STING蛋白的初步晶体学的研究（可编辑）

STING蛋白的初步晶体学的研究（可编辑） STING蛋白的初步晶体学的研究 单位代码 分类号 密级 学 号 ?纱?紫力; 硕士学位 论文目: 蛋白的初步晶体学研究 作者姓名 张俊兵 学院名称 生命科学学院 微生物学 专业名称 指导教师 谷立川教授 合作导师 年月原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任觎蔓晕他 个人 或集体已经发泰姑磐歌捞湃恂翻猓。对本文盼畹作出重要面渐人和集 体均已在文中以明确力拭看硼。本声明的法律责任由本人殍相。 日期:丝堡:三翌 谢撇:辱篷叁 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学萑秽褓留、使甩挚圃允姆匀规定,同静学校保留或 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子:撼允许沧艾被查阅和借 阅; 本人授权山东大学可眺侉栏辫撇的全瓿萄鞠盼内容编入毹超嘲静鞍生于检 索,可趴衬聊、缩印莸尉蝮带蜉锻保麓瓮辑吼鲡谇学位论文。山东大学硕士 学位论文 摘要??. ..........。..?.?..........。......?.?...?...........?...?....... ..?...?.?...?.................?. 符号说明 第一章前言?. .人体天然免疫.. .一型干扰素的调控通路??.. . ?肝的相关研究. . 蛋白的发现与研究概况??. . 接受?信号的发现? .课题研究内容,目的及意义 第二章实验步骤.菌株、载体和基因? .实验试剂.基因克隆..聚合酶链式反应??. .. 片段双酶切..重组质粒构建. ..重组质粒转化表达菌株. ..菌落和蛋白表达筛选阳性克隆子 。蛋白质的提取与纯化 ..蛋白质在大瓶中的诱导表达..蛋白质的提取与纯化一 .. 忆蛋白质衍生物的制备. ..晶体的普筛与优化?一 .,衍射数据的收集与处理??.. ..晶体结构的解析??. . 定点突变??山东大学硕士学位论文 第三章实验结果. 蛋白的序列分析. 蛋白不同片段的表达纯化检测.人源和鼠源不同可溶性片段的高纯度纯化 .. 蛋白的纯化. .. 蛋白的纯化 . .及硒代衍生物的晶体普筛. . ?的晶体优化 .. 条件下的优化? ?在 .. 条件下的优化? ?在 .. 的蛋白的纯化和晶体的生长??. ..晶体的后处理过程?.. . ? 蛋白质衍生物的大量制备及晶体的生长?. . 与.复合物的晶体生长与优化第四章。及其与.复合物晶体数据的处理??一 .数据处理与结构的解析第五章?的结构与功能研究 . .的蛋白质结构. .在溶液中以二聚体形式存在. 与.相互作用关键氨基酸的定点突变.突变体蛋白的提取纯化.等温滴定量热 法验证突变体与?卿的相互作用? 第六章总结讨论参考文献??一 攻读硕士学位期间发表的论文??一 致谢山东大学硕士学位论文 摘要 蛋白是天然免疫一型干扰素生成通路中的一个衔接调控蛋白,在细 菌、病毒和真核病原菌的所引起的天然免疫反应中都发挥着重要的调控作 用。 近来研究发现,可以作为免疫感受器识别结合来自病原菌中的第二信使分 子?肝而激活下游通路。之前的研究预测蛋白主要包含一个预测的 端五次跨膜部分和端胞内可溶性的胞质结构域。 有关端的功能目前仍不清楚,可能与其在细胞内的定位有关,如之前的研究 中 发现其可能定位于线粒体或内质网膜上。端胞质结构域 , 可通过募集相互作用分子而发挥重要的信号调控作用。蛋白的氨基 酸序列与中任何已知结构的蛋白质都没有同源性,预示它可能拥有独特的三 维结构。为阐述接受?信号而发挥功能的分子机制,我们利用一 射线晶体学对其进行了结构生物学的研究。 首先,通过对不同蛋白的片段在大肠杆菌内的表达分析,我们得到了 其可溶性的端胞质结构域片段位氨基酸到位氨基酸,命名为。 然后利用座滴法进行晶体普筛工作,最后在.%,.二甲砷酸钠 .和.氯化钙和%/甘油条件下长出了晶体。由于坐滴法 普筛中得到的晶体难以达到一射线衍射及结构解析的要求,因此我们用悬滴 法 对蛋白进行了晶体的优化工作。主要通过以下几个方面:一是将晶体生 长条件中的缓冲液和沉淀剂浓度在上述条件附近进行拉梯度;二是在晶体生 长缓冲液中加入不同种类的和;三是降低晶体生长的温度, 在度下进行晶体的优化培养;四是将晶体进行乙酸锂脱水处理。最终我们获 得 了适合一射线晶体衍射并具有较高衍射分辨率的单晶,并在上海同步辐射中 心 收到了一套.的衍射数据。初步处理结果表明的晶体属。空间群, 每个非对称单位中含有一个蛋白分子,该分子与另一对称相关的分子形 成一同源二聚体。由于蛋白在数据库中没有具有较高同源性的蛋白质 结构大于%,因此我们考虑用蛋白的硒代衍生物来解决晶体结构解 析中的相位求解问题。我们在蛋白普筛长出晶体的条件中直接进行硒代 衍生物晶体的优化培养,最终通过利用蛋白的晶体进行种晶 的方法获得硒代衍生物的单晶,并在上海同步辐射中心收到了一套.