载脂蛋白A5在贝特类药物调脂治疗中的作用机制研究

载脂蛋白A5在贝特类药物调脂治疗中的作用机制研究 载脂蛋白A5在贝特类药物调脂治疗中的作 用机制研究 ? 420? 行的,随着对心衰的分子病理学研究逐步深入,转移载体技术 的提高,心脏基因转移方法的改进以及某些动物实验和早期临 床研究的进行,基因治疗将为心衰治疗带来新的曙光. 4参考文献 1张婧,王树岩,陈谨.细胞凋亡和心力衰竭临床相关性和治疗目 标[J].中国医药导刊,2006;8(4):45. 2刘宏伟,盖鲁粤.基因治疗联合干细胞移植修复坏死心肌(J].中国 心血管病研究杂志,2004;2(12):982-5. 3周秀娟,黄峻,姚垄,等.MyoD基因诱导大鼠心脏成纤维细胞分 化为成肌细胞的实验研究[J].南京医科大学学报,2006;26(4): 238-41. 4张敏,刘芳,田蕾,等.锤头状核酶调控CD95介导小鼠皮肤 成纤维细胞凋亡[J].中华器官移植杂志,2005;26(2):75-7. 5MinLJ,CuiTX,YahataY,eta1.Regulationofcollagensynthesisin mouseskinfibmbl~tsbydistinctangiotensinIIreceptorsubtypes[J]. Endocrinology,2004;145(1):253-60. 6王涛,余志斌,谢满江,等.新生大鼠心肌细胞培养技巧[J].第四 军医大学学报,2003;24(2):2. 7PerehinecTM,QaziSNA,GaddipatiSR,eta1.Constructionandevaluation ofmuhisiterecombinatorial(Gateway)cloningvectorsforGram—positive bacteria[J].BMCMolBiol,2007;19(8):80. 中国老年学杂志2008年3月第28卷 8汪进益,范慧敏,刘中民,等.肌肉转录调节因子和连接蛋白43基因 表达对大鼠成纤维细胞分化的生长特性及生物学功能影响[J].中 国修复重建外科杂志,2007;21(8):857-60. 9沈丽娟,何国平.基因治疗与心力衰竭[J].中国组织工程研究与临 床康复,2007;ll(12):2333~. 1O秦瑞峰,顾晓明,陈金武,等.鼠肌肉转录调节因子MyoD基因真核 表达载体的构建[J].中国修复重建外科杂志,2001;15(5):257— 60. 1l唐佩弦.干细胞基础研究的新进展[J].基础医学与临床,2006;26 (1):1一l1. 12李秀兰,张杨,师宜健,等.体外诱导成纤维细胞成骨活性表达的 研究[J].中国修复重建外科杂志,2006;20(2):107一l1. 13DedkovE1,KostrominovaTY,BorisovAB,eta1.MyoDandmyogenin proteinexpressioninskeletalmuscles0fsenilerats[J].CellTissue Res,2003;3ll(3):401.16. 14DuncanJC,FletcherWH.alpha1.Connexin(connexin43)gapjunc— tionsandactivitiesofcAMP—dependentproteinkinaseandproteinkinase cindevelopingmouseheart[J].DevBy.,2002;223(1):96—107. 15Hajj8rILl,delMonteF,MatsuiT,eta1.Prospectsforgenetherapyfor heartfailure[J].CircRes,2000;86(6):616-21. [2007—12—10收稿2008-01-28修回] (编辑章木) 载脂蛋白A5在贝特类药物调脂治疗中的作用机制研究 杨轶文陈焕芹邱蕾常静(山东大学齐鲁医院干部保健科,山东济南250012) [摘要]目的研究载脂蛋白A5(ApoA5)在贝特类药物调脂中的作用.