【doc】聚乙二醇修饰干扰素α2b抗肿瘤细胞增殖作用

【doc】聚乙二醇修饰干扰素α2b抗肿瘤细胞增殖作用 聚乙二醇修饰干扰素α2b抗肿瘤细胞增殖 作用 348 中国药科大学 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2002,33(4):348,350 聚乙二醇修饰干扰素2b抗肿瘤细胞增殖作用 杨晓兵,姚文兵,吴梧桐,沈子龙 (中国药科大学生物制药学院,南京210029) 摘要目的研究基因干扰素u2b和聚乙二醇(PEG)修饰干扰素a2b的抗肿瘤细胞增殖效应.方法 采用MTT法将不同浓度的干扰素分别对几种肿瘤细胞进行生长抑制实验.结果不同终浓度(500ng/ml,50ng/ ml,5ng/ml,0.5ng/m1)干扰素u2b和PEG修饰干扰素u2b对人肝癌细胞(sMMc一7721),人红白血病细胞 (K562),人宫颈癌细胞(HeLa),人鼻咽癌细胞(KB)和人胃癌细胞(BGC)的生长均有不同程度的抑制作用.结论 聚乙二醇修饰干扰素的抗肿瘤细胞增殖作用优于干扰素. 关键词干扰素;抗肿瘤;抗增殖;聚乙二醇 中图分类号:R979.1文献标识码:A文章编号:1000—5048(2002)04—0348—03 干扰素是人体细胞或动物细胞在诱生剂作用 下产生的一种蛋白质,具有抗病毒,抗肿瘤和免疫 调节作用[1].聚乙二醇(PEG)修饰干扰素后可以增 强其稳定性,减少免疫原性和延长体内半衰期,从 而可以降低副作用,提高疗效.本文着重考察基因 工程干扰素a2b和PEG修饰干扰素a2b对几种肿 瘤细胞的体外生长抑制效应. 1实验材料 1.1肿瘤细胞株 人肝癌细胞(SMMC一7721),人红白血病细胞 (K562),人宫颈癌细胞(HeLa),人鼻咽癌细胞 (KB),人胃癌细胞(BGC)由中国药科大学生物技术 中心提供. 1.2仪器 YJ一875医用净化工作台(苏州净化设备公 司);二氧化碳培养箱(FormaScientific);倒置显微 镜(梧州光学仪器厂). 1.3试剂 RPMI1640培养基(美国Gibco公司);小牛血 清(杭州四季青公司)产品;MTT(Fluka公司);胰蛋 白酶(Sigma公司)产品.基因工程IFNa2b(天津华 立达生物工程公司). 2实验方法 收稿日期2002—03一l0通讯作者Tel:025—3271225 2.1聚乙二醇修饰干扰素的制备,分离纯化 按文献方法[2]进行,以碳酸单甲氧基聚乙二醇 琥珀酰亚胺酯(SC—mPEG5000)与干扰素a2b进行 反应,并采用Superdex75Highload制备型凝胶色谱 柱进行修饰产物的分离纯化. 2.2蛋白含量测定 以牛血清白蛋白为标准,按考马斯亮蓝G250 法[3]测定蛋白含量. 2.3抗病毒活性测定 按文献方法进行.采用Wish—VSV系统,测 定各样品的抗病毒活性.结果以IFNa2b标准品进 行校正. 2.4抗增殖活性测定 取对数生长的上述几种肿瘤细胞用胰蛋白酶 消化后均以5×10个/ml,50p.I/孔的细胞浓度接 种于96孔板,实验组各孔均以50PJ/孔分别加入 终浓度为500,50,5,0.5ng/ml的IFNa2b和PEG— IFNa2b,阴性对照孔改以50l/孔加入培养基,各 组均设6个复孔,于37?,5CO:培养箱培养48 小时,各孔中加入20l的5mg/mIMTT,继续培养 4小时后测定ODsTo,并按下列公式计算细胞生长 抑制率(IR). 4期杨晓兵等:聚乙二醇修饰干扰素2b抗肿瘤细胞增殖作用349 细胞生长抑制率(IR)一(1一实验组OD值/对 照组OD值)×1OO 3结果 3.1IFNcc2b与PEG—IFNcc2b的抗病毒活性 采用WISH细胞(人羊膜传代细胞)一VSV病毒 (滤泡性口腔炎病毒)系统测定IFNcc2b与PEG— IFNcc2b的体外抗病毒活性,结果见1. Tab1.AntiviralactivitiesofIFNandPEG,IFN 墓 星 量 { { 2 0 0.050.5550 1FN/ng?ml'' 500 一 ?,IFNz一?一PEG-IFN Fig1.EffectofIFNandPEG—IFNonSMMC一7721cellIine 一 C .2 兽 , .量 占 ? 2 0 一 —IFN ?,IFN:一?一PEG Fig3.EffectofIFNandPEG—IFN?HeLaceilline 3.2IFNcc2b与PEG-IFNcc2b的抗肿瘤活性 将IFNcc2b与PEG—IFNcc2b分别在500,50.5. 0.5nz/ml的浓度下在体外作用于人肝癌细胞 (SMMC一772i),人红白血病细胞(K562),人宫颈癌 细胞(HeLa),人鼻咽癌细胞(KB),人胃癌细胞 (BOC),观察它们对这几种肿瘤细胞的生长抑制作 用,结果分别见图1,5.