奶牛早孕诊断试纸条的研制及临床试验

奶牛早孕诊断试纸条的研制及临床试验 奶牛早孕诊断试纸条的研制及临床试验 ? 22?中国奶牛?2oo7年第l2期 奶牛早孕诊断试纸条的研制及临床试验 万积成,万志静,唐晓宾,王红玲,廖晨星:,王跃进s,邢风轶,黄联华s (1.北京万华生物有限公司,北京100018;2.北京三元绿荷奶牛养殖中心一分公司,北京101105; 3.北京市沧达福奶牛公司,北京102609;4.北京浅山牧业有限公司,北京101500; 5.北京华晨养殖场,北京101313) 中图分类号:$823.3+5文献标识码:B文章编号:1004—4264(2007)12—0022—04 摘要:用抗孕酮单克隆抗体S,B2D和羊抗鼠IgG分别固定于硝酸纤维膜,并与胶体金标记的抗孕酮单克隆抗 体S,B3EG及其它试剂,应用层析式双抗体夹心法原理研制奶牛早孕诊断试纸,在北京10家奶牛场进行临床 检测试验,对l559头荷斯坦奶牛乳汁中孕酮含量进行临床符合验证.结果明.该试纸条灵敏度高,最低检出 量达5,8ng/mL.与无关抗原均无交叉,且批内,批间变异小;检测1559头奶牛,孕牛l316头,其中试纸检测结 果阳性1274头.可疑32头.复测阳性22头,孕牛阳性临床符合率96.8%;复测后阳性总符合率达98.5%.阴性 对照243头,其中试纸检测结果阴性236头.可疑6头.复测阴性2头.阴性临床符合率为97.1%,复测后阴性总 符合率97.9%.结论:北京万华生物工程有限公司研制的奶牛早孕诊断试纸能够快速,准确地进行奶牛早期妊娠 诊断. 关键词:奶牛;孕酮;早期妊娠;胶体金试纸条 简便而有效的奶牛早期妊娠诊断方法是养牛生产 者及畜牧兽医工作者长期以来亟待解决的问.1958 年.Short发现奶牛外周血浆中孕酮浓度的变化可以反 映母牛所处的生殖状态.后来.Laing和Heap(1971)首 次利用孕酮的RIA检测法.证实了奶牛乳汁和血浆中孕 酮的水平所反映的发情周期各阶段与直肠检查法所评 估的结果相一致【n北京万华生物工程有限公司在完成 国家十五重大科技专项课题任务时.对孕酮免疫原合成 和单克隆抗体制备有了重大发现.获得了针对孕酮小分 子半抗原两个不同抗原决定簇的单克隆抗体,实现了 对奶牛乳汁中孕酮激素含量的高灵敏度检测.在此基 础上,用胶体金双抗夹心法研制了奶牛早孕诊断试纸, 进行早期妊娠诊断试验.目前国内外尚未见报道,现报 道如下: 1材料与方法 1.1材料 孕酮单克隆抗体S3B3EG和S3B2D,A6(本公司细 胞室自制),羊抗鼠多克隆抗体(本公司细胞室自制),氯 收稿日期:2007—09—24 基金项目:"十五"国家重大科技专项食品安全关键技术——农药残留胶 体金免疫法快速检测方法研究.课题编号2001BA804A17—07. 作者筒介:万积成,主任医师,北京万华生物工程有限公司董事长.长期从 事单克隆抗体和胶体金诊断技术的研究及相关产品的研制 开发. 金酸,柠檬酸三钠,NaHCO3,PBS,K2CO3,PEG20000,柠 檬酸缓冲液(以上化学试剂均为纯或优级纯),孕酮 品(Sigma),硝酸纤维素膜(美国Millipore公司), 吸水玻璃纤维纸(美国),吸水板(北京昌平兴寿纸制 品厂),塑料板(北京中源塑料厂),高速低温离心机 (Beckman),磁力搅拌器(FisherScientitle),紫外分光光 度计(日立U2000),DZF一6020真空干燥箱(上海博迅 实业有限公司),XYZ3000喷金喷膜机(美国),切条机 (KinematicAutomation)等. 1.2方法 1.2.1金标抗体溶液的制备及喷金 采用枸橼酸三钠还原法制备胶体金溶液,量取氯 金酸溶液(简称金液)250mL,加0.2mol/LK2CO3,调pH值 至6.5~7.0,搅拌10min;取孕酮单克隆抗体S3B3E.G.