山东大 学硕士学位论文 的数据。的晶体属。空间群,每个非对称单位也仅含有一个 伽蛋白分子,该分子与另一对称相关的分子形成同源二聚体。 利用单波长反常散射发法解析的?结构中,以对 称二体的形式存在,以型结构存在,文献中预测的第五段长螺旋其实并不 是跨膜序列,而是作为胞质结构域的组成部分参与二聚体相互作用界面的 形成,并在二聚体内部参与形成疏水核心,该结构是一种全新的折叠形式。 由于解析的?结构中,以同源二聚体的形式存 在。为了验证二聚体的形成并不是晶体堆积所造成的一种人为结果,因 此我们利用凝胶过滤层析法对蛋白在没有和加入?的情况下的 分子大小。结果表明,蛋白在溶液中是以同源二聚体的形式存在,并且不 受?的调控。另外,我们利用等温滴定量热法检测了与? 的亲和力,其解离常数值为.,复合物中与?的化学计 量数之比为:,即一分子的?结合两分子的?,这与之前的研究 结果相一致。 为了阐述识别?肝的分子机制,我们对与? 的复合物进行了晶体的优化培养,并最终收到了一套.的数据,通过对衍射 数据的初步分析,我们发现,?.艘结合的复合物晶体属。。。空间 群,每个非对称单位中含有两个分子与一个?分子。 关键词: 蛋白,一射线晶体学,蛋白质结构,?即 ?山东大学硕士学位论文. , . ? ? . ? ? ? ? ?. ? ?, . . ,. 聊仍. :; ;; .仍 . ?.?, .? ,. ?. , .玳皿, . 山东大学硕士学位论文 .烈仍 . .? ? .. ? .?..仍. .. .. . ... ,? :, , 山东大学硕士学位论文 符号说明溴化乙锭 二甲基亚砜 苯甲酸磺酰氟 聚合酶链式反应 等温滴定量热法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 硒代甲硫氨酸 ?多波长反常散射 ?分子置换 ??己 异丙醇基硫 ? .一半乳糖苷 山东大学硕士学位论文 第一章前言 . 人体天然免疫 免疫系统是机体接受免疫信号、执行免疫应答及免疫功能、维持体内环境平 衡稳定的一个重要系统,是防卫病原菌入侵的有效武器,可以识别病原微生物、 引发免疫反应并最终清除机体异物。机体免疫系统包括免疫器官、免疫组织、免 疫细胞及免疫分子。免疫器官通常分为中枢器官如胸腺,骨髓等和外周器官 如淋巴结、脾脏等两类。常见的免疫细胞包括吞噬细胞、细胞、细胞和 树突细胞等。免疫分子种类较多,如免疫球蛋白、细胞因子、分子等。人体 免疫反应包括天然免疫反应和特异性免疫反应两种。 天然免疫又称之为固有免疫或者非特异性免疫。天然免疫是人体抵御病原菌 入侵的第一道防线,能对入侵的病原微生物产生快速非特异性的免疫效应,是一 切免疫防护能力的基础。天然免疫系统主要包括组织屏障如皮肤、胎盘屏障等, 天然免疫细胞如吞噬细胞、树突状细胞等,天然免疫分子。 天然免疫的特点主要包括:无选择特异性,机体天然免疫作为对抗病原 菌入侵的第一道防线对抗原物质的清除不具有选择性,其作用范围较广。反 应速度快,外源抗原一旦作用于机体,机体天然免疫系统识别后会迅速做出 反应 予以清除。相对稳定,天然免疫一般不会因病原菌的入侵次数及强度而增强 或减弱,其维持一个相对稳定的状态。天然免疫是特异性免疫发展的基础, 特异性免疫只有在脊椎动物体内得以发展,而无脊椎动物的免疫反应都是非特异 性的。 病原微生物入侵宿主过程中产生的一些保守组分可以作为病原相关分子模式 ,被宿主细胞的模式识 别受体 ,识别,从而诱发一系列的下 游信号级联反应并诱导产生细胞因子。之前的研究表明,病原菌内存在多种 /卿可以被宿主细胞识别,包括核酸类、蛋白类、多糖类以及病原菌特有的一 些小分子物质。核酸类又包括,双链和单链等,这些病原体的即 可以游离于免疫细胞之外,进入到免疫细胞的胞质溶胶或者存在与宿主细胞内的 内涵体或者溶酶体中。常见的糖类包括革兰氏阴性菌产生的脂多糖、 革兰阳性菌的肽聚糖以及分枝杆菌产生的糖脂等,,。山东大学硕士学位论文 宿主细胞内目前已知的模式识别受体主要包括样受体?,、?样受体? ,,样受体 ?,,受体 ,和黑色素瘤缺乏因子 ,。其中样受体与?样受体是近年来研究的最多 的两类受体。样受体是真核生物中比较保守的一类模式识别受体,目前己 鉴定出了种样受体。样受体为~型跨膜糖蛋白,具有共同的结构 特征,有胞质区,跨膜区和胞外区三个结构域组成。胞外区高度保守主要负责与 配体分子相互作用,包含?个亮氨酸重复基序,跨膜区富含半胱氨酸,胞内 区高度保守激活后负责招募衔接蛋白,将信号传至下游通路,引起级联反应。 一样受体属于含有/结构域的解旋酶家族。目前共鉴定 出三种,及?视黄酸诱导基因、黑色素基因和,。一 可以识别病原菌的和,而激活下游级联反应,诱导型干扰素的生 成。 目前大量的研究都集中在来自病原菌哪些分子特征可以被宿主细胞检测到 以及宿主细胞识别这些分子特征的机制。对引起免疫反应机理的研究将帮助我们 设计更加有效的疫苗,佐剂和免疫疗法来预防或治疗疾病。 .一型干扰素的调控通路 一型干扰素 ,是一类具有多种效应的细胞因子 家族,由单核和淋巴细胞等产生,可以参与机体抵抗病毒等病原微生物的入侵, 增强机体天然免疫和适应性免疫,影响细胞生长及分化。一型干扰素包括? 和,家族在人和老鼠中目前已知只有一种压型,则包括超 过十种。过去几年的研究中,一系列病原菌识别受体及调控病原菌识别到诱导一 型干扰素生成的调控路径被鉴定出来。依据/识别受体类型可将调控? 生成的分为两类,样受体介导和胞质受体介导的调控路径。 样受体作为激活免疫反应的信号识别受体一直是大家研究宿主 细胞识别病原微生物机制的主要研究对象。样受体主要定位在一些特化的 细胞类型的细胞膜与胞内细胞器上,主要识别外源核酸。哺乳动物中不同的 山东大学硕士学位论文 样受体可以识别不同类型的核酸等,从而一起组成了基本可以识别所有类型病原 体的受体家族。主要识别双链,特异性的表达于树状细胞中;和 主要识别单链;则可以识别分子中未甲基化的元件,这 种元件在病毒和细菌中非常常见;是目前已知的唯一一个识别非核酸 类信号分子而诱导一型干扰素生成的受体,它主要通过识别来自革兰氏阴性菌中 的脂多糖来发挥功能。样受体依赖性的核酸识别的一个关键是这些 受体的细胞内定位,它们的包内定位对于它们识别区分自身及外源核酸具有重要 的作用。以为例,主要通过识别来自酸性内涵体内部的核酸作为信号 来源,如果将其重新定位到细胞表面,则可以识别胞外环境中的自身核酸而失去 识别入侵病原体的能力,, 。 尽管样受体可以在一系列特化的细胞内激活干扰素的生成,但研究表 明几乎所有成核细胞都可以通过生成一型干扰素来抵抗病毒感染。螺旋酶视 黄酸诱导基因和作为胞质受体可以识别病原体,并通过 他们的 招募下激活游衔接蛋白又叫 做,,或者。激活过程中,的结构域被和进行位的泛素化修饰,而其 活性的下调由对其进行位的泛素化修饰调控。位多泛素化修饰的 可以激活线粒体膜蛋白。激活的又可以通过 / ,,,等一系列的调控蛋白,最终诱导产生一 型干扰素,。 山东大学硕士学位论文 札::;,一,~,、一一一.,罨一、~,,.厂?,一一 叫吵移,势~,,..一一一、一 图卜胞质内核酸信号感应路径。胞质内核酸受体识别病原菌核酸类配体分子 后,激发 下游信号级联反应,诱导多蛋白复合物的形成和转录因子的活化,。 ??. . 廿廿 。 . . 的相关研究 ??是细菌内广泛存在的一类第二信使分子,在信号转导过程中发挥 重要的调控作用,在。??肝的发现首次报道于年,但直到近些年, 其在细菌体内功能的重要性才逐渐被被人们所认识。?的合成与分解主 要由二鸟甘酸环化酶和磷酸二酯酶催化完成。蛋白含有一个 保守的?结构域,负责催化两分子的合成一 分子?卿并释放一个焦磷酸。将中的任何氨基酸进行突变后都会使 其活性丧失。蛋白的活性由结构域或结构域所 控制,负责将?艘分解为两分子的,。 ?吒归在细胞内具有多种生理功能。一般认为其在细菌体内作为一个信使 分子与效应蛋白结合,控制效应蛋白活性的开关,再引起下游级联反应。首先 山东大学硕士学位论文 ?咿直接调控着细菌毒性因子的产生。如霍乱弧菌的具有磷酸二酯酶 活性,是表达所必需的,而能够控制纤毛和霍乱毒素的表达。? 还可以调控细菌的运动性。细菌的运动主要通过鞭毛和纤毛的泳动而发生, ?肝可以在转录,和翻译后修饰水平上调控鞭毛纤毛组成蛋白及运动 所需蛋白而发挥作用,一般认为?艘对细胞运动具有抑制作用。?仲 也可以参与调控细菌生物膜的形成。一般低浓度的?.肝可以抑制生物膜的 形成和细胞表面粘着性物质的产生:高浓度的?肝则可以促进生物膜的形 成,并提高细胞表面粘附基质成分的表达,产生多细胞行为。如在霍乱弧菌中 将 编码基因突变后,胞外多糖合成酶的转录显著提高,生物膜形成增加 ,,。 目前已知至少有五种受体效应蛋白可以结合?艘:含有结构域 的蛋白,转录因子,酶失活的结构域蛋白,或蛋白和核 酶,其中研究的最清楚的为结构域。细菌基因组可以编码多种含结构 域的蛋白,结构域的端一般含有两段保守的氨基酸基序/和 代表任何疏水的氨基酸残基参与双核苷酸结合,前者的第二个和第 三个精氨酸是该结构域结合?即的所必需氨基酸, 结构域经常与其它 调控结构域、催化结构域如、和肋刮或者是转运结构域联系在 一起发挥作用。 课题组于年成功解析了?即结合的含有 结构域蛋白/复合物的结构。除结构域外,蛋白还含有 一个一端结构域。复合物结构中,蛋白以稳定二聚体的形式存在单体结 构中也以二聚体形式存在,二聚化主要通过端结构域的螺旋,片段 和,连接片段和的反平行发卡结构的同型接触形成。端结构域和 结构域具有相似的六条片段组成的桶型拓扑异构,两个结构域之间 有一段七个氨基酸组成的有序保守序列/作为铰链将其连接,这 条区直接参与?的相互作用。将结构与复合物结构进行比对发 现,结合?肝后,两个结构域之间的相互作用发生了较大变化。在结 构中,一端的结构域远离段结构域,结合?