由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 27 (2)缓冲液离子组成及各层凝胶的PH的布连续性:本实验采用碱性系统，电极缓冲液为pPH8.9的Tris-HCL缓冲液，浓缩胶和分离胶缓冲液均为Tris-HCl 缓冲液，但pH值分别为6.7和8.9。 (3)电位梯度的不连续性:由于pH的不连续性，在电场中形成了不连续的电位梯度。(详见后述) 在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待分离的物质很好地分开。 下面以本实验要分离的小麦过氧化物酶同工酶为例，分别说明这三种效应的作用: (1)电荷效应:各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。 (2)分子筛效应:分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快，反之，分子量大，形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。 (3)浓缩效应:待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下。?由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。这样，就在两层凝胶交界处使待分离的酶蛋白区带变窄，浓度升高。?在聚丙烯酰胺凝胶板中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶的pH为6.7，下层分离胶的pH为8.9。HCL是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl-布满整个胶板。待分离的酶蛋白样品加在顶层，浸在pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液中。 电泳一开始，有效泳动率最大的Cl-迅速跑到最前边，成为快离子(前导离子)。在pH6.7条件下解离度仅有0.1-1.0%的甘氨酸有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子(尾随离子)。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。因为电位梯度V、电流强度1和电导率S之间有如下关系: V,I / S 所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中，各种酶蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被逐步分离，形成若干条离得很近但又不同的“起跑线”。 后来，当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增， 28 有效迁移率迅速加大到超过所有酶蛋白分子，从而赶上并超过所有酶蛋白分子。此时，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不连续的高电位梯度不再存在。于是，此后的电泳过程中，酶蛋白在一个均一的电位梯度和 pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。 [实验材料、仪器及试剂] 1(材料:小麦幼苗 2(仪器:电泳仪一套(稳压电源及圆盘电泳槽)、高速冷冻离心机(10000r)、电冰箱、量筒、烧杯、注射器、注射针头、玻璃板2块、样品瓶、染色槽、移液管、离心管、试管架、玻璃棒等。 3(试剂:琼脂糖、HCl 、TEMED 、Tris 、Acr 、Bis、过硫酸铵、核黄素、甘氨酸、蔗糖溴酚蓝、联苯胺(贮液配制见附表)。 [实验步骤] 1(凝胶的制备 (1)将贮液由冰箱取出，待于室温平衡后再配制工作表液。 (2)安装玻璃板 (3)按下表比例配制分离胶: 表7-2配制分离胶比例 贮液号 1 2 3 名称 分离胶缓冲液 分离丙胶 过硫酸铵 重蒸水 体积比例 1 2 4 1 取用量(mL) 3 6 12 3 (4)制板:选取洗净烘干的玻璃板垂直放入制胶玻璃架上。玻璃板底部封闭，封闭的方法根据具体条件而定。 (5)灌分离胶:1、2号液和重蒸水放一烧杯，3号液放另一烧杯。然后小心混合两杯溶液，用长滴管取混合的溶液。沿板壁加入胶液距矮玻璃板上端2cm再加水至矮玻璃板。刚加过水可看出界面，后逐渐消失，等在看出界面时，表明分离胶已聚合。再静置20-30分钟，倒出水层，(正常情况10min开始聚合，应控制在30min,1h内聚合完成)。 (6)浓缩胶的制备:按下表比例配制浓缩胶。 29 表7-3配制浓缩胶比例 贮液号 4 5 6 7 名称 浓缩胶缓冲液 浓缩丙胶 核黄素 蔗糖 体积比例 1 2 1 4 取用量(mL) 1 2 1 4 (7)灌浓缩胶:将4、5、和蔗糖放在一烧杯，核黄素单放一烧杯。灌胶高度约2厘米，再加上梳子，然后置日光灯下聚合20分钟，待浓缩胶变成乳白色，聚合即告完成，去掉梳子。 2(样品的制备 称取小麦幼苗茎部0.5g，放入研钵内，加pH8.0提取液1毫升，于冰水浴中研成匀浆，然后以2毫升提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8000r 离心10分钟，倒出上清液，以等量40%蔗糖及1滴溴酚蓝混合，留作点样用。 3(点样、装槽 (1)点样:加样前先把凝胶板旁边的密封胶条除去，请勿将凝胶板拉坏或产生气泡。用微量注射器按顺序从凝胶板顶部加样，每个凝胶孔加15,20ul样品，稀溶液最多可加150,200ul。加样时，微量注射器的针头伸入凝胶孔的内部,但针头不要碰到胶面，缓缓加入，因样品比重较大，因此样品液自动沉降在胶面上平铺成一层。 (2)装槽:装内、外槽电极缓冲液，将稀释10倍的电极缓冲液约500 mL放入内、外槽。 (3)电泳: 在槽的一端缓慢加入电极缓冲液,不要把凝胶孔的样品冲掉。槽内的空隙完全充满电极缓冲液,不要产生气泡。按正负极接通电源，打开电泳仪(仔细观察正负极的变化)。对于垂直柱型电泳，电流控制在1,2mA/管，电泳2,3min后再升到3,5mA/管，太高的电流强度会造成产热量大，使分离失效。如果高温对样品不利，可降低电流，延长时间，或进行有效的冷却。对于垂直板型电泳，一般是，样品进胶前电流控制在15,20mA，大约15,20min;样品进入凝胶以后，再将电流调至40,50mA，保持电流强度不变。待指示染料迁移至下沿约0.5cm处停止电泳，需2-3 h。 (4)剥胶和固定:将玻璃板放入装满水的染色槽内，用5mL注射器装满水，安上10cm细针头，沿板壁内侧插入，边前进，边注水;将短板玻璃撬开，再用水缓慢冲击凝胶，直到凝胶从玻璃板上脱离。 (5)固定:放到盛有pH4.7的乙酸缓冲液的指形管中浸泡10min。 加入染色液。染色2--4h以上或过夜。 (6)染色及脱色:倒去乙酸冲液，加联苯胺淹没整个胶柱，于室温下显色20min，即 30 得到过氧化物酶同工酶的红褐色酶谱。倒掉染色液，重新加入7%的乙酸溶液，于日光灯下观察记录酶谱，绘图或照相。 ,注意事项, 1(配好的贮液用棕色瓶盛装冰箱内保存，可放1~2个月。(使用前真空泵抽气10min ) 2(过硫酸铵应当天配制。 3(如有不溶物要过滤。 4(显色液用前再混合。 (电极缓冲液用时稀释10倍。 5 【附注】 表7-4 聚丙烯酰胺电泳贮液配制方法 序号 试剂名称 配制方法 2克琼脂，100mLPH8.9分离胶缓冲液1 2%琼脂糖 (配法见后述)浸泡，用前加热熔化。 