山羊胚胎移植技术研究

山羊胚胎移植技术研究 动物胚胎移植技术研究及应用，在我国起始于二十世纪70年代中后期，且以绵羊的手术移植开展最早，成功率最高。已逐步发展成为家畜繁殖工程中成熟度高，应用前景好，推广性强的一项先进技术。它在家畜纯种繁育、快速扩群、提高优质高产品种比例等方面具有重要作用。但是，胚胎移植技术在贵州尚未形成生产力，推广应用尚未广泛，目前只有少数几家科研、教学和生产单位，依托国外专家和技术进行先期试验和应用。究其未能形成生产力，未能广泛推广应用的根本原因，主要在于其技术难度较大，某些技术环节尚待改进，尤其是利用本地山羊作受体进行胚胎移植，还有一系列技术难题需要解决。 镇远华盛科技有限公司于2003年承担黔东南州科技局“山羊胚胎移植新技术研究与推广应用”和“贵州省财政扶贫资金牛羊胚胎移植”项目之后，积极引进技术和培养人才，选送公司技术人员赴浙江大学临安基地学习羊的胚胎移植技术，并大力进行供体羊（波尔山羊）、受体羊（本省山羊）、设备、仪器、药物等方面的准备工作。于2003年11月12日在浙江大学余颂东教授的指导下，率先在我州开展了山羊鲜胚直接移植试验。2004年1月15日在北京安伯公司（按贵州省农业厅与该公司购买冻胚及承担移植的协议）技术员指导下开展了山羊的冷冻胚胎移植试验。载至2004年6月中旬，进行了三批次鲜胚直接移植和冷冻胚胎移植，现已产胚胎移植羔羊38只，尚有胚胎移植后怀孕母羊47只。初步试验即获得鲜胚移植受胎率62.66%，冻胚移植受胎率53.4%和第二批鲜胚移植妊娠率比第一批提高了12.66个百分点的良好效果。 现将本公司山羊鲜胚直接移植和冷冻胚胎移植试验研究及成果报告如下： 一、供体母羊、受体母羊和种公羊的选育 1、供体羊群选育  于2003年5月从湖南吉首种畜场选购发育良好，具有多胎遗传特性的成年波尔母羊4只作为供体羊，平均体重60.3kg、平均体高66cm、体长76cm、胸围91cm。与其产地的体重、体尺相近。并分别进行编号，打上耳标。 2、受体羊群选育  于2002年12月，分别在本省德江、三穗、镇远三县选购健康无病、发育良好、尤其是无生殖疾病的经产（1—2胎）母羊199只。通过一个生产周期的观察，选择出母性强，泌乳性能好，无流产、难产史，发情周期正常的母羊作为受体羊。其中：贵州白山羊132只、黑山羊48只、麻山羊19只。平均体重34.6kg、平均体长65.3cm、胸围74.4 cm、体高 56.3cm，并分别进行编号，打上耳标。 3、种公羊选育  分别于2003年5月从贵阳克尔索公司购进波尔公羊1只，作为种公羊。2002年12月购进黑山羊种公羊1只，作为试情羊。 4、种羊群的饲养管理  供、受体羊群全部按品种、性别进行分圈舍饲，其中种公羊单只单圈饲养。圈舍为双列式，用木条钉成留有2厘米缝隙（便于粪便下漏）的羊床，每圈之间又用铁栅栏相隔。圈外设有宽敞的运动场，供羊活动和进行日光浴。另外，坚持每天野外放牧4—6小时。 供料供水：先投青饲料，后补精饲料。每头日供青料和青贮料2kg，精饲料0.35kg，添加食盐5—8g/只；饮水为自来水乳头式饮水器全天供水。 精饲料配方：玉米60%、麦麸16%、豆粕20%、磷酸氢钙2%、碳酸氢钠0.3%、氯化钠1%、铜1g/50kg、铁7.5g/50kg、锌6g/50kg。 青饲料搭配：鲜青饲料有皇竹草、牛鞭草、紫花苜蓿、菊苣等，青贮饲料有玉米、皇竹草青贮，两种饲料搭配进行饲喂。