咿后,推测结构 域向端结构域发生了约度的旋转,整个蛋白由一个伸展的结构变为一个山东 大学硕士学位论文 的配体结合结构。并且在结合?即后,连接两端结构域的保守 区也发生了变化,包括氨基酸碳骨架的二面角,与两端结构域的接触面及与 ?咿的相互作用等。“与?的复合物结构及结合?前后 蛋白所发生的构象变化为我们提供了/及其它 结构域包含蛋白 在信号转导中的一种调控机制,进一步加深了我们对?及其效应蛋白参 与一系列生理反应的机制的理解 ? 翌 图卜 .结构域蛋白/与??复合物的三维结构。蛋白以 .结合 二聚体的形式存在并结合两分子的??.粉红部分为?卜分子。 ??前后的构象变化图。红色部分为连接段结构域和结构域的?? 区。??的结合诱导蛋白质由一个伸展的结构变为较为紧密压缩的配体结合复 合物结 构。 ./ ? ? . 由.??. .由 . ?. 山东大学硕士学位论文 .蛋白的发现与研究概况 又叫,,是天然免疫一型干扰素生成通路中的一个 衔接蛋白,蛋白在细菌、病毒和真核病原菌的所引起的天然免疫反应中都 发挥着重要的调控作用。年,中国武汉大学舒红兵课题组和美国迈阿 密大学的 .课题组利用过表达诱导依赖性的报告基因表 达来筛选调控蛋白的方法,分别从人或小鼠的表达文库中筛选出了同~个 激活转录因子的克隆子,并分别将其命名为和。 等人发现过表达可以激活,而敲出后会抑制病毒所引发的 的激活、一型干扰素的表达和细胞抗病毒反应,并且是胞内和 诱导抗病毒反应所必需的。通过荧光标记和细胞组分纯化的方法,他们发现 蛋白定位于线粒体的外膜并与同样定位于线粒体的膜蛋白相互作用,另外 他们发现也可以通过招募 发生磷酸化并 激活从而诱导一型干扰素的生成。之前的研究表明又叫做, , 在受体介导的免疫反应中发挥重要的调控作用,因此他 们认为可能起到连接信号复合物与调控路径的作用。 .等人同样发现在天然免疫中对? 和 的转录调控具有重要的作用。通过酵母杂交与免疫共沉淀的方法发现可以 与?受体和一种易位子相关蛋白/ 相互作用,因此可能同 . 样参与介导的免疫反应调控。对于蛋白的胞内定位, 研究中认为其主要存在于内质网上,并能通过/ 等易位相关蛋白发生 胞内位置的变化而发挥作用,如果将和另一易位衔接蛋白 敲出后诱导的能力就会被抑制。年, .又 发现在来自各种感染病原菌的?胞内诱导产生干扰素起着 关键性的作用。 .研究小组和北京大学蒋争凡课题组也独立鉴定出了该蛋白,并分别命名为 和 。 等人发现蛋白可以与主要组织相容性抗原 ?相关,并介导死亡信号 的转导。 等人认为是一个四次跨膜蛋白,端跨膜结构域前 山东大学硕士学位论文 为信号肽,蛋白质中间存在两个内质网滞留序列和脚,因此 蛋白质定位于内质网上。 等人用香豆霉素诱导化学二聚化系统 诱导重组蛋白的二聚化,结果诱导产生的量明显增多,因此 他们推断蛋白通过二聚化激活天然免疫反应,蛋白二聚化是其自身激活及 下游信号传递所必需的。 目前的研究中所发现的胞内识别并诱导产生一型干扰素的所有均为蛋白依 赖性的,包括 ? 、蛋白家族成员 、聚合酶 以及 最近发现的/解旋酶家族成员.但对于如何自身活化并激活 下游信号通路虽有了一定的研究进展,但对其具体机制仍不清楚. 等人发现泛素连接酶在 诱导一型干扰素 生成过成长发挥调控作用。是一个泛素化连接酶,可以与发生 作用,对其进行位的泛素化修饰。蛋白的泛素化可以诱导其发生二聚 化,这是蛋白招募并磷酸化的前提条件。而如果将介导其泛 素化的位的赖氨酸给突变掉或者用其他方法处理蛋白而使其不能发生 泛素化修饰,则会抑制激活的干扰素通路。因此推测蛋白的活化可 能是通过泛素化和二聚化来实现的。 除之外,也参与介导诱导的一型干扰素信号通路。识 别中的一类重要受体是,通过其结构域识别配体分子后引起自 身构象的改变而暴露出其末端的结构域。结构域可以招募识别位于 线粒体上的蛋白.而舒红兵课题组发现在静息状态下可以持续与 相互作用。并且可以与持续相互作用。在病毒感染过程中, 可以作为支架蛋白招募蛋白,与的相互作用可以使其位的色氨 酸发生磷酸化,从而增强与的相互作用,介导的磷酸化。另外 活化状态的蛋白为二聚体,而二聚化的又可以拉近与 的距离。可能接受来自的刺激信号而激活一卜?复合物 诱导产生干扰素,。 因此推测,蛋白可以接受来自和不同信号引发下游 级联反应,起到一个枢纽的作用。最近蒋争凡研究组发现,病毒和细胞质内的 核 山东大学硕士学位论文 酸可以引发蛋白招募蛋白到内质网上,并通过对其位的 和位的酪氨酸进行磷酸化。磷酸化的可以发生二聚化并转移到细 胞核内诱导特异性的基因表达,从而发挥免疫反应,更加说明了在机体 免疫反应中的重要调控作用。 。 接受信号的发现。 年发表在上的一篇“?卜 报道了细菌中特有的第二信使分子?归可以引发宿主细胞免疫 反应。李斯特氏菌诱导宿主反应主要通过多药外排泵系统 ,皿分泌的配体分子完成,在李斯特氏菌表达多药外排泵的主要辅助 蛋白家族可以控制宿主细胞质内菌类诱导的?生成的能力,异常表达多种 【可以增强?的诱导产生,其中起到主要的调控作用。