大鼠门静脉分支结扎后肝再生的实验研究

大鼠门静脉分支结扎后肝再生的实验研究 延边大学 硕士学位大鼠门静脉分支结扎后肝再生的实验研究 姓名:郭美祥 申请学位级别:硕士 专业:外科学 指导教师:姜昌镐 20040501 延边大学医学院硕士学位论文 大鼠门静脉分支结扎后肝再生的实验研究 摘 要 目的:采用手术的方法结,,,’〕静脉分支观察对侧肝脏的再生状态。方法:健康,,,,,,雄性大鼠,,只，体重,,,?,,,，随机分成实验组(结扎组，,,,,)和对照组(假结扎组，,,:, ,)，在乙醚麻醉下行门静脉左支结扎和假结扎手术，分别在术后,、,、,、,、,,天用乙醚麻醉动物，心脏采血血清转氨酶值，取出肝脏后检测重量;在光镜下观察肝组织的病理变化，计数肝细胞有丝分裂指数;采用免疫组化的方法计数肝细胞增殖核抗原(,,,,)指数;在电镜下观察肝细胞超微结构变化。结果:(,)实验组血清谷丙转氨酶与对照组比较在术后,天升高(,,,(,,)，但很快恢复正常;(,)肝重量两组间无显著性差异(,,,(,,); (,)实验组肝细胞核分裂指数与对照组比较，具有显著性差异(,,,(,,);(,)实验组,,,,阳性细胞计数与对照组相比，具有显著性差异(,,,(,,)。结论:,(大鼠门静脉左支结扎后，引起未结扎侧肝细胞活跃的再生，再生后的肝脏可恢复原来的重量, ,(大鼠,,,肝叶门静脉分支结扎不影响肝功能，是安全可行的,,(大鼠门静脉分支结扎可以作为研究肝脏再生动物模型的方法。 关键词:结扎;,〕静脉分支;肝再生 延边大学医学院硕士学位论文 ,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,;, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,;,,,,,,,，,,:,, ,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,;, ,,,,,,,,(,,,,,,,:,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,,,(,,,,,, ,,,?,,,),,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,, ;,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,;,,, ,, ,,,,,, ,,,,;,,,,,,,,, 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原发性肝癌是一种常见的肝脏疾病，尤其在我国更为多见，在恶性肿瘤中男性占第,位，女性占第,位，每年约有,,万人死于原发性肝癌。早期诊断、早期治疗是提高疗效的关键;早期手术切除仍是最有效的治疗方法。广泛肝切除术后发生的急性肝功能衰竭是一致命并发症，造成这一并发症的原因是由于肝部分切除术后，残留的部分肝组织一时不足以代偿肝脏功能。提高肝癌的切除率，降低肝叶切除术后肝衰的发生率成为肝脏外科临床的一大难。早期的实验研究发现，阻断部分肝脏的门静脉分支可导致该部分肝组织萎缩，而门静脉未阻断部分肝组织肥大增生“,。随着对肝再生研究的深入，逐渐认识到肝再生是一个既特殊又复杂的成熟肝细胞重新进入细胞增殖循环的生物学过程，如果在广泛肝切除前，阻断预切肝叶的门静脉血流，让其萎缩，使保留肝叶代偿性肥大后再行门静脉阻断肝叶切除术，这样有利于防止一期广泛肝切除所致的急性肝功能衰竭。本实验通过门静脉分支结扎(,,,)的方法观察对侧肝脏的再生情况，为临床肝外科提供理论依据。 , 延边大学医学院硕士学位论文 材料与方法,、实验动物及方法 健康,,,,,,雄性大鼠(封闭群)，体重,,,—,,,,，由延边大学医学院实验动物中心提供，实验动物自由食用固体饲料和清水。,,只大鼠随机分为, 组，实验组(,,,,)，对照组(假结扎组，,,,,)。实验组大鼠在乙醚麻醉下开腹，由正中切口入腹腔，分离出供应肝右叶及尾叶的门静脉右支和供应左叶、左中叶、右中叶及乳突叶的门静脉左支，用,,,丝线结扎门静脉左支，肝动脉及胆管保持完整。对照组手术方法同上，但不结扎门静脉左支，术后第,、,、,、,、,,天分别处死动物各,只。,、试剂、仪器 ,(,增殖细胞核抗原(,,,,,,,,,,,,, ;,,, ,,;,,,, ,,,,,,,，,,,,)由 武汉博士德生物公司提供。 ,(, ,,,,试剂盒由武汉博士德生物公司提供。 ,(,彩色病理图像分析系统,北京航空航天大学产品。 ,(, ,,，,, ,,,,,,切片机(德国产)。 ,(,医用微波炉:，,一?，上海中达医学应用仪器厂。 ,(,全自动生化分析仪(日立,,,,型)。 ,(, ,,,一,,,,,,透射电子显微镜(日本产)。,、标本采集及处理,(,血清生化指标的检测 将大鼠仰卧固定于固定板上，用乙醚麻醉后做胸腹联合切口暴露心脏和肝脏，进行心脏穿刺抽血,,,，用, ,,,转,分离心,,分钟，取血清放入一,,,,冰箱保存。实验结束后利用全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,, ,,(,病理标本的制备 采血后立即取出肝脏，测重后取结扎和未结扎部位的肝组织,×,(,×,(,,,大小各取,块，用,,,中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片厚,,,，做,, 延边大学医学院硕士学位论文染色。 电镜标本:取结扎和未结扎部位的肝组织，切成,,, ×,,,大小，用,,戊二醛固定,小时后,,,冲洗,次，再用锇酸固, ，,, 定、脱水(环氧树酯包埋，制成超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重旧 ,矗 庖咦榛 旧 街瑁矗 痹夭, 劳哑 链 恚河茫校铮欤 獭 蹋 螅椋睿濉,唐 笾每鞠洌叮啊,茫常啊 叮胺种右允骨衅 裘莛じ健,矗 睬衅 牙爸了 ,矗 ?,,,,:,:,份，蒸馏水,,份混合，室温,,,,分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗 ,次。,(,微波修复抗原:将切片浸入,(,,,枸橼酸盐缓冲液，,,,(,，微波炉加热至沸腾后断电，间隔,,,,分钟，重复,次。冷却后进行下一步。,(,滴加山羊血清封闭液，室温,,分钟。甩去多余液体，不洗。,(,滴加小鼠抗,,,,抗体，,。,过夜。,,,洗,分钟×,次。,(,滴加生物素化山羊抗小鼠，,,，,,;;,,分钟。,,,洗,分钟×,次。,(,滴加试剂,,,,，,,。,,,分钟。,,,洗,分钟×,次。,(, ,,,显色:使用,,,显色试剂盒。取,,,蒸馏水，加试剂盒中,，,，,(试剂各,滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般,,,,分钟。蒸馏水洗涤。,(,,苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜观察。,、观察指标,(,病理学观察; 肉眼观察肝脏的色泽和质地; 光镜下观察肝组织的病理变化, 透射电镜下观察肝细胞超微结构的改变。,(,肝细胞核分裂指数 ,,,倍光镜下计数,,,,,个肝细胞，统计每,,,,个肝细胞中的有丝分裂的细胞数“,。,(,肝细胞,,,增殖抗原指数 每张切片随机选择,,个视野，光镜,,,倍下计数,,,,阳性细胞数，按下列公 , 延边大学医学院硕士学位论文式计算,,,,阳性细胞的指数。“,。 染色阳性细胞数 ,,,,指数, ×,,,, 全部肝细胞数,统计学处理所有实验数据用;?,示，并用,,,,统计软件进行,检验。 延边大学医学院硕士学位论文 结果一、大鼠一般状态的观察 对照组:大鼠术后第,天即可自由进食、饮水，精神较好，尿液、眼球、双耳、爪及皮毛颜色无改变，第,天 活动食欲良好。伤口愈合好，无明显发热、行为异常等表现。伤口愈合好。 实验组:大鼠于术后第,天即可自由进食、饮水，精神较萎，第,天基本恢复正常，尿液、眼球、双耳、爪及皮毛颜色无改变，精神、食欲良好，,天后活动恢复正常。伤口愈合好，无明显发热、行为异常等表现。二、大鼠肝脏大体结构的改变 对照组:肝脏呈红色，无其他改变。 实验组:门静脉左支结扎后可见被结扎的肝叶立即变为暗红色，开始进行性萎缩，占全肝百分比逐渐减少，同时对侧肝叶明显增生，随时间推移其重量逐渐增加，占全肝百分比也逐渐上升，未结扎的右侧叶和尾状叶仍呈鲜红色。,天后腹腔内少量渗出，肝组织稍肿胀，结扎侧呈局灶性灰黄色，,天后肝脏与周围组织大网膜、胃壁等有纤维素性粘连，被结扎侧肝叶轻度萎缩，质地开始变硬，,天后被结扎侧肝叶呈现灶性纤维化改变，,,天后萎缩、纤维化，质地硬，未结扎侧肝叶明显肥大，边缘钝厚。三、血清,,,的变化 对照组:术后血清,,,无明显变化，在正常范围内变动。 实验组:术后,,出现一过性的升高(,,,(,,)，第,天开始恢复接近正常水平，两组血清,,,相比较无明显差异(见表,， ,图,)。 表,(术后不同时间大鼠血清,,,的变化(,,?,，,，,)。,,,(,,,, ;,,,,,, ,,,,,四、肝脏重量的变化 对照组:术后肝重量无明显变化。 