从图中可以看出,在各浓 度下,IFNcc2b与PEG—IFNcc2b均表现出了抑制细胞 增殖的作用,且这种作用呈剂量依赖性.在同一质 量浓度下,PEG—IFNcc2b的抑制率大于IFNcc2b. 尝 : 墨 墨 .量 { 暑 1FN/ng'ml 一 ?一IFNz一?一PEG—IFN Fig2.EffectofIFNandPEG—IFNonK562cell1|ne 营 点 量 { { 2 0 一 ?一IFNl一?一PEG一1FN Fig4.EffectofIFNandPEG—IFNonKBceilline 350中国药科大学33卷 釜 董 墨 亳一 占 一 ?一IFN:一?一PEG—IFN Fig5.EffectofIFNandPEG—IFNonBGCcellline 4讨论 1)近年来人u干扰素广泛用于治疗不同类型 肿瘤,包括毛细胞白血病,子宫癌,鼻咽癌,肝癌等 等,干扰素的抗肿瘤作用已受到人们的广泛重视, 其作用机理较为复杂,对不同种类肿瘤的作用不一 致,这可能与多种因素有关:如抗致瘤病毒,诱导癌 细胞分化,促进NK,LAK等免疫细胞的杀肿瘤细胞 活性及免疫调节细胞因子分泌,还有可能与对癌基 因的调控有关. 2)目前临床上应用最为广泛的是干扰素a2b, 主要用于治疗各类病毒性感染和肿瘤,但它存在着 血浆清除率高,体内半衰期短,生物利用度低等缺 陷,在临床应用中出现疗效降低,副作用大等缺点. 我们采用活化的聚乙二醇来对干扰素分子中的赖 氨酸残基进行共价修饰,尽管聚乙二醇修饰后干扰 素的生物活性有所降低,但实际上干扰素在很低的 剂量下就可发挥其作用,另一方面,修饰后干扰素 的半衰期显着延长[6],稳定性提高,免疫原性降低, 这一系列的优点都是干扰素所不能比拟的. 3)本结果表明干扰素和聚乙二醇修饰干扰素 对实验中几种肿瘤细胞均有不同程度的生长抑制 作用,并呈剂量依赖型,在同一质量浓度下,后者的 抗增殖作用优于前者,可能与提高干扰素的稳定性 相关,其作用机理其还有待于进一步的研究. 参考文献 [1]吴梧桐.现代生化药学[M].北京:中国医药科技出版社, 2002. E2]林碧蓉(LinBR),姚文兵(YaoWB),沈子龙(ShenZL)等.聚乙 二醇修饰干扰索o:2b的分离纯化和制备[J].中国药科大学 (JmUnW).2001,B2(4):310-312. [3]徐秀兰.生物化学实验与指导[M].北京:中国医药科技出版 社,1994. [4]中华人民共和国卫生部.中国生物制品规程:一部[M].北京: 中国人口出版社,1995. [5]MosmannT.Rapideolorimetrieassayforcellulargrowthand survival:applicationtoproliferationandcytotoxicityassays[JJ. JInnnunolMetl~ds,1983,B5:55—63. [6]姚文兵(YaoWB),林碧蓉(LinBR),沈子龙(ShenZL)等.聚乙 二醇修饰干扰索a2b的体内药代动力学研究[J].中国药科 大学(I,ChinaPlu~rmaUniv)),2001,32(6):457—461. StudyontheTumorCellsAnti——ProliferationEffectofPEG—— lFNc~2b YANGXiao—Bing,YAOWen-Bing,WUWu—Tong,SHENZi—Long SchoolofBio—Pharmac~WS,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanfing210009,China ABSTRACTAIMTostudytheanti—tumoreffectofrecombinationIFNGL2bandPEG—IFNct2bin厕fm. METHODSMTTassaywasappliedtoinvestigatethetumorcellsgrowthinhibitoryeffectby different concentrationsofrecombinationIFNct2bandPEG—IFNa2b.RESULTSThegrowthofSMMC一7721,K562, HeLa,KBandBGCcellswereallinhibitedbyvariousconcentrationofIFNct2bandPEG—IFNa2batdose500ng/ ml,50ng/ml,5ng/ml,0.5ng/m1.CONCLUSIONPEG—IFNct2bwasmoreeffectivethanIFNtoinhibitthe growthoftumorcells. KEYWORDSInterferona2b;Tumor;Anti—proliferation;PEG—IFNct2b