由于 的主要功能是运输小于道尔顿的小分子,因此作者假设李斯特氏菌可以通 过分泌一种具有生物活性的小分子被宿主细胞识别而引起免疫反应。并通过 一系 列的实验最终确定?就是这种可以引起机体免疫发应的活性分子,并且 ?发挥作用需要而并不依赖于已知的/和 路径。然而,对于机体如何 识别?并引发免疫反应的机制,并没有给出明确的实验支持。 对于?作为信号分子引发免疫反应的研究首先报道于年。 ? 一文中, 等人发现可以增强小鼠免疫反应,在小鼠体内注射?书后可以活 化单核细胞核粒性白细胞的募集。将人的不成熟树状细胞加入?进行培养时, 二型组织相容性抗原??、细细胞因子、化学 增活素类等如一,的表达量等增强。并且?.可以在分别树 状细胞和巨噬细胞内激活 /和的磷酸化。因此,细菌的??即 可能在宿主体内发挥免疫刺激信号的作用。 随后 .实验室发现 细菌可以在胞质内诱导一型干扰素的生成。?胛可以引发与胞质内 相当的信号反应,表现在激活相似的靶基因转录水平上,主要通过诱导 山东大学硕士学位论文 ?,,?和激酶的激活来完成。并且?的胞质识别路径 不同于已知的所有核酸识别路径,。 年, .在杂志上报道了关于?的最新 研究进展,发现蛋白可能是?的直接识别受体。通过紫外交联反 应发现蛋白可以直接与放射性同位素标记的?艘结合,即使在高浓 度的下也可以特异性识别?,并且在细胞内表达能 够恢复细胞对环状二核苷酸的免疫反应而不能恢复对的反应。通过纯化 蛋白的端结构域得到了可溶性的胞质结构域,并通过平衡 透析法测定与?的结合力值大约为,一个?.仲可以 结合两分子的胞质结构域。为了找到?仲结合和干诱导扰素生成的 关键性氨基酸,他们又对蛋白的一些保守性和碱性氨基酸进行了定点突 变,结果发现不能结合?的突变体失去了感应?.冲信号而诱导干扰 素生成的能力并且所有影响?结合的氨基酸都位于的端结构域 中。除此之外他们还发现突变体 虽然能结合?归并且在过量 表达时诱导干扰素的生成但却不能受?即信号的调控。但有意思的是该突 变体可以恢复 , 巨噬细胞对信号的免疫 反应而不能恢复对?的免疫反应,,,。因此推测环状双核苷酸与 的信号识别及反应路径是不相关联的,蛋白既可以作为环状双核苷酸 的直接免疫信号受体又可以作为信号反应途径的衔接蛋白。 .课题研究内容,目的及意义 蛋白在天然免疫反应中发挥着重要的功能,既可以在机体识别病原菌 和信号分子而诱导干扰素生成通路中的作为衔接蛋白发挥作用,又可以 作为?肝的直接免疫识别受体。但之前对其具体的活化机制,与?艘 相互作用机制及如何招募并活化蛋白的机制都没有明确的回答。本 文主要通过一射线晶体学的方法来解析蛋白及其与?肝复合物的结 构,以期从结构生物学的角度来研究蛋白在天然免疫反应中的调控作用及 其参与识别?艘的作用机理,实验流程如图所示 蛋白是~个跨膜蛋白,之前的研究预测在端含有五个跨膜片段约 山东大学硕士学位论文 个氨基酸和一个端胞质结构域约个氨基酸。人和鼠中的 蛋白在氨基酸水平上有%的相似性和%的一致性,并在斑马鱼和非洲蟾蜍等 不同物种中都有同源类似物,其序列比对结果如图所示。通过对蛋白的保 守型分析及二级结构的预测,我们对人源和鼠源的蛋白截取了不同的片段 用于蛋白质的纯化,最终获得了可溶性的片段。并利用柱金属螯合层 析法,阴离子交换柱亲和层析法及分子筛凝胶过滤层析法获得了高纯度的 可溶性片段。然后用公司的结晶试剂盒对蛋白进行晶体的普筛工作座 滴法,并获得了初步的晶体生长条件。 然后再用悬滴法对晶体进行优化培养,通过尝试各种优化方法,并最终获得 了适合衍射、单晶性较好的口、硒代蛋白衍生物及与?卿的 复合物晶体,然后在上海同步辐射光源中心收到了晶体的衍射数据。通过结 构解 析,我们获得了的的晶体结构,分辨率为.。通过对 结构的分析及实验室解析出的复合物结构,我们对蛋白二聚化、其结合 ?的分子机制及?调控蛋白分子构象的变化有了一个清晰 的认识,并直观呈现了介导蛋白二聚化的关键性氨基酸,从而加深了我们 对蛋白接受分子信号并激活下游通路的调控机制。 图实验流程图包括重组质粒的构建、原核诱导表达、蛋白的提取与纯化、晶 体 的生长与优化、晶体结构的解析以及生化实验的验证。 ? 。 山东大学硕士学位论文 叵 ,, , . 山东大学硕士学位论文 第二章实验步骤 .菌株、载体和基因 大肠杆菌,,,为本实验室保存; 由山东大学医学院龚瑶琴教授赠送; 表达载体一,,为本实验室保存。 .实验试剂 培养基: 蛋白胨 酵母粉 氯化钠 。高压灭菌分钟或。高压灭菌 。 室温保存 称取蔗糖,加超纯水至终体积为 ,再加入终浓度为.%的溴酚蓝 并充分混匀。 ? :室温保存 . % ? % 甘油 % %/% % %溴酚蓝 山东大学硕士学位论文 胶: 分离胶% 浓缩胶 . . . . . ?. . . %丙烯酰胺 %丙烯酰胺%% 皿过硫酸铵%.过硫酸铵%溴酚蓝% 胶染色液室温保存 冰乙酸 乙醇 考马斯亮蓝 胶脱色液室温保存 冰乙酸 乙醇:. : 补至 :.山东大学硕士学位论文咪唑 补至 :.咪唑 补至 :. 