取1N HCl 48mL，Tris73.6mL，Tris0.28分离胶缓冲液，pH8.9(pH8.9Tris-HCl2 克，TEMED0.48mL，用无离子水溶解后定容缓冲液) 至100Ml 取1N HCl 48mL，Tris5.98mL，Tris5.98浓缩胶缓冲液，pH6.7(pH6.7Tris-HCl3 克，TEMED0.48mL，用无离子水溶解后定容缓冲液) 至100mL Acr 28.0克，Bis0.735克，用无离子4 分离胶丙胶贮液(Acr-Bis贮液I) 水溶解后定容至100ml，过滤除去不溶物。 Acr10克，Bis2.5克，用无离子水溶5 浓缩胶丙胶贮液(Acr-Bis贮液II) 解后定容至100ml 0.14克过硫酸铵溶于100ml无离子水6 过硫酸铵 中(当天配制) 核黄素4.0mg，无离子水溶解后定溶7 核黄素溶液 至100mL Tris克，甘氨酸28.8克，溶于无离8 电极缓冲液，pH8.3(pH8.3-甘氨酸缓冲液) 子水后定容至1000mL，用时解释10倍。 9 40%蔗糖溶液 蔗糖40克，溶于100mL无离子水中 样品提取液，pH8.0(pH8.0 Tris-HClTris12.1克，加无离子水1000mL，以10 缓冲液) HCl调节pH至8.0 11 0.5溴酚蓝溶液 0.5g溴酚蓝溶于100mL无离子水中 12 联苯胺 31 附 录 附录? 常用试剂的配制 一(百分数溶液的配制 百分比浓度有质量百分比、体积百分比和质量/体积百分比之分。 1(质量百分比浓度 是指100g溶液中含有溶质的克数，也称重量-重量百分数。用公式表示为: 质量百分比浓度(w/W)% = [溶质质量(g)/(溶质+溶剂)质量(g)]×100% 2(体积百分比浓度 指100ml溶液中含有溶质的克数。公式表示为: 体积百分比浓度(V/V)%= [溶质体积/溶液(=溶质+溶剂)体积]×100% 如45,乙酸为:冰乙酸45ml+蒸馏水55ml。 3(质量体积百分比浓度 指100ml溶剂中含有溶质的质量(g)，也叫重量体积百分比浓度。如0.1,秋水仙碱为0.1g秋水仙碱溶于100ml蒸馏水中。 用体积计算的百分数溶液没有以质量计算的准确，但比较方便，如乙醇稀释法:?以95,乙醇作母液(不要用无水乙醇)稀释到所需浓度。 二、摩尔浓度溶液的配制 摩尔浓度是指1L溶液中含有溶质的摩尔数。如配0.5mol/L蔗糖溶液，蔗糖分子量CHO,342.2g，取0.5摩尔蔗糖(171.1g)溶解于适量蒸馏水中，定容至1000ml即成。 122211 三、常用试剂的配制 (一)乙醇稀释法 不同浓度的乙醇溶液，一般用95%乙醇加蒸馏水稀释而成。例如:配70,乙醇可取95,乙醇70ml，加蒸馏水到95ml即成。配50,乙醇，取70,乙醇50ml加水至70ml或取95,乙醇50ml，加水至95ml。 以两种不同浓度的溶液配制所需浓度的溶液，可采用交叉稀释法。方法如图?-1所示。 甲液浓度(95,乙醇)? ?甲液需取量ml(乙液与待配浓度之差,15) 待配浓度(50,乙醇) 乙液浓度(35,乙醇)? ?乙液需取量ml(甲液与待配浓度之差,45) 图?-1 交叉稀释法示意图 32 例如，用95,乙醇和35,的乙醇配制50,乙醇。取95,乙醇15ml，35,乙醇45ml混和即成。其它溶液的配制与此相似。 (二)常用酸碱溶液的配制 不同摩尔浓度常用酸碱溶液的配制见表?-1。 表?-1 不同摩尔浓度常用酸碱溶液的配制 配制溶液的浓度(mol/L) 名称 (分子式) 比重 (d) 含量 (w/W%) 配 制 方 法 6 2 1 0.5 量取所需浓度酸，缓缓加入适量水中， 盐 酸(HCl) 1.18,1.19 36,38 500 167 83 42 并不断搅拌，待冷却后定容至1L 硝 酸(HNO) 1.39,1.40 65.0,68.0 381 128 64 32 量取所需浓度酸，加水稀释成1L 3 量取所需浓度酸，缓缓加入适量水中， 硫 酸(HSO) 1.83,1.84 95.0,98.0 334 112 56 28 24并不断搅拌，待冷却后定容至1L 磷 酸(HPO) 1.69 85 348 108 54 27 同盐酸 34 冰乙酸1.05 70 500 167 83 42 同盐酸 (CHCOOH) 3 氢氧化钠称取所需试剂，溶于适量水中， 2.1 40(分子量) 240 80 40 20 (NaOH) 不断搅拌，冷却后用水稀释至儿 氢氧化钾(KOH) 2.0 56.11(分子量) 339 113 56.5 28 同氢氧化钠 注:配制1L溶液所需要的毫升数(固体试剂为克数)。