加 入到250mL金液中搅拌30min;加入20%PEG20000, 搅拌5min:再加入10%BSA,搅拌10min;离心弃上清 液.同时在紫外分光光度计下进行分析,波长为540nm 时,检测OD值.用pH8.1的柠檬酸一s含糖缓冲液稀 释金液,根据需要配制不同OD值,范围在60至100.用 XYZ3000喷金喷膜机(美国)将金液均匀地喷洒在玻璃 纤维纸上.然后将其移入一个真空干燥箱,干燥至少 5h.干燥后按喷金线切成条型,作为金标垫使用. 1.2.2膜的制备 膜选用美国Millipore产品,规格25mmx100m;安装 中国奶牛?2O07年第12期?23? 膜.调整机器,使膜在两铁板间松紧适度,膜眼应紧靠 膜两边且松紧适度:确认要喷膜的检测线,控制线,检 测线喷适当浓度的孕酮单克隆抗体S,B2D4A,控制线 喷适当浓度的羊抗鼠多克隆抗体.将抗体分放在左右 两边.用XYZ3000喷金喷膜机喷膜;包被后的硝酸纤 维素膜送人干燥室干燥,24h后取出,封人铝箔带,内装 干燥剂.室温存放备用. 1.2-3试纸条的制作 在孕酮胶体金检测试纸底板中部为硝酸纤维 素膜.硝酸纤维素膜上有一条检测线(孕酮单克隆抗 体S,B2D)和一条羊抗鼠多克隆抗体控制线,在底 板一端端头为吸水层,另一端端头为样品吸液层,硝 酸纤维素膜两端分别与吸水层和孕酮单克隆抗体 S,B3EG金标垫相互交叠连接(交叠连接部分在1, 2mm范围),在孕酮抗体金标垫上压有样品吸液层.用 切条机切成所需宽度的膜条.即为胶体金检测试纸 条.组装到相应的检测板中.即为板型胶体金检测试 纸条. 2检测原理 奶牛早孕诊断试纸原理采用胶体金双抗夹心法. 两个特异性单克隆抗体结合到孕酮(P4)分子上的两个 不同位点.再借助胶体金显色效果.依据颜色的深浅来 判断全乳中孕酮的含量. 3试纸条检验结果 3.1性状 外观平整,材料附着牢固,内容齐全. 膜条应宽于3mm;膜条长约80mm;液体移行速度应 不低于20mm/min 3.2特异性 3.2.1阳性参考品符合率 用间接法检测配制成浓度为5ng/mL,6.5ng/mL, 8ng/mL,10ng]mL,12.5ng/mL,15ng]mL,18ng]mL,20ng]mL 的孕酮(Sigma)标准品,作为阳性参考品样品,阳性符 合率>9O%(表1). 表1阳性参考品符合率检验记录表 . "+"表示检测结果为阳性;"?"表示检测结果为弱阳性;"一"表 示检测结果为阴性. 阳性符合率>9O% 3.2.2阴性参考品符合率 检测发情O,5天奶牛乳汁,水,促黄体素样品(LH, 25mIU/mL),促卵泡素样品(FSH,100p.g/mL),促乳素样品 (PRL,100p~g/mL),雌二醇样品(100p~g/mL),双氢睾酮样 品(100p~g/mL),睾酮样品(100p~g/mL),阴性符合率>9o% (表2). 表2阴性参考品符合率检验记录表 "+"表示检测结果为阳性;"?"表示检测结果为弱阳性;"一"表 品示检测结果为阴性. 阴性符合率>9O% 3.3最低检出量 用间接法检测孕酮(Sigma)标准品,最低检出量为 5~8ng]mL(表3). 表3最低检出?检验记录表 . "+"表示检测结果为阳性;"?"表示检测结果为弱阳性;"一"表 示检测结果为阴性. 最低检出量为5-8ng/mL 3.4稳定性 取三批试纸条040321,041230,050112放在37? 恒温箱保存,每周取出8条.