补至 抽滤,?冰箱保存 :. 牢至 抽滤,?冰箱保存 :.补至 。 抽滤,?冰箱保存 山东大学硕士学位论文 ×储液高压除菌: 咿 .补至 适应性培养基: % 补至 硒代蛋白衍生物表达培养基: .% % .基因克隆 .. 聚合酶链式反应 体系×: . : . ’: . ’:: . : . 。 山东大学硕士学位论文 根据上述反应体系将各组分加好混匀后,放置于仪中,设置程序。 变,。退火温度根据引物设置退火、?延伸延伸时间根据片 段的长度确定,延伸速度约 /,共延伸个循环。循环完成后, 。终延伸 ,琼脂糖 。然后将产物加上对应体积的 凝胶电泳纯化回收产物。 .. 片段双酶切 体系: ×将体系混合后,在。下反应到个小时,后直接用回收试剂盒 进行产物回收。 ..重组质粒的构建 反应体系:: :× :表达载体为,端标签,室温反应个小时。 ..重组质粒转化表达菌株: ?将的感受态细胞从冰箱取出后,在冰上静置融化。 ?将连接产物全部加入到感受态细胞后,在冰上静置约。 ?然后?热击处理一分半时间。 ?冰上静置冷却后,向管中加入的无抗,度复苏培养, 转速。 ?将复苏产物全部涂布于相应抗性的平板上培养过夜,重组子抗 山东大学硕士学位论文 性筛选。 ..菌落和蛋白表达筛选阳性克隆子 ?菌落检测 以 片段上对应的上下游引物进行菌落,如果抗性筛选板上长 出的单克隆为成功转入重组质粒的菌落,则会出现阳性条带。并用不含有此 片段的大肠杆菌作为阴性,验证试验结果。具体步骤为:首先挑 取一个单克隆菌落与含有相应抗性的培养基中,度培养小 时至菌长浓。然后取出进行检测和蛋白表达检测,剩余保存菌 种。按照每 体系加的大肠杆菌进行反应,后用琼脂糖凝胶电 泳进行检测结果。选取阳性的克隆子进行表达。 ?蛋白表达检测 阳性的各个样品中,在剩余的 培养液中分别加入的 异丙基一一硫代吡喃半乳糖苷,储液浓度为./,度诱导表达小时左右,离心收 集菌体,倒掉上清,用 的 蛋白质 重悬后,在?变性,然后蛋白电泳,经考马斯染液染色后脱 色后,检测分析目的蛋白在菌液中的表达情况。 选取检测和蛋白表达均为阳性的重组克隆子,扩大培养后,提取 质粒质粒快速提取试剂盒购自公司。质粒送至济南博尚公司测序, 测序正确的质粒和菌液分别保存于和度冰箱内。并将重组扩大培养 检测蛋白表达及纯化情况。 .蛋白质的提取与纯化 ..蛋白质在大瓶中的诱导表达 将上一步中的测序正确的质粒转化至原核表达菌株实验室常用的包括 ,和等中,接种至的 培 养基中过夜培养。第二天将的菌种全部加入到含相应抗生素的液体培 养基中,在。摇床中培养个多小时后,至培养液枷在..之间,降 温质?,。或?。降温一个小时后加入的母液浓度为 山东大学硕士学位论文 ./诱导蛋白表达过夜,第三天进行蛋白的提取与纯化实验。 ..蛋白质的提取与纯化 蛋白质的提取与纯化过程中样品要保持低温,以保证蛋白尽可能不变性。首 先将大瓶菌液导入离心瓶中,离心收集菌体,倒掉上清。再 在每升菌体中加入约的重悬,振荡器悬浮菌体,冰上放置, 对应每升的菌液中加入蛋白酶抑制剂母液浓度/和的 酶终浓度为/。冰水混合物上进行超声或高压匀浆破碎,取的破 碎细胞液于的 中,记作样品。细胞裂解液在高 速离心机离心,转速离心。可溶性的蛋白样品将存在于上清液 中,同样取的上清液与 中,记作样品。 蛋白的第一步粗纯化用的是镍离子亲和层析的方法。柱用之前先用 进行杂蛋白洗脱后,再用重悬洗两次,使柱得以再 生。然后将破碎离心的上清液在度层析柜中加到处理过的柱上,流下的 液取样记作,等上清流完后,用含低浓度咪唑的 冲洗,可去除部 分非特异性结合的杂蛋白,冲洗液取样记作。然后每个亲柱中加入约 的洗脱缓冲液,取样记作。分别将样品,,,,在度加热处理 后,?电泳检测目的蛋白的表达、可溶性、粗纯化结果及量的多少。 蛋白的第二部纯化为离子交换层析,主要根据蛋白的等电点差异选择性的结 合到阴阳离子交换柱上,再用梯度盐离子洗脱进行纯化。实验室常用的阴离 子和 阳离子交换柱分别为和柱,本实验用到的为阴离子交换柱。 将柱洗脱下来的蛋白液用溶液 ,.稀释倍后, 上样到平衡处理过的柱上。然后用溶液和溶液在上自动混合程序进 行先行梯度洗脱蛋白。根据紫外吸收峰确定收集蛋白的管数,并取样 电泳检测蛋白的纯度。并根据紫外吸收峰的形状,如有无“肩膀”出现及峰 的两 侧是否对称、峰的形状是否尖锐来判断纯化的蛋白的性状。 选择浓度较高的几管蛋白倒入加有选择超滤膜的超滤浓缩杯中,超滤浓 缩样品至的终体积。高速离心后,上样到已经平衡过的凝 胶过滤层析柱上。流速为./左右。选取紫外吸收峰处的蛋白质进行蛋白 质电泳检测蛋白质纯度和量的大小。将浓度较高的几管合并,测蛋白质浓度 后, 山东大学硕士学位论文 按每管分装到管中,用液氮速冻,并储存于。冰箱中待用。 .. 蛋白质衍生物的制备 由于蛋白的胞质结构域没有已知的同源结构,仅有其 的数据不足以解析其结构,因此需要用其硒代衍生物晶体的衍射数据来进行 相位 的解析工作。首先是制备硒代甲硫氨酸蛋白衍生物。