方法雄性Wistar大鼠随机分4组,取血和肝匀浆检测血脂指标, 应用RT—PCR法检测肝脏ApoA5及过氧化物酶体增殖物激活型受体Ot(PPAR—Ot)mRNA表达情况,比较ApoA5与各指标间的相关性.结果?血清 及肝匀浆甘油三酯(TG):高脂组及非诺贝特低剂量组明显高于正常对照组(P<0.01,P<0.05);非诺贝特高,低剂量组明显低于高脂组(P<0.01); 非诺贝特高,低剂量组间有显着差异(P<0.05);(~)ApoA5和PPAR—Ot表达:正常对照组明显高于高脂组,非诺贝特低剂量组(P<0.01);高脂组明显 低于非诺贝特高,低剂量组(P<0.01);非诺贝特高,低剂量组间有显着差异(P<0.01).?ApoASmRNA表达与TG呈明显负相关 (P<0.01),与 PPAR—d表达呈正相关(P<0.01).ApoA5与总胆固醇(Tc)无明显相关性.结论ApoA5可能是影响血浆TG代谢的重要因素,贝特类药物上调 ApoA5和PPAR—Ot基因表达,与剂量相关.ApoA5在贝特类药物调脂作用可能是通过PPAR—Ot为作用靶点调控ApoA5发挥降.rG作用. [关键词]载脂蛋白A5;过氧化物酶体增殖物激活型受体a;甘油三酯;调脂治疗,贝特类 [中图分类号]R589.2[文献标识码]A[文章编号]1005-9202(2008)05-0420-03 近年来研究发现,动脉粥样硬化性相关疾病,糖尿病,炎 症,代谢综合征均与血浆甘油三酯(TG)水平升高密切相关,进 行TG相关的基因,载脂蛋白等方面研究将为预防心血管疾病 开辟新的领域.最近用比较基因组学的方法发现的载脂蛋白 A5(ApoA5)基因与血浆TG水平呈明显的负相关关系.但 是,ApoA5基因降低血浆TG的具体作用机制还不清楚,ApoA5 基因的表达调控机制也需要进一步的阐明,目前国内外相关研 究还甚少.过氧化物酶体增殖物激活型受体(PPAR—)是配 体依赖的核转录受体,在肝脏,骨骼肌,脂肪等组织表达,通过 与过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)结合,参与脂质代谢 的许多过程.PPAR.可作为一种信号途径成为机体维持和调 节脂代谢的关键.为此,本研究采用高脂饲料喂养Wistar大鼠 复制高TG血症的动物模型,并用贝特类药物进行干预,制作出 TG在整个实验中的梯度值,分析肝脏组织中ApoA5和PPAR— mRNA的表达ApoA5与血脂各项指标的关系,旨在阐明 ApoA5在贝特类药物调脂中的作用机制. 通讯作者:陈焕芹(1965一),女,副教授,硕士生导师,主要从事老年心血 管病研究.1材料与方法 作者简介:杨轶文(-),女,硕士,主要从事老年心血管病研究.1.1材料及主要仪器雄性Wi star大鼠32只,体重(160? 5 10)g,山东大学实验动物中心提供,动物批号:SCXK(鲁) 20030004.TrizolmRNA提取液(Invitrogen,购自上海志壮生物 有限公司);反转录引物oligo(dT)18,ApoA5,B—actin,PPAR— 引物均由博雅公司合成.反转录酶(M—MLV)及d-NTP(购自北 京晶美),Tag酶购自上海生工,分子量DNA—marker购自日 本TakaraBiotech公司.大鼠的PCR引物由大连宝生物生物有 限公司设计.ApoA5上游引物:5GGAGTAc兀?GGccAGAA. CAG3下游引物:5,IfI1cATArI’I’GTAGAGGTcrI’I’GcTCcA3B-ac— tin:上游引物5~GACAGGATGCAGAAGGAGA3下游引物5 TAGAGCCACCAATCCCACA3PPAR—:上游引物5CTGA. CATITGTGACTGGTCAAGCTC3下游引物5TITCCAGGT- CATCrGC不?AAGTG3扩增片段分别为108,104,150bp.台 式冷冻离心机:德国Sigma公司;紫外分光光度计UV-2450:Et 本;PCR仪:德国Eppendorf公司;凝胶成像系统;恒温水浴箱: DK-600型电热恒温水槽,上海精宏实验设备有限公司;全自动 生化分析仪:日本东芝公司;分光光度计(Biophotometer):德国 Eppendorf公司. 