用孕牛乳汁和发情牛乳汁 进行检测 37?条件下存放1周相当于3个月.8周相当于24 个月.2007年7月测试2004年12月30日生产的试纸 条,批号为041230,检测16头孕牛乳汁,结果16/16为 阳性;检测16头发情牛乳汁,结果16/16为阴性.检测 结果表明:胶体金试纸条稳定性已远远超出18个月的 有效期,稳定性很好(表4). ? 24?中国奶牛?2007年第l2期 表4稳定性检验记录表 号O40321O41230050112 周孕牛发情牛孕牛发情牛孕牛发情牛 乳汁乳汁乳汁乳汁乳汁乳汁 18,8+8,8—8,8+8,8—8,8+8,8— 28,8+8,8—8,8+8,8—8,8+8,8— 38,8+8,8—8,8+8,8—8,8+8,8— 48,8+8,8—8,8+8,8—8,8+8,8— 58,8+8,8—8,8+8,8—8,8+8,8— 68,8+8,8—8,8+8,8—8,8+8,8— 78,8+8,8—8,8+8,8—8,8+8,8— 88,8+8,8—8,8+8,8—8,8+8,8— 4临床试验 4.1检测时机的确定 孕酮(P4)是黄体和胎盘分泌的一种类固醇激素,乳 汁中孕酮浓度的变化是标示母牛卵巢活动的一项特异 指征.它在母性生殖与妊娠维持过程中起着极其重要 的作用.曾宪垠等研究发现,P4浓度随着母牛所处的生 殖生理阶段不同具有特征性变化.其变化规律为:配种 后1,5天,乳汁中孕酮含量低,小于3ng/mL;随着配种 后天数的增加,孕酮含量也逐渐增加,配种后11天,孕 酮含量迅速升高;配种后11,19天.孕酮含量维持在较 高水平,均大于8ng/mL;配种后1,19天,孕牛与非孕牛 乳汁中孕酮含量无明显差异;20天以后.非孕牛乳汁中 孕酮含量开始下降.配种后21天陡降到低水平(小于 4.2临床结果 1ng/mL),而孕牛乳汁中孕酮含量则继续维持在较高水 平.经统计学T检验,配种后21,24天.孕牛全乳中孕 酮含量显着高于非孕牛(P<0.01)(图1).孕牛与非孕牛 配种后0,29天乳汁中孕酮含量变化明显.通过检测孕 酮含量可以对牛早期妊娠做出准确诊断.因此.采集 配种后2226天乳样并测定其P4含量,对早孕诊断是 切实可行的 0246810l2l4l6l82022242628 发情后天数 —一 孕+非孕}: 图1奶牛发情周期中奶孕酮浓度变化 上图出自:曾宪垠等.《应用双抗EIA检测奶牛发情周期中奶孕 酮含量》,四川农业大学,1996,14(3):454 表5奶牛孕酮胶体金检测试纸临床应用结果单位:头.% 由表5可以看出.在北京市10个大型奶牛场选择 1559头奶牛.其中直肠检查孕牛1316头.用胶体金 检测试纸(批号041230)检测结果阳性1274头.可疑 32头.复测阳性22头,孕牛阳性临床符合率为96.8%; 复测后阳性总符合率达98.5%:0,5天发情牛阴性对照 243头,其中试纸检测结果阴性236头,可疑6头,复测 阴性2头,阴性临床符合率为97.1%.复测后阴性总符 合率97.9% 5讨论 5.1小分子物质不具有免疫原性.需要连接大分子载 体蛋白获得免疫原性.由于一些有机小分子或半抗原是 单价抗原(monovalentantigen).具有一个或特定的抗 原决定簇.通过免疫只能获得针对小分子一种抗原决 定簇的单抗或多抗.一般不能得到可以配对的双抗体, 因此利用免疫层析法检测小分子物质的产品都是采 用竞争法,一般灵敏度40,200ng/mL.用乳汁孕酮诊断 5050 中国奶牛?20O7年第12期?25? 孕牛的界限值各家[4-1o]报道不一.一般将奶牛孕酮水平 在0.6,4.72ng/mL时确定为阴性.