重组的 质粒转化大肠杆菌,通过抑制其正常甲硫氨酸合成,而代之以 ,从而获得目的蛋白的硒代衍生物。 第一步,将含有目的蛋白重组子克隆的菌株接种到相应抗生素的 中过夜培养。然后配制的 适应性培养基,将 新鲜的培养液全部加到 中,进行初步的培养,至浓 度达到?为..。然后再 ,?离心约 后收集菌体,用 约 表达培养基重悬洗涤菌体,重复 , 离心约,弃掉上清,用 将菌体悬浮起来。按 照每升的表达培养基加入的悬浮菌体,共的量,并在每升培养基中分别 加入六种必需氨基酸: 的一苏氨酸、一赖氨酸和一苯丙氨酸, 的 一缬氨酸、一亮氨酸及一异亮氨酸;培养到蝴为..时,降温至?, 分钟后,往每升培养基中加入 的代甲硫氨酸;过 后再加 入约的母液浓度为./诱导蛋白表达,培养过夜后,提取纯 化?蛋白质衍生物,纯化步骤与蛋白的方法相同。 ..晶体的普筛与优化 与小分子不同,大多数蛋白质及其它生物大分子都是在水溶液中发挥功能 的。如图所示大多数大分子在溶液中达到一个过饱和状态时都会倾向于形 成晶体。蛋白质结晶是一个高度有序化的过程,在溶液中由随机排列状态转 变成 有规则排列的固体状态。由于溶剂的减少或蛋白质溶解度的降低等,蛋白质 在溶 液中由不饱和状态慢慢变为过饱和状态时,能够形成具有一定体积的晶核, 溶液 中的蛋白质分子失去自由运动的能量如平移,旋转等,而源源不断地结合到新 形成的晶核上,同时结合到晶核上的蛋白质分子也会慢慢的转变为溶液状态中 去,依此形成~个平衡的过程,随着蛋白浓度的不断升高,新的平衡点不断发生, 最终形成具有一定大小的晶体。蛋白质结晶往往在高浓度,低过饱和度状态下产山东大学硕士学位论文 生。因此通过不断改变影响蛋白质溶解度各种因素,如溶液中的离子强度、 值、有机溶剂含量和溶液所处的温度等,可以使高浓度的蛋白溶液达到低过饱和 度状态而促使结晶的产生. 蛋白质的结晶方法主要包括分批结晶 、液一液扩散 ? 、蒸气扩散 和透析法 。目前最常用的为蒸汽扩散法,包括座滴法和悬滴法两种,两种方 法都需要在封闭的体系内进行。封闭体系内纯化的蛋白、、沉淀剂混合的 小液滴与只含有和沉淀剂的池液形成一个平衡体系。起初沉淀剂浓度不 足以使蛋白质达到一个过饱和状态,随着时间的延长,液滴内的水不断向池液内 扩散,而使液滴中的蛋白质和沉淀剂浓度不断升高。到达一定程度后,液滴内的 蛋白就会达到一个过饱和状态,而形成晶核,最终形成晶体。座滴法与悬滴法的 区别在于液滴的的垂直状态不同。通常,蛋白质越纯,生长晶体几率越大。因此 蛋白质晶体实验中,一般要尽可能获得纯度最高的蛋白质溶液。 沉淀剂主要包括盐、聚乙二醇或有机溶剂。盐离子可以起到屏蔽蛋白分子表 面电荷的作用,而减弱蛋白质分子间的相互排斥力。盐离子也可在蛋白质周围形 成水化层,而降低蛋白质的聚合,使其溶解度升高。当盐浓度较低时,随着盐浓 度的升高,蛋白质溶解度升高,即盐溶作用;当盐浓度较高时,随着盐浓度的升 高,蛋白质溶解度降低,即盐析作用。聚乙二醇是极性分子,对水有高亲和性。 它可以不同的方式影响蛋白质的溶解度。由于水化层的原因,蛋白质分子表面具 有聚乙二醇分子中心不能接触的地方,当蛋白质分子发生聚集时,其表面的水化 层会发生叠合而使得聚乙二醇与蛋白质分子的接触面积增大,它们的熵增加,系 统的自由能降低。因此,加入聚乙二醇对蛋白结晶具有较好的效果。目前也有多 种分子量的聚乙二醇,,,,等作为 沉淀剂配制成各种结晶条件的用于商业化结晶试剂盒。而有机溶剂可以 降低溶液的介电常数,而使蛋白质分子周围双电层被压缩,蛋白质分子彼此 更加 接近,更容易发生聚合形成晶体。最常用的有机溶剂为. 实验室晶体的普筛主要用座滴法,在孔板中,首先将购买的结晶试剂盒 中的各种 加到池液中,再按池液和的蛋白点到两侧的小孔 内,然后用胶带封好,观察晶体的生长条件。晶体的优化一般用悬滴法,在 山东大学硕士学位论文 加入池液,上面涂上高真空硅 孔结晶板中,按优化条件将配好的 脂,然后将蛋白与池液各的量点到盖玻片上,每个盖玻片上可点四滴,然后 将盖玻片反扣到涂有硅脂的结晶孔上并密封好。池液和液滴就不断的会有溶 剂分 子扩散交换,直到池液、空气、悬滴液三者达到平衡。 图 .蛋白质的溶解度曲线图.蛋白质结晶悬滴法示意图.蛋白质结晶座滴法 示意 ? . 图 . . ... . ..衍射数据的收集与处理 ... 一射线衍射原理 射线是一种电磁波,其波长范围为.’ ,而一射线晶体学研究中的 射线波长主要在.’. 之间。晶体是由各种原子有规则的排列成的晶胞所 组成,但入射射线波长与规则排列的原子间距离比较接近时或者在同一数量 级 时,不同原子散射的射线就会相互干涉,使得某些方向上产生较强的射线衍 射,从而形成具有一定规律的衍射图谱。因此,晶体的射线衍射本质上是光的 山东大学硕士学位论文 散射在三维空间上的叠加。衍射现象的发生需要满足定律: 入 潞貉獭 ?瓣她’ 图 射线在相邻晶格面的衍射图示及布拉格方程的推导 .? ?’. 