1.2方法 1.2.1高脂血症动物实验模型复制32只Wistar大鼠普通 饲料适应性喂养1W,颈静脉窦采血测定血清TG,总胆固醇 (TC),按体重和血清指标值随机分为4组,每组8只.正常 对照组用普通饲料喂养,其余组高脂饲料(2%胆固醇,10% 猪油,0.2%胆酸钠,8%蛋黄粉,10%糖,69.8%基础饲料) 喂养(每晚6:00添加高脂饲料25g/只,次日待高脂饲料吃 完后以普通饲料补齐),4W后给予药物干预处理:非诺贝特 高,低剂量组在喂食高脂饮食同时,每日下午3:00给予力 平之(非诺贝特)灌胃,低剂量组为35ms/kg,高剂量组为 100mg/kg(用生理盐水配成20mg/m~);正常对照组继续喂 普通饲料,高脂组继续喂高脂饲料,每日下午3:00给予生 理盐水灌胃.药物干预4W后,下腔静脉取血后处死大鼠. 测定血清及肝匀浆的TC,TG水平,取肝脏保存于一80~C低 温冰箱. 1.2.2血清及肝匀浆TG,TC含量测定每只大鼠取相同部 位肝组织200mg剪碎,加入0.86%冰盐水2ml,匀浆机制成 10%组织匀浆,低温低速离心机3000r/min离心15min,取上 清于一20~C冰箱中备用,血清及肝匀浆TG,TC均用全自动生 化分析仪测定. 1.2.3RT—PCR法测定大鼠肝ApoA5及PPAR—mRNA表达 ?Trizol提取肝脏总RNA,并用紫外分光光度计法评估RNA 的浓度及纯度.?RT反应:取4RNA,加入oligo—dT(18) 1,DEPC处理水9,5×缓冲液4,dNTP1,在旋涡混 悬器上混匀30s,12000r/min离心30s,放入37?水浴5min, 加入反转录酶(M—MLV)1(200U),42?反应60min,95?水 浴5min,迅速冰水中冷却.?RT—PCR反应及琼脂糖凝膝电 泳:0.8p.1逆转录产物,10×PCR缓冲液2,DEPC处理水 12.8,Tag酶0.4,dNTP0.4,Mg”1.6,上下游引物 各1,条件扩增条件:95~C预变性5min,94~C变性30s,56~C 退火30s,72oC延伸45s,共34次循环,继续72?延伸7min. ?产物分析:取PCR产物8,加样于1.5%琼脂糖凝胶中电 泳.紫外透视分光仪摄片,经凝胶密度扫描系统处理,测定各 电泳带灰度值.各反应体系以B.actinmRNA为内参照,计算待 测mRNA的RT—PCR产物与其灰度比值,作为待测mRNA的表 达值.PPAR—mRNA相对量=PPAR.电泳带灰度值/B.actin 电泳带灰度值. 1.3统计学处理全部数据用SPSS13.0统计软件处理,所有 数据以?s表示,组间比较用方差分析,两组间比较用q检验. ApoA5与各项指标间比较用相关性分析. 2结果 2.1各组间血清及肝匀浆TC,TG含量血清及肝匀浆TG高 脂组及非诺贝特低剂量组明显高于正常对照组(P<0.01,P< 0.05),而非诺贝特高剂量组与对照组无明显差异;非诺贝特 高,低剂量组明显低于高脂组(P<0.01);非诺贝特高剂量组低 于低剂量组(P<0.05).正常对照组血清TC较其他3组明显 减低(均P<0.01);非诺贝特高,低剂量组血清TC低于高脂组 (P<0.05);非诺贝特高,低剂量组间无差异.正常对照组肝匀 浆TC较其他3组明显减低(P<0.01),但在高脂组,非诺贝特 高,低剂量组3组之间无差异(表1). 2.2各组间ApoASmRNA及PPAR—ctmRNA表达RT—PCR 后,琼脂糖凝胶电泳在150bp处显示出PPAR.阳性电泳带, 在108bp处显示出ApoA5阳性电泳带.与B—actin(104bp)比 较,灰度比值显示:ApoAS/13一actin灰度比值和PPAR一B—acfin 灰度比值正常对照组明显高于高脂组和非诺贝特低剂量组 (P<0.01),而与非诺贝特高剂量组没有明显差异;高脂组明显 低于非诺贝特高,低剂量组(P<0.01);非诺贝特低剂量组明显 低于非诺贝特高剂量组(P<0.01)(表2). 2.3ApoASmRNA表达与其他变量的相关性ApoASmRNA 表达与PPAR—ctmRNA表达呈正相关(P<0.01);与血清和肝 匀浆的TG水平呈负相关(P<0.01);与血清和肝匀浆的TC水 平无明显的相关性.. 