供体羊和种公羊还加喂胡萝卜等块根多汁饲料。 二、供体羊、受体羊同期发情处理 1、受体羊同期发情处理  我们按供、受体比例为1:10的比例，选择繁殖机能正常、膘情中等的受体母羊作为胚胎移植羊。于胚胎移植前22天左右，将海绵阴道栓同时埋植于母羊阴道深处，至第16天早上取出。期间在第14天给受体羊肌注PMSG 200国际单位/只和维生素ADE 4ml/只，促使受体羊群同时发情。 2、供体羊超数排卵处理：在给受体羊埋置阴道栓的同时，也给供体羊埋置阴道栓。埋栓后第13天至第16天，每天早、晚各一次肌肉注射促卵泡素，连续注射4天，第17、18天观察母羊是否发情。发现发情后取出阴道栓，用波尔公羊进行交配，而且每隔8小时重配一次，至少交配4—5次，直至母羊不愿意再接受爬跨时为止。配种结束后，又继续埋置阴道栓进行保胎，直到手术取胚时才取出。 经过同期发情处理和超数排卵处理的供、受体母羊，都要进行精心饲养与管理。特别要防止发情后偷配现象发生。 三、鲜胚采集、冻胚解冻和检查鉴定 1、胚胎的采集：以发情日为零天计，在第七天进行剖腹取胚。供体羊在术前空腹12小时并进行术部刮毛，取仰卧姿势保定于手术台上，术部用温水和肥皂洗净，用碘酒和75%酒精消毒。然后，经耳静脉注入镇静剂与麻醉剂混合剂进行全身麻醉，用手术刀在乳房前沿腹中线一侧切开3—5cm的切口，将其子宫和输卵管暴露于创口表面。先在子宫角基部插入回收管，然后在同侧子宫角尖端用注射器注入冲胚液50—60ml，完毕后再冲洗另一侧子宫角。冲胚液从回收管接入集卵杯内，最后用拇指和食指捋子宫角一遍，以使冲卵液全部流出。冲胚结束，从术口注入青链霉素生理盐水后立即缝合消毒创口，单圈饲养，加强管理，注意观察切口愈合情况。 2、胚胎的检查和鉴定：根据山羊卵子的比重、大小、形态和透明带完整情况等特点，将回收到的冲胚液放在体视显微镜下查找受精卵（即胚胎）和进行鉴定。每找到一枚胚胎后，先用拔针清除胚外围的粘液和杂质，用事先已吸入少许培养液的吸管将胚胎吸附后移放于培养皿内，再用培养液对每枚胚胎进行冲洗3—5次，又移入另一培养皿内继续冲洗。每移一个培养皿都要更换新的微量器塑吸头，每头供体母羊的胚胎都集中存放在同一培养皿内。然后，再逐一将每枚胚胎放在10—20X倍连续变倍体视显微镜下，观察其发育情况。一般以胚胎形态完整、轮廓清晰呈球形，分裂球大小较一致，结构紧凑，色调和透明度适中，无附着的游离细胞及液泡者为合格胚胎。否则为不合格胚胎，不能用于移植。 3、胚胎装管：将确定为发育正常、可用于移植的胚胎收集到移植针内。在使用移植针吸取胚胎前，要事先吸进少量培养液体，再吸入少量空气，然后才将含有胚胎的少量液体吸入，再吸入少量空气、又吸入少量液体，最后让移植针尖端保留一段空隙。装好后待用。 如作为冷冻胚胎进行长期保存，应装入专用保存管内，经降温处理后装入液氮罐中存放。 4、冷冻胚胎解冻  目前我们试验研究用的胚胎，为加拿大血统波尔山羊的冷冻胚胎，由北京安伯公司提供，在移植前需作解冻处理。是：从液氮罐中取出胚胎保存细管后，迅速在3秒钟内放入38℃温水中浸浴10秒钟后取出。先用75%酒精棉球消毒胚胎保存管外壁和剪刀，剪去保存管的棉塞端，然后与带有空气的1毫升注射器连接，再剪去保存管的另一端，推动注射器将管内胚胎推入10%甘油和蔗糖的PBS解冻液中，放置5分钟，再依次移入6%、3%、0%的甘油和蔗糖PBS解冻液中，每次移入一种浓度的液体内都要停留5分钟，最后移出PBS解冻液，保存于培养皿中镜检待用。 