其它浓度的配制可按表中数据按比例折算。 (三) 固定液 1(卡诺氏,Carnoy,s,液 作组织及细胞固定用，渗透力极快。 卡诺氏?:冰乙酸(V)?无水乙醇(V)=1?3 卡诺氏?:冰乙酸(V)?无水乙醇(V)?氯仿(V)=1?6?3 这两种固定液渗透、杀死迅速，固定作用很快，植物根尖固定约需15min，花粉囊约1h，若固定时间太长(超过48h)则会破坏细胞。固定液中的纯酒精固定细胞质，冰醋酸固染色质，并可防止由于酒精而引起的高浓度收缩合硬化。I液适合于植物，?液适合于动物，也使用于植物。I液对玉米合高粱合适宜。对小麦则?液更好。有时在材料已经固定大约30min后加几小滴氯化低铁的含水饱和液于固定液中可助染色体染色。可用甲醇可代替乙醇并对黑麦效果很好。至于大大超过被固定组织数量的固定液，常使固定效果更好。 2(甲醇冰乙酸固定液 作动物细胞或组织固定用，效果很好。 甲醇(V)? 冰乙酸(V)=3?1。 3(福尔马林-乙酸-乙醇固定液,FAA, 又称标准固定液，或万能固定液。用于形态解剖研究，对染色体观察效果较差，此液兼作保存液，材料可长期存放。 用于动物的配方为:50,乙醇(柔软材料用，坚硬材料用70,乙醇)90ml，冰乙酸5ml，福尔马林[HO(CHO)H]5ml。 2n 33 用于植物胚胎的配方为:50,乙醇89ml，冰乙酸6ml，福尔马林5ml。 4(Lichent固定液 适于丝状藻类及一般菌类的固定。 配方:1,铬酸(HCrO)水溶液(g/v%)80ml，冰乙酸5ml，福尔马林15ml。 24 (四)预处理液 1(1% 秋水仙碱母液 称1g秋水仙碱或取原装1g秋水仙碱，先用少量酒精溶解，再用蒸馏水稀释至100ml，冰箱贮藏备用。 其它浓度的秋水仙碱溶液可以此稀释得到。 2(0.002mol/L 8-羟基喹林 取0.002mol的8-羟基喹林溶于100ml蒸馏水中。 3.饱和对二氯苯溶液 在100ml蒸馏水中加对二氯苯直至饱和状态。 (五)解离液 1(盐酸乙醇解离液 95,乙醇与浓盐酸各一份混合而成。根尖细胞制片中，用于溶解果胶质。 2(1%果胶酶与纤维素酶混合液 果胶酶1g，纤维素酶1g，溶于100ml蒸馏水中。 3(2,纤维素酶和0.5,果胶酶混合液 纤维素酶2g，果胶酶0.5g，溶于100ml 0.1mol/L乙酸钠缓冲液(pH=4.5)中。 34 附录? 常用染色液的配制 1(醋酸洋红染液 取45,的乙酸溶液100ml，放入锥形瓶，加热至沸，移去火源，徐徐加入0.5g ,2g洋红，煮沸约5min或回流煮沸12h，冷却后过滤，再加1%,2%铁明矾水溶液数滴 ，直到此液变为暗红色不发生沉淀为止。也可悬入一小铁钉，过一分钟取出，使染色剂中略具铁质，增强染色性能。滤液放入棕色瓶中盖紧保存，并避免阳光直射。 此染液为酸性，适用于涂抹片，染色体染成深红色，细胞质染成浅红，长久保存不褪色 2(丙酸洋红 丙酸洋红与醋酸洋红的配制过程相同，仅以45%的丙酸代替45%的醋酸。丙酸比醋酸更易溶解洋红，且细胞质着色比醋酸洋红浅。 3(醋酸地衣红染液 取冰乙酸45ml，加热至近沸腾，徐徐加入0.5g ,2g地衣红，用玻璃棒搅动，微热至染料完全溶解，冷却后加入蒸馏水55ml，振荡，过滤。滤液放入棕色瓶中保存。 该染液使染色体着色的效果比醋酸洋红更好，但易溶于乙醇，对用乙醇保存的材料要尽量除净乙醇。 4(卡宝品红,改良石炭酸品红～改良苯酚品红,染液 先配成,种原液，再配成染色液。 原液,:取,g碱性品红溶于100ml的 70,乙醇中(可长期保存)。 原液,:取原液,10ml，加入90,l的 5,石炭酸水溶液(限,周内使用)。 原液,:取原液,45ml，加冰乙酸和福尔马林(37,甲醛)各,ml(可长期保存)。 