表1各组间血清及肝匀浆TC,TG含量比较(n=8.i4”8.mmoi/L) 与正常对照组比较:1)P<0.01,2)P<0.05;与高脂组比较:3)P<0.01,4)P<0.05;与非诺贝特低剂量组比较:5)P<0.05 ? 422? 表2各组问ApoA$mRNA,PPAR_u,~nRNA 表达(n=8.?s.灰度比值) 1)与正常对照组比较,2)与高脂组比较,3)与非诺贝特低剂量组比 较:均P<0.01 3讨论 血脂异常是心血管疾病独立的危险因素,其实质是脂蛋白 和载脂蛋白的异常,脂蛋白致动脉粥样硬化(AS)的作用更强于 胆固醇.载脂蛋白作为脂蛋白中的蛋白质部分,不仅能结合, 转运脂质及稳定脂蛋白结构,而且还调节脂蛋白代谢关键酶活 性,参与脂蛋白受体的识别,在脂蛋白代谢上发挥极为重要的 作用,载脂蛋白参与了人体脂类代谢的全过程.在2001年通过 蛋白组学技术鉴定的一个新的载脂蛋白家族成员ApoA5是TG 生物学的一个重大发现,与血浆TG水平有明显的负相关 性0J.表达人类ApoA5转基因鼠的血浆中TG的浓度下降为 对照鼠的1/3,而在该基因敲除鼠血浆中却增加了4倍.本 研究结果显示,高脂组大鼠的血清和肝匀浆中TG含量明显高 于正常对照组,非诺贝特低和高剂量组(P<0.01),此时ApoA5 表达较这三组呈现低水平(P<0.01),且随着TG水平的升高, ApoA5表达水平逐渐降低.用不同剂量的非诺贝特处理后,TG 水平降低有明显差异(P<0.05),ApoA5表达水平也有明显差 异(P<0.05),ApoA5表达水平升高与非诺贝特剂量增大和TG 水平降低相关.但血清及肝匀浆TC含量与ApoA5表达水平不 具有同步性.本研究表明,ApoA5可能是影响血浆TG代谢的 重要因素,但对胆固醇代谢影响不大. PPAR.仅属于核受体超家族中的一员,是PPARs受体家族 3个亚型(PPAR.仅,.B和一)之一.Everett等用PPAR一仅基因 敲除鼠模型研究发现,该种鼠出现了严重的脂质代谢紊乱,说 明PPAR.仅对血脂代谢有重要意义.降脂药物和单/多不饱和 脂肪酸与受体结合激活受体,激活的受体结合形成PPAR—a/ RXR异二聚体,与脂代谢的靶基因的PPRE特异性结合,调 控靶基因转录,参与脂质代谢和调节炎症,免疫等的许多过程. 贝特类药物是多效的影响脂质代谢的降脂药,其经典的作用是 降低TG,通常认为机制是通过降低肝脏极低密度脂蛋白 (VLDL)分泌和加强血浆TG清除.贝特类药物调控脂质代谢 相关基因表达是通过PPAR一仅作用的.基于ApoA5和血浆TG 有联系,而贝特类药物在治疗脂质障碍的广泛作用,故可以推 测贝特类能够调控ApoA5基因表达.最近的研究也显示 PPAR.仅与载脂蛋白A5(ApoA5)关系密切’,Prieur等发现 ApoA5转录起始位点上游271bp有PPRE.Vu—Dac等用特 定的PPAR一仅活性剂(wy14,643或非诺贝特)能明显诱导 ApoASmRNA在肝脏表达.近端ApoA5启动子的缺失和诱变分 析强有力的表明功能性PPRE的存在.本研究也显示,非诺贝 特大鼠肝脏的ApoASmRNA表达量与PPAR一~mRNA的表达量 呈明显同步趋势,相关性分析显示呈明显正相关趋势(P< 中国老年学杂志2008年3月第28卷 0.01),用PPAR一仅激动剂(非诺贝特)诱导PPAR一仅出现高表 达,ApoA5mRNA也随之表达量增高,呈剂量依赖性,这与国外 研究结果相一致.说明ApoA5是一个高度敏感的PPAR.仅的 靶基因,通过与PPAR一仅结合及配体激活来参与调控血浆TG 的浓度,可以进一步解释贝特类药物降低血清TG的机制. 总之,脂代谢紊乱严重影响着人类的健康,并通过心脑血 管疾病显示出它的危害.研究表明,高TG,低HDL.C,高LDL.C 发生冠心病事件的危险性可增高2倍多].