当两束光在相邻晶格面的反射光程差是波长的整数倍时,信号将互相叠加, 此即产生可观测射线的衍射条件,即条件。其中表示晶格间距, 表示入射角,九代表光线波长,代表衍射级数 一射线衍射图中,每个衍射点的强度反应了一射线经过晶体内有序排列的 蛋白质分子的衍射叠加后的各条衍射线的强度,其强度值正比于衍射线结构 振幅 的平方,即即址呲 。而衍射点的分布表现出每条衍射线的方向。衍射的产 生仅与波束的入射角和晶胞参数有关,而与晶胞内的原子数量和种类没有关 系, 因此晶胞内蛋白质的结构信息都包含在衍射点的强度分布上。 山东大学硕士学位论文 过积分可以将衍射图谱上的衍射点转化为强度数据。多数时候可以在收集数据前 积分几幅衍射图,如分别在旋转,,,度下收集的衍射图谱,并以此来确定合适的曝光时间。最后一步, 统一与合并 。数据 收集中每张衍射图谱的曝光时间总是存在一些细小的差异,因此习惯在合并前将 每张衍射图谱的衍射强度乘上一个比例因子同一标准。然后将相同指标化的衍射 点合并,产生一套全部由独立衍射点构成的数据。数据处理完成后需要对数据的 质量进行评估,主要检验的参数有以下几个:完整度、最高分辨率、/、 分布以及/等。 ..晶体结构的解析 蛋白质结构解析过程中的一个关键问题是相位的求解,目前主要通单波长反 常散射法 ,、分子置换法 ,、多波长反常散射法 ,】『以及过多同晶型置换法 , 等。如果蛋白质有同源结构存在,一般用分子置换的方法完成;而没有同 源结构时,一般用代衍生物的单波长或多波长反常散射法来对相位进行求 解, 而本文中蛋白的结构解析用到的是单波长反常散射的方法获得相位。 当用一射线照射蛋白质晶体时,蛋白质的各个原子会发射电子散射波,一 般在推导结构因子函数时会假定电子为自由状态,而实际存在的电子会受到原子 核的束缚而发出与自由电子散射波偏离的散射波。两者散射波的偏离量就称之为 反常散射。组成蛋白质的、、、等原子序数较小的原子的反常散射基本可 以忽略不计,而将蛋白质内引入一些重金属等,由于这些重金属的反常散射是不 可忽略的,就会对结构因子产生影响,破坏衍射强度的中心对称性。反常散射法 正是利用通过蛋白质自身及其重原子衍生物在中心对称的衍射点强度上的差异 来或得晶体衍射的相角。 天然蛋白质中基本都含有甲硫氨酸,利用原子替换掉甲硫氨酸中的硫原 子,并利用的单波长或多波长反常散射进行蛋白质晶体结构的解析目前已经 成为人们求解无同源性蛋白质结构的主要方法。而单波长散射法求解蛋白质结构 的首要任务就是确定反常散射原子的位置,一般用直接法或者帕特森法求得。单 波长反常散射求解相位时一般会得到两种结果,即相位双解,其中只有一个 正确山东大学硕士学位论文 ., . .. 定点突变 定点突变是指通过聚合酶链式反应等方法向目的内定向引入突 变的方法,包括碱基的添加置换和删除。目前定点突变主要有两种方法: ? 和 法。公司的 可以直接在质粒中引入定点突变。首先根据定点突变的要求设 计一对合适的引物,然后用 聚合酶进行反应,按照度 分钟预变性,度秒,度分钟,度延伸大约两分钟每的设定延 伸时间,重复个循环左右。完成后,取少量进行凝胶电泳检测 反应结果,并将剩余的产物中加入,只能识别酶切甲基化的模板 链,因此新合成有缺口的链被保存下来。转后大肠杆菌,大肠杆菌会在突变 位点附近将切口修复,获得定点突变的环状重组质粒。山东大学硕士学位论 文 第三章实验结果 . 蛋白的序列分析 蛋白的氨基酸序列分析结果如图.及附录图所示。人源的蛋 白分子量大约为.,共个氨基酸。端约个氨基酸通过 服务器预测含有四段跨膜螺旋,且端序列通过服务器预测均为长 螺旋,而第四段预测的跨膜序列仅为.左右。而将人源的 蛋白与老鼠、鸡、非洲蟾蜍、金黄色鲫鱼中的同源蛋白进行序列比对发现, 蛋白在这些物种中序列一致性较高,尤其是预测的第四段氨基酸序列极其保 守。 依据以上对蛋白序列的分析结果,我们分别设计了不同的蛋白片段 进行蛋白质的可溶性检测。所用载体为和实验室改造自, 分别为端和端标签。 所用引物如下表所示:山东大学硕士学位论文 其中,红色部分为酶切位点. 可 ??? 卜??丁 ~???????,卅一~?、??,????..??一?,,~一?一?‘., 一??口 口 卜?????一.?卜??????卜??卜?.??卜??????.?.? ? ?.??卜?舶? ???? ? ? ??一? 口沁 ?小 ? ? .??一 ??一 ????啊..???????一 ????????.???.一一? 一?一??一卜???.?????一?????..?卜???.???? 月。 产叫广 盥?散。越殓&岛蝴日酗 ? 目。 呈 画 ??悖 ? 瓣黧 .阳 ? ; 嚣蠹星汕 ?州憎憎“ .?忙 ” .? 宝鬟? 窒毫叶??山 图. 蛋白的序列分析。为蛋白利用中软件预测的二级 结构。为服务器预测的蛋白的跨膜序列://.../ /?.。为人蛋白与、、、、 和中的同源蛋白的多序列比对结果,多序列比对软件为,预测的最后一 个跨膜序列用品红色框标记。.. .. , , , , .