未孕;7,8ng/mL以上 确定为阳性.已怀孕;4,8ng/mL时确定为可疑,需复检 或结合临床考虑.因此.竞争法无法进行奶牛乳汁中孕 酮含量的检测针对同一个小分子合成免疫原建立两 个抗原决定簇的配对单克隆抗体的研究是我公司的首 次发现. 5.2孕酮为脂溶性物质.在全乳中分布不均.多在乳脂 中.乳样中孕酮含量与乳脂率密切相关【n】,乳脂率每提 高一个百分点.乳汁中孕酮浓度增加3ng/mL.采样方法 和取样时间也能影响乳汁中孕酮的含量.据报道.傍晚 挤奶时所采样品中的孕酮含量较早晨挤奶时所采的样 品高:每次挤奶时.末把乳的孕酮含量高于前乳,因为 末把乳的乳脂率含量较高.由此可见.采样时间和方法 也是影响测定结果的重要因素【7J因此设计胶体金双抗 夹心法试纸要针对不同地区.不同单位设计不同的检 测试纸.一般原则上.根据临床判断,阳性孕牛的阳性 符合率应达到85%以上.阴性发情牛的阴性符合率需 达到99%以上. 5-3早孕因子诊断法能对受精后24h的早期妊娠生理 进行检测.预测流产,早期胚胎死亡,分析不孕原因等.研 究表明奶牛流产和死胎0,17天发生率为40%[12,13].因 此早孕因子诊断法对奶牛生产无实际指导价值.在配 种后22,26天作出早期妊娠诊断.是最有实用价值的 时期.因为这一时期是在一个发情周期.在此时期确诊 妊娠最具有指导实际生产的意义我公司研制的奶牛 早孕诊断试纸正是对这一时期乳汁中孕酮含量进行检 测.实现了早期妊娠诊断. 5.4奶牛早期妊娠诊断是改善奶牛饲养管理.提高繁 殖率的一项重要措施如果奶牛配种后不能及时诊断 是否妊娠.就会导致产犊间隔延长,繁殖率降低,奶 产量减少.饲养管理成本增高.大大影响经济效益. 据报道.每头牛多喂1d将在饲料,人工,能源等方面 多耗16,32元:另据专家估计.多喂一个发情周期将 增加成本336,672元;如延误1个情期(一般是21d), 每头牛将减少奶产量168,315kg[14]:若能及时诊断. 则其经济效益十分显着.早在上世纪80年代,英, 美,泰,荷兰等国已将孕酮酶免疫检测技术作为奶牛 生产常规服务工具.1983年在荷兰举办了第一届国 际家畜繁殖与保健酶免技术讲习班.1985年8月又 在泰国举办了第二届讲习班.我国华中农业大学动科 院杨利国【?5J教授参加了讲习班我国从80年代末到90 年代初在孕酮免疫原合成和孕酮抗体的制备以及 RIA法,ELISA法等方面的技术已逐步成熟,有多篇文 章对此进行了报道.但至今未能得到广泛的推广使用, 分析原因主要是由于技术操作比较复杂.需专业设备 以及技术人员进行操作.试剂盒的贮存和运输需要冷 藏等原因:其次国内养牛业主要是散养的方式,缺乏专 业的兽医师:加之长期以来奶牛业属于国家扶植项目 体现不出市场竞争意识.本研究研制的奶牛早孕诊断 试纸准确率高.取牛奶检测对奶牛及胎儿绝无损害,操 作简便.无需专业技术人员,5min即可判断结果;试纸 常温贮存,运输方便,价格低廉.当前奶牛业空前繁荣, 竞争意识空前加强.降低成本是当务之急.本产品是一 种理想的早期妊娠诊断产品.具有重要的经济意义和 推广价值 参考文献 【1]LaingJAandHeapRB.Theconcentrationofprogesteroneinthe milkofCOWSduringthereproductivecycle[~BrVetJ'1971,127:1247. 『21段亮,等.胶体金免疫层析技术(GICA)及其在动物检疫中的应 用前景[J].畜禽业,2004,1:59. 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