富含TG的脂蛋白 可参与As的形成.ApoA5是2l世纪的TG领域的新发现,目 前国外对其结构,调控及作用机制的研究正在不断的深入, OBrienPJ等应用ELISA检测人血清ApoA5范围为24— 406s/L,国内也制备出了ApoA5单克隆抗体,对其进一步 的研究可能对脂代谢紊乱的病理生理,发病机制研究提供新的 思路,成为研究脂代谢及相关心血管疾病的一把钥匙,为调脂 新药的研发开辟新的道路. 4参考文献 1VanderVlietHN,SammelsMG,LeegwaterAC,eta1.ApolipoproteinA— V:anovelapolipoproteinassociatedwithanearlyphaseofliverregenera- tion[J].JBiolChem,2001;276(48):44512-20. 2PennacchioLA,OlivierM,HubacekJA,eta1.Anapolipoproteininfluen— cingtriglyceridesinhumansandmicerevealedbycomparativesequencing [J].Science,2001;294(5540):169-73. 3EverettL,GalliA,GrabbD,eta1.Theroleofhepaticperoxisomeprolifer- ator—activatedreceptors(PPARs)inhealthanddisease[J].Liver,2000; 20(3):191-9. 4NeveBP,FruchartJC,StaelsB.Roleofthepemxisomeprolifemtor-activa? tedreceptors(PPAR)inathemsclemsis[J].BiochemPhannacol,2000; 60(8):1245-50. 5BergerJ,MoilerDE.ThemechanismsofactionofPPARs[J].AnnuRev Med,2002;53(5):409—35. 6PrieurX.ThehumanapolipopmteinAVgeneisregulatedbypemxisome proliferator--activatedreceptor—alphaandcontainsanovelfarnesoidX—a cti— ratedreceptorresponseelement[J].JBiolChem,2003;278(28): 25468-80. 7Vu—DacN,GervoisP,JakelH,eta1.ApolipopmteinA5,acrucialdetermi— nantofplasmatriglyceridelevels,ishighlyresponsivetopemxisomepro- liferator?activatedreceptoralphaactivators[J].JBiolChem,2003;278 (20):17982-5. 8JeppesonJ,HeinHO,SuadicaniP,eta1.RelationofhighTG?lowHDL cholesterolandLDLcholesteroltotheincidenceofischemicheartdis. ease:an8-yearfollow?upintheCopenhagenMaleStudy[J].Arterioscler ThrombVascBiol,1997;17(6):l114-20. 90BrienPJ,AlbomWE,SloanJH,et.ThenovelapolipoproteinA5is presentinhumanserum,isassociatedwithVLDL,HDL,andchylomi— crons,andcirculatesatverylowconcentrationscomparedwithotherapoli— popmteins[J].ClinChem,2005;51(2):351-9. 10刘琼,赵水平.ApoA5单克隆抗体的制备及其临床初步应用[J]. 医学临床研究,2006;23(2):153-6. [2006.12-22收稿2007-06-21修回] (编辑曹梦园/张慧)