孕妇外周血中单个胎儿有核红细胞的产前基因分析

孕妇外周血中单个胎儿有核红细胞的产前基因分析 孕妇外周血中单个胎儿有核红细胞的产前 基因分析 ,I {;{一s.,{ 孕妇外周血中单个胎儿有核红细胞的产前基因分析 ,/ 邹丽束剑文V徐可树张会军 同济医科大学附属协和医院妇产科,武汉430022 7 摘要为探讨母血中单十胎儿有核红细胞(NRBC)行产前基因分析的可行性,对4s名孕妇外局血行不连续密度 梯度离心,显徽操作获取单个NRBC,A组24倒进行引物延忡预扩增(PEP),后行Y染色体特异性DYZ1基因的聚合 酶链反应(PCR),B组21倒直接进行Y染色体特异性DYZ1基因的PCR.发现4s名孕妇中有24名检出NRBC,A组 中男胎符合率为7O,总符合率为83.3,B组则均束扩增到PCR产物.提录用母血中单十胎儿NRBC经PEP—PCR 法行产前基因分析是可行的. 关麓调芒塑里;鼍?堕苎竺塑;引物延忡预扩增;性别测定.葡f听中田法讣粪号R730. 43,R714,52/J.I ? / PrenatalGeneticAnalysisofSingleFetalNucleated’ RedBloodCeIlfromMaternalBlood ZouLi,ZhuJianwen,XuKeshual DepdI曲 tObstetricsandGynecology,XieheHospital,TongjiMedicalUnmersity,Wulmn430022 AbstractInodertostudythefeasibilityofprenatalgeneticanalysisofsinglefetalnucleatedredbloodcell (NRBC)frommaterna1blood,peripheraIbloodfrom45pregnantwomenwassubjectedtodiscontinUOUSdensi— tygradientcentrifugationtoobtainsingleNRBCbyusingamicromanipulator.Primerextensionpreamplifi— cation(PEP)andpolymerasechainreaction(PCR)ofaY-chromosome—spe cificrepeatsequencewereper— fornledin24patients(groupA),OnlyPCRofaY-chromosome—specificrepe atsequencewRsperf0rmedinthe remaining21cases(groupB).ItwasfoundthatNRBCsweredetectablein24outof45pregnantwolTlen.In groupA,malepregnancywascorrectlypredictedin70.Theovera~agreement ofthediagnosiswas83.3 .IngroupB,theY—specificDNAsequencewasnotamplified,Itwassuggeste dthattheprenatalgenet~ analysisofsinglefeta1NRBCbyusingPEP—PCRmethodisfeasible. Keywordsmaterna1periphera1blood;singlefetalnueleatedredbloodcell;se xidentification;primer extensionprearnplification 从孕妇外周血中获取胎儿细胞为无刨性产前诊 断开辟了一条颇具前景的道路,其中胎儿有核红细 胞(NRBC)被公认为是可用于无创性产前诊断比较 好的胎儿遗传物质来源”..由于通常采用的分离技 术如:荧光激活细胞分离技术(FAcs)和磁激活细 胞分离技术(MAcs)等,所得到的胎儿细胞并不能 避免少量母血细胞的污染,因此努力使胎儿遗传物 质得到纯化对于无创性产前遗传学诊断是具有重大 意义的本研究通过采用显微操作法,尝试在单个 细胞水平对胎儿进行产前基因分析. 