四、胚胎移植方法 胚胎植入受体母羊子宫角内的方法，国内外目前主要采取手术法、非手术法（用特制移植器将胚胎直接注入到子宫角内）、内窥镜法等数种。我们主要采用手术法和内窥镜法两种。其技术操作要点如下： 1、手术法移植：将受体母羊空腹24小时并进行术部刮毛后，取仰卧姿势保定于手术台上，用温水和肥皂洗净腹部（术部），先用碘酊和75%酒精消毒，再在术部皮下注射0.5%普鲁卡因5ml进行局部麻醉。然后，用手术刀在乳房前沿腹中线一侧切开3—5cm的创口，用食指与中指牵引出卵巢和子宫角，观察两侧卵巢上黄体、卵泡的数量、大小等，以判断双侧子宫或某侧子宫是否符合进行胚胎移植。确定后，将装有胚胎的移植针从子宫角尖端刺入子宫角内，输入胚胎。 缝合与术后处理：注入胚胎后，迅速将子宫角复位。向腹腔内注射青、链霉素生理盐水，切口分三层缝合后用碘酒消毒。术后隔离饲养，每天定时进行试情观察，若2个情期内不再发情，按妊娠母羊进行饲养管理，注射黄体酮保胎。 2、内窥镜法移植：将空腹羊呈仰卧姿势保定于手术车上，进行术部擦洗、刮毛、消毒和局部麻醉后，把保定车尾段升高使受体羊呈臀高头低势，用手术刀在腹中线两侧各切开一个1.5—2cm的切口，用内窥镜套管穿透腹膜，然后将内窥镜探头从套管内探入腹腔中，通过内窥镜找到卵巢，查看黄体发育情况，以判断是否符合植胚。确定后，用固宫钳从另一切口中套出发育正常的子宫角，同时撤除内窥镜及套管，用针头在子宫角尖端扎一小孔，将装有胚胎的移植针从小孔中插入子宫角后将胚胎输入。植毕，用青、链霉素生理盐水冲洗子宫角后复位，并对切口进行缝合消毒。 五、受体羊观察及妊娠母羊饲养管理 1、受体羊术后观察及饲养管理 管理与观察：胚胎移植后，母羊进行分圈管理，严密观察其精神表现和饮食状况等2—3天，同时作好记录。保持圈舍清洁、干燥，饲喂干净的清水、草料。温度低时，给母羊补饮温热水，防止感冒和应激现象发生。移植3—4天后，每天运动量保持在4小时左右或近地放牧。 饲养：给料量由少到多，初期每天喂干草0.5kg/只、青草1kg/只，并逐日增加。一星期后恢复到正常给料量：每天给精料0.25kg/只，青贮料2kg/只、干草0.5kg/只，青草1kg/只。 记录：在术后第1—2个发情期内，注意观察羊群的体况和是否发情，如有发情羊只，随即作好返情记录。 2、妊娠母羊的饲养管理 孕期管理  经两情期以上观察未见发情母羊，即作妊娠羊进行管理，分圈分组，作好记录和标记。保持圈舍清洁、干燥，每日打扫卫生2次。切忌注射防疫疫苗和喂服驱虫药物。注意观察每头孕羊的饮食、健康状况、精神状态等。同时，加强放牧和运动，每天保持运动时间达4小时以上。临产前20天改为圈养或近地放牧，适量活动。特别要防止大群放牧，避免拥挤和打架，防止造成流产或死胎。 饲料喂量  妊娠母羊给料量，要随胎儿的逐渐增大而增加，在临产前35—40天期间，给料量相应增加15%—25%。其中：每天饲喂青贮料1.5kg/只、干草0.5kg/只、鲜草1.5kg/只、精料0.3—0.4kg/只。 临产期管理  临产前1个月注射一次黄体酮保胎，每只用量为2ml。离预产期3—4天时，每日安排人员24小时值班观察，并准备好接产用的药品、物具、圈舍等。 