延边大学医学院硕士学位论文 实验组:术后第,天肝重量稍低于对照组，第,天开始恢复正常水平，与对照组相比无显著差异(,,,(,,，见表,，图, , 表,(门静脉左支结扎后不同时间肝脏重量的变化(;?,，克)群,,,(,,,, ;,,,,,, ,,,,,五、肝组织的病理变化 对照组:以中央静脉为中心肝细胞呈放射状排列，肝细胞无变性坏死(,,,(,) 实验组:结扎侧术后,天肝细胞开始坏死，镜下表现为核浓缩，胞浆红染，肝窦略增宽，术后第,天肝细胞核进一步浓缩，部分核溶解消失，胞浆更红染，周边较多炎症细胞浸润(,,,(,)，第,天肝细胞大片凝固性坏死，大量的核溶鳃消失，部分胞浆崩解，肝窦进一步增宽，周边大量中性粒细胞浸润(,,,(,)，随着时间的延长，坏死部分开始被吸收，肝叶纤维化。未结扎侧肝脏术后第,天肝细胞轻度肿胀，可见肝细胞核分裂像(,,,(,);术后第,天肝细胞核分裂数量明显增多，伴有核增大(,,,(,);术后第,天肝细胞核分裂活跃(,,,(,,)，术后第,天亦可见核增大(,,,(,,)，术后第,,天可见小胆管增生，肝索结构清楚，肝窦清楚(,,,(,,)。六、肝细胞核分裂指数对照组:肝细胞核分裂指数无明显变化。实验组:术后第,天肝细胞核分裂指数升高，第,天明显升高，第,天仍高于对照组(,,,(,,)，以后逐渐恢复正常(见表,，图,)。 表,(肝细胞有丝分裂指数的变化(;?,，,。) , 延边大学医学院硕士学位论文七、,,,,阳性细胞计数(,,,,标记指数，见表,，图,) ,,,,染色核呈棕黄色。 对照组:有少量,,,,阳性细胞(,,,(,,)。 实验组:结扎侧可见坏死区，无,,,,阳性细胞(,,,(,,);未结扎侧术后第,天较多,,,,阳性细胞(,,,(,,)，第,天可见大量,,,,阳性细胞(,,,(,,)，第,天可见较多,,,,阳性细胞(,,,(,,，,,)，术后第,天棕黄色,日性细胞减少 (,,,(,,)，术后第,,天可见少量,,,,阳性细胞(,,,(,,)。 表,(,,,,标记指数的变化(,?,，,) ,,,,(,,,, ;,,,,,, ,,,,,,《、 电子显微镜观察 对照组:细胞结构完整，可见线粒体，粗面内质网，糖原颗粒分布均匀，常染色质与异染色质 分布均匀，细胞内未见异常的细胞器(,,,(,,)。 实验组:结扎侧肝脏术后,天即可见到细胞核缩小，异染色质与常染色质分布不均，异染色质边聚，核内也可见包涵物，细胞器的形态基本接近正常结构的肝细胞(,,,(,,)，在术后,,达高峰，术后,周可见,,,,,间隙内有胶原纤维沉积，肝血窦明显收缩变窄。在术后,周出现纤维化改变。未结扎侧术后,天粗面内质网多在核周密集，胞质中糖原含量普遍减少，线粒体肿胀、增大(,,,(,,)，术后,天粗面内质网出现分散、,昆乱呈细丝状，胞质内糖原开始增多，线粒体出现嵴扭曲，核仁开始增多，核质也开始增多(,,,(,,)，随着时问的延长，粗面内质网进一步呈薄片状分布，糖原逐渐呈簇状，如花瓣样改变。线粒体嵴模糊或消失，也有许多线粒体聚集在一起，随后，大小不等，数量增多。染色质深，再生明显的出现双核细胞，尚可见多核细胞，并可见到核分裂现象。 ，, 延边大学医学院硬士学位论文 附图 ,,, 钒 ,, 组组 。, , ,, , ,, 卜, 卜, ,, , 第,天 , 第,天 术,, 一 删曲?变, , 邯，? ? 第,天 , 第,天 一 第,,天 术后肝脏重量的变化 天数 木,,,(,,,, ;,,,,,, ,,,,,图, 口对照组 ,, ?实验组 手,,;，一庙一庸(庙…憎(((嵋一 延边大学医学院硕士学位论文图, 术后肝细胞有丝分裂指数的变化 , , ,, 祭, 羔, 。?, , , , , , , ，,二,。,几数, ,) 半,,,(,,,, ;,,,,,, ,,,,,图, 术后,,,,指数的变化 曩“,嚣 ,,(,(,,,, ;,,,,,, ,,,,, 延边大学医学院硕士学位论文,,,(,(;,,,,,, ,,,,,,眦×, ,, ,,,(,(,, ,,,,,,,,。