1资料与方法 1.1标车来源 外周血采自1999年5月至12月,孕龄为11, 卫生部回国人员启动基金资助项目(卫科教交发[19963第 024号)和国家教委资助课题(教外司留[1996]644号) 邹丽,女,1961年生,主任医师,副教授 3O周,年龄z1,3O岁的妊娠妇女,共45例,无贫 血等合并症.每次采血7mI,置于盛有EDTA抗凝 剂的无菌试管中,生理盐水等倍稀释后备用;另外 各选5名正常男性及5名无生育史的正常女性作为 阳性及阴性对照. 1.2方法 1.2.I不连续密度梯度离心富集胎儿NRBC:所用 分离介质为Pharmaei公司生产的Pereo~细胞分离 液.具体步骤为:用密度为1.085g/ml和1.075g/ m1的Percoll细胞分离液在离心管中制成密度梯度, 将7mI外周血用生理盐水等倍稀释后缓慢加入. 4?下以3000r/min离心30min,收集中层分离界 面细胞,以生理盐水洗涤后,4?保存备用. 1.2.2显微操作法获取单个NRBC:将分离后的细 胞制成涂片,用May—Giemsa复合染色法染色,光学 显微镜下识别NRBC并进行计数.在NRBC出现的 相应范围内滴1,2滴2.5g/Ltrypsin(胰蛋白酶) 溶液,使之易于从玻片上松解下来,然后用微操作 ?340?同济医科大学2000年8月弟29卷第4期 器(日本Narishige产品)轻轻吸取之,置于装有1O 蒸馏水的离心管中,--20?保存备用. 1.2.3DNA提取及引物延伸预扩增(PEP):将上 述获得的细胞在95?下热变性,随后进行碱处理 (200ramol/LKOH/50mmol/L二硫代苏糖醇0) 65?,2min,再用中和液进行中和.参照Ferdinand 法,向反应管中加入PEP反应物,其各物质终浓 度如下:400,~mol/L15mer随机引物(加拿大San— gon公司生产),0.01g/Lgelatin,l0mmol/LTris— HC1pH8.3,2mmol/LMgCI2,5Ommol/LKCI. 0.2mmol/LdNTP,5IUTaq多聚酶.反应体积为 5O1.扩增程序为:92~C,1min,37C,2min,37? 升至55?(1c/10s),55?,4.min,共5O个循环. 取1O反应产物,进行下一步. 1.2-4DYZI靶序列的扩增:聚合酶链反应(poly— merasechainreaction,PCR):参照Takahayashi_5] 法,引物选自人Y染色体长臂特异性重复序列 DYZ1区的一部分,扩增片段长度为149bp.引物序 列为Y1.1:5LTCCACTTTATTCCAGGCC TGTCC一3Y1.2:5’-TTGAATGGAATGGGA ACGAATGG一3反应总体积5O,条件为:94?, 30S,64?,90S,共4O个循环,72?,15min.取 扩增产物1O,加溴酚蓝2m,混匀,点样于2琼 脂糖凝胶上,EB(溴化乙锭)电泳,100V,30rain, 紫外灯下观察结果,照相记录.每次扩增均以1例 无妊娠史的女性及1例男性外周血DNA作阴性和 阳性对照. 2结果 2.1母血中NRBC出现频率 45例孕妇中,有24例检出有NRBC,其余21 例未检出.检出数量从4个/7ml,20个/7ml不 等,平均为8个/7m1.另外5例正常未孕女性及5 例正常男性的外周血中均未检出有NRBC. 2.2PEP爰PCR结果 将获取的24倒单个NRBC行引物延伸预扩增 (PEP)后,其中有2O例出现有非特异性的扩增带, 继续行聚合酶链反应(PCR),结果有7例扩增出Y 染色体的特异性片段,其余13例则未扩增出.预测 胎儿性别男胎符合率为7/10(70),女胎符合率为 13/]4(9Z9),总符合率为zo/z4(833). 土3PCR结果 将21倒获取的单个NRBC全部用于PCR,结 果均未扩增出Y染色体的特异性片段. 3讨论 3.1母血中胎儿NRBC的富积和纯化 在孕妇外周血中,胎儿NRBC数量甚微,有研 究结果表明胎/母细胞数目之比在1:1×1Os,1: 1×l0之间],如何对这些少量的细胞进行富积和 纯化是进行胎儿性别和遗传性疾病诊断的先决条 件.目前,识别母血中胎儿细胞主要应用的是单克 隆抗体识别技术,包括荧光激活细胞分离法 (FACS)和磁激活细胞分离法(MACS),此类方法 均具有快速,准确的特点,但仍不可避免母血细胞 的污染,因而限制了其应用范围.