染色液:取原液,10,20ml，加45,的乙酸80,90ml，再加山梨醇1.8g，配成的10,,20,的石炭酸品红液，一般两周以后使用着色能力显著加强。该染色液的浓度可根据需要而变更，淡染或长时间染色可用2,10,的浓度，浓染可用30,浓度，再用45,乙酸分色。山梨醇为助渗剂兼有稳定染色液的作用，不加山梨醇也可以，但着色效果略差。 此液具有醋酸洋红染色方便的优点，还具有席夫试剂只对核和染色体染色的优点，且染色效果稳定可靠。此液适于动植物各种大小的染色体、体细胞染色体和减数分裂染色体，并具有相当牢固的染色性能，保存性好，室温下两年不变质。 5(铁矾-苏木精染液 分别配制甲、乙两液，染色前配合使用。 35 甲液,,,硫酸铁铵(铁明矾)水溶液,:,g铁明矾，溶于100ml水中(现配现用，保持新鲜，铁明矾为紫色结晶，若为黄色则不能用)。 乙液(0.5,苏木精水溶液)(用前6周配制):取0.5g苏木精溶于5ml 95,乙醇中，充分溶解，制成10%苏木精乙醇溶液，贮藏于阴凉处，可保存3,6个月，使用时再加蒸馏水至100ml。 甲液、乙液不能混合，须分别使用。 此液可显示染色体、染色质、核仁、线粒体、中心粒和肌纤维横纹等，使其呈深蓝色甚至黑色。 6(席夫试剂及漂洗液 席夫氏染液及漂洗液的配方如表?-1。 表?-1 席夫氏染液及漂洗液配方 1mol/L盐酸 10ml 碱性品红 0.5克 席夫试剂 偏重亚硫酸钠(钾) 1克 中性活性碳 0.5克 1mol/L盐酸 5ml 漂洗液 10%偏重亚硫酸钠(钾) 5ml (现配现用) 蒸馏水 100ml 席夫试剂的配制方法:将100ml蒸馏水加热至沸，移去火源，加入0.5克碱性品红再继续煮沸5分钟，并随加随搅拌。冷却到50?过滤到棕色瓶中，此时加入1 mol/L盐酸10ml。再冷却到25?时加1克偏重亚硫酸钠(钾)，同时振荡一下，闭封瓶口，置暗处过液，次日取出，液体应成淡黄色或无色。若颜色过深，加0.5克中性活性炭，剧烈振荡1分钟，过滤后于4?冰箱保存(或置阴凉处)，并外包黑纸，以防长期暴露在空气中加速氧化而变色。如不变色可继续使用，如变为淡红色可再加少许偏重亚硫酸钠(钾)转为无色方可使用，出现白色沉淀不可再用。 7(醋酸-铁矾-苏木精 0.5g苏木精溶于100ml 45%冰醋酸中，用前取3,5ml，用45%冰醋酸稀释1,2倍，加入铁矾饱和液(溶于45%醋酸中)1,2滴，染色液由棕黄变为紫色，立即使用，不能保存。 8(丙酸-水合氯醛-铁矾-苏木精染色液 分别配制A、B两贮备液，染色前配合使用。 A液:2g苏木精溶于100ml 50%的丙酸中(可长期保存)。 B液:0.5-1g铁矾溶于100ml 50%的丙酸中(可长期保存)。 染色液:将A、B两液按1?1的比例混合，每5ml混合液加入2g水合氯醛，存放一天后使用。此染色液只能用一个月，半月内效果最好，故不宜多配。 36 9(Giemsa染液 一般先配成原液长期贮存。使用前根据需要用缓冲液将原液稀释，最好现配现用。 Giemsa原液:Giemsa粉 1g 甘油 33ml 45ml 甲醇 在研钵内先用少量革油与Giemsa粉混合，研磨至无颗粒为止，再将余下的甘油倒入， 56?恒温水浴中保温2h，再加入45ml甲醇，充分搅拌，用滤纸过滤，于棕色细口瓶中保存，越久越好。使用时根据染色对象和目的配制不同浓度的使用液，一般用1?10的Giemsa染液。 1?10的Giemsa染液:取10ml Giemsa 原液，加0.025mol/L PBS缓冲液100ml，充分混匀。现配现用最好，或避光保存。 10(硫堇紫染液 硫堇紫原液:1g硫堇溶解在100ml 50%的乙醇中; 硫堇紫染液:取硫堇原液40ml ，加28ml Michaelis缓冲液(pH 5.7?0.2)和32ml 0.1mol/L的 HCl，混匀。 11(1% I-KI溶液 取2g KI溶于5ml蒸馏水中，加入1g碘，待其溶解后再加入295ml蒸馏水，保存于棕色瓶中。 37 附录? 