, ,,,,, ,,;,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,, ,, ,, ,?, ,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,,;, ,,,,,,,,(,,×, ,,,,,(,(,, ,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,;,,,, ,,,(,(,, ,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,;,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,, ,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,;, ,,,,,,,,(,,×, ,, ,,,,,, ,,,,;, ,,,,,,,,(,, , ,,, 延边大学医学院硬士学位论文,,,(,(,, ,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,;,,,, ,,,(, ,(,, ,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,;,,,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,, ,, ,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,,;, ,,,,,,,,(,,),,,,,,,,;, ,,,,,,,,(,,×,,, ,,,(,,(,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,;,,,, ,,,(,,(,, ,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,;,,,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,, ,, ,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,;, ,,,,,,,,(,, , ,,, ,,,,,, ,,,,;, ,,,,,,,,(,,, ,,, ,, 延边大学医学院硕士学位论文,,,,,(,,,, ,,,,,,,,,,,;,,,,,,,, ,,,,,(,,”,, ,,,,,,,,,,;,,,,,舡,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,;,,,, ,,,, ,,, ,, ,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,;,,,, ,,,,;,,,,,, ,,, , ,,,,,(,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,, ,, ,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,,;, ,,,,,,,,(,,,,,,,,, , ,,×?,,(,,,, ,，,鲫,,,,,，蜘,,,,, ,皓,,(,,,, ,,,,,,,,,,(,“,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,;,,,, ,,,, 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,,,,;, ,,,,,,,,( ,, 延边大学医学院硕士学位论文,,,?,, ,,,,,,,,,;,,,, ,, ,,,,, ,,;,,,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,, ,, ,,, ,椋颍螅?,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,, ,,;, ,,,,,,,,(,,,(,, ,,,,,,,,,;,,,, ,, ,,,, ,,;,,,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,, ,, ,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,,;, ,,,,,,,,( ,, 延边大学医学院硕士学位论文 讨论 急性肝功能衰竭是广泛肝切除术后一致命并发症，造成这一并发症的原因往往是由于部分肝切除术后，残留部分肝组织一时不足以代偿肝脏功能。早期实验研究发现，阻断部分肝脏的门静脉分支可导致该部分肝组织萎缩，而门静脉未阻断部分肝组织肥大增生“,。随着对肝再生研究的深入，逐渐认识到肝再生是一个既特殊又复杂的成熟肝细胞重新进入细胞增殖循环的生物学过程。目前认为肝脏中主要是,种细胞参与肝脏再生:(,)成熟的肝细胞，具有很强的增殖能力;(,)胆管祖细胞，具有双.