在本研究中,我 们首先用Percoll富积NRBC,从形态学上识别NR— BC,然后采用显微操作法在显徽镜下获取单个NR— BC.尽管成人外周血中NRBC极为罕见,几乎可以 认为若在母体中发现NRBC则必来自胎儿,但仍有 作者提出早孕期孕妇外周血中的NRBC可能由孕 妇本身产生H].本研究发现经显微操作法获取的单 个NRBC用PEP—PCR扩增法证实7例男性胎儿, 另2例男胎因获取的单个NRBc在PEP过程中没 有得到扩增产物,因而就无法再经PCR证实其性 别.因此我们认为从形态学上对胎儿NRBc进行识 别,用显微操作法获取单个NRBC是纯化母血中胎 儿遗传物质较准确而可行的方法. 3.2PEP-PCR扩增技术在单个NRBC基因诊断上的应用 引物延伸预扩增法(primerextensionpreampli- fieation,PEP)u是一种通过随机引物将细胞克隆或 单个细胞进行全基因组扩增,使模板DNA的含量 达到足以被检测水平的较为有效的方法.在此基础 上再进行特异序列的扩增,聚合酶链反应即可完成 对微量靶基因的分析.这对用孕妇外周血中极少量 的胎儿细胞进行产前基因诊断是十分重要的,因为 它更使得用一个样本来完成多个位点的基因分析成 为可能.本研究将A组获取的单个NRBC全部进行 PEP—PCR扩增,除了4倒在PEP过程中没有出现 扩增产物以外,其余的均得到了非特异性的扩增产 物,在接下来的PCR过程中更是扩增出7例Y染 色体的特异片段,因而使NRBC的胎儿来源得到证 实.这说明PEP—PCR法用于单个NRBc的基因分 析是可行的,尽管此法在应用过程中存在不稳定性, 但其作为无刨性产前遗传学诊断的方法之一,无疑 将有广泛的应用前景,以后的实践中,不断加以改 进和完善. (下转第343万) 付志红荨.降钙素在种植窗期子宫内膜的表达及其与不孕的关系?343? 加快.这些结果提示:子宫内膜与胚胎同步表达 CT,CT一方面参与子宫内膜容受性形成,另一方面 促进胚胎发育,以多种机制参与着床. 3.2cT与不孕的关系 本研究发现,存在一些不孕患者内膜组织正常, 而功能异常,与正常妇女相比,子宫内膜异位症,不 明原因不孕患者”种植窗”期子宫内膜中CT表达明 显减少,也许,这正是其不孕的原因之一.输卵管 阻塞性不孕患者CT表达比正常妇女下降,但无显 着性意义.其CT表达较少原因还不清楚.逸些患者 中,胚泡到达子宫腔后,由于内膜”种植窗”期的 开放延迟或功能缺陷而致”种植窗缺乏,胚泡无 法着床匕,致流产.目前尚无一个公认的评价子宫内 膜功能的良好指标,CT特异性表达于”种植窗”期 子宫内膜及在不孕症患者中的异常表达,使其可作 为评价子宫内膜功能的良好指标.Liji-zhu等”应 用RIA技术发现,小鼠内膜腺上皮合成CT后可能 分泌到官腔,其检测方便是其他子宫内膜标志所无 法比拟的.S~hmaK等的动物试验表明,孕激素 通过其受体促进子宫内膜CT表达,雌激素则抑制 CT表达,但在分泌晚期和孕期高水平孕激素却不 能诱导CT表选,说明由其他未知因子参与其表达 调节,但其调节机制和具体作用机理还不清楚,有 待于进一步探讨. 参考文献 1Ying-QingDing,Li_JiZhu,MilanKa/.Progesterone stimulatescalc[toningeneexpressionintheuterusduring implantation.Endocrinology,1994,135}2265 2LinHY,harrisTL,FlanneryMSel.Expression cloningofanadenylatecyclase~coupledcalcitoninrecep- tot.Scre,1991,254:1022 3YoshinageK.FuturepropectofresearchOllendocrinolo- gYofembryc-endometrialinteractions.In:GlasserSR, MulhollJeds.Embry~endomctria1interactions.New YorklPlenulnPre站,l994.151 4NaghashpourM,RosenblattMI,DickersonIMa/. 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