常用缓冲液的配制 1(0.025mol/L PBS缓冲液,pH=6.8, 称取KHPO3.4g，溶解于800ml蒸馏水中，用5%,10%的NaOH调pH值到6.8，加蒸馏24 水定容至1000ml。 2(0.1mol/L PBS缓冲液,pH=6.8, 甲液(0.2mol/L磷酸氢二钠溶液):NaHPO?2HO 35.61g(或NaHPO?7HO 53.65g，242242或NaHPO?12HO 71.64g)溶于适量蒸馏水中，定容至1000ml。 242 乙液(0.2mol/L磷酸二氢钠溶液):NaHPO?HO 27.60g(或NaHPO?2HO 31.21g)242242溶于适量蒸馏水中,定容至1000ml. 使用液:取甲液24.5ml、乙液25.5ml，加蒸馏水定容至1000ml。 3(Michaelis缓冲液,pH=5.7, 取CHCOONa?3HO 19.4g ，巴比妥钠29.4g，溶于800ml煮沸后的蒸馏水中，冷却后32 定容至1000ml。 4(0.1mol/L乙酸钠缓冲液,pH=4.5, 乙酸钠2.95g溶于适量蒸馏水中，加冰乙酸3.8ml调pH至4.5，加蒸馏水定容至1000ml。 38 2附录? X值表 P 0.99 0.90 0.75 0.50 0.25 0.10 0.05 0.01 0.005 df 1 0.00 0.02 0.10 0.45 1.32 2.71 3.84 6.64 7.90 2 0.02 0.21 0.58 1.39 2.77 4.60 5.99 9.22 4.59 3 0.11 0.58 1.21 2.37 4.11 6.25 7.82 11.32 12.82 4 0.30 1.06 1.92 3.36 5.39 7.78 9.49 13.28 14.82 5 0.55 1.61 2.67 4.35 6.63 9.24 11.07 15.09 16.76 6 0.87 2.20 3.45 5.35 7.84 10.65 12.60 16.81 18.55 7 1.24 2.83 4.25 6.35 9.04 12.02 14.07 18.47 20.27 8 1.64 3.49 5.07 7.34 10.22 13.36 15.51 20.08 21.94 9 2.09 4.17 5.90 8.34 11.39 14.69 16.93 20.65 23.56 10 2.55 4.86 6.74 9.34 12.55 15.99 18.31 23.19 25.15 20 8.25 12.44 15.45 19.34 23.83 28.42 31.42 37.59 40.05 30 14.94 20.60 24.48 29.34 34.80 40.26 43.78 50.91 53.71 40 22.14 29.06 33.67 39.34 45.61 51.80 55.75 63.71 66.80 50 29.68 37.69 42.95 49.34 56.33 63.16 67.50 76.17 79.52 60 37.46 46.46 52.30 59.34 66.98 74.39 79.08 88.40 91.98 70 45.44 55.33 61.70 69.33 77.58 85.53 90.53 100.42 104.22 80 53.54 64.28 71.14 79.33 88.13 96.58 101.88 112.33 116.32 90 61.75 73.29 80.62 89.33 98.64 107.56 113.14 124.12 128.30 100 70.06 82.36 90.13 99.33 109.14 118.50 124.34 135.81 140.17 2注:表中P为概率值，df为自由度，求得χ值后，根据相应的自由度(N-1，N表示所观察到的表型组数)，查出P值。若P?0.05,表明观察结果与理论值之间差异不显著，二者相符;若P,0.05，表明实测值与理论值之间差异显著，实测值与理论值不符合。 39