产羔期管理  由于引进大型种羊进行杂交，并进行饲养管理后，胎儿体大。母羊产羔时多辅以人工助产，以防难产和死胎发生。羔羊产出后，迅速用消毒毛巾擦干口、鼻和全身。并对母羊乳房进行清洗消毒，及时给羔羊饲喂初乳，以增强体质和免疫力。无乳或少乳母羊，还采取了人工喂乳等措施，保证了整个羔羊群的正常生长发育。同时，母羊按哺乳期饲养标准进行饲养及管理。 记录记载  及时对应母羊、羔羊作好记录，记载其出生日期、编号、性别、初生体尺体重、15日龄体尺体重、各月龄体尺体重等。建立健全本场山羊系谱和档案库。 六、胚胎移植的妊娠和产羔效果 1、鲜胚移植妊娠及产羔情况：2003年11月12日，公司首次进行胚胎采集和直接移植试验，从一只波尔母山羊双侧子宫角采集到胚胎13枚，经有效胚胎11枚，以手术法移植于10只受体母羊，结果有5只受孕，移植妊娠率为50%。至2004年4月顺产羔羊5只（其中公羔2只、母羔3只），平均初生体重为3.4kg，最大体重为4.5kg，产羔率为100%。羔羊全部存活，目前长势良好，2月龄平均体重17.25kg、体高46cm、胸围40cm、体长47cm、最大体重18kg、最小体重16.5kg。 2、冻胚移植妊娠及产羔情况：2004年1月15日，以内窥镜法作冷冻胚胎移植试验，在58只受体母羊子宫角移植胚胎73枚。经观察测试，有31只母羊受孕，移植妊娠率为53.3%。孕期内流产二胎2只；死胎一胎1只。至6月中旬已全部产羔，共产羔羊33只，产羔率为110.6%（即其中双羔有5胎，双羔率为16.1%）。平均初生体重为2.82kg，最大体重4.2kg、最小体重为1.6kg，目前均长势良好。 3、推广应用情况：在认真总结了上述两次试验的经验，找出了一些改进方法之后，于今年4月10日再次进行鲜胚移植。共对8只（其中外借4只波尔母羊）供体母羊同时作同期发情和超数排卵处理后，采集胚胎113枚，其中有效胚胎98枚。又作同期发情处理受体母羊100只，有75只母羊发情，发情率为75%。在75只受体母羊子宫角内移植鲜胚98枚，有47只妊娠，移植妊娠率为62.66%。与上次鲜胚移植相比，妊娠率提高了12.66个百分点。 目前正在着手进行第四批移植的准备工作。并下半年还将再作2—3批鲜胚和冻胚移植。在总结经验的基础上，寻找突破点，再作一些改进与创新，不断提高供体羊胚胎采集数和受体羊胚胎移植率、移植妊娠率与产羔率。 七、结果与分析 通过上述三批自己采集鲜胚和使用冷冻胚胎在不同季节、采用不同移植方法进行试验研究，取得了一些值得借鉴的经验和体会。 1、 不同产品PMSG对受体山羊胚胎移植率有差异  用国产PMSG注射受体母羊65只，黄体发育合格和胚胎移植率为27.6%，用进口PMSG注射受体母羊75只，黄体发育合格和胚胎移植率为53.3%。具体情况见表1，由表2可以看出，进口PMSG的使用效果明显优于国产PMSG。 表1  国产和进口PMSG对受体山羊黄体发育和胚胎移植率的对比 项 目 国产PMSG 进口PMSG 注射受体羊数（只） 65 75 黄体检查合格数（只） 18 40 胚胎移植数（只） 18 40 胚胎移植率（%） 27.6 53.3       2、不同阴道栓的使用效果比较 本次试验采用阴道栓和海绵栓，两种栓对母羊的发情和黄体发育效果没有差别，但各有优、缺点，见表2。 表2 不同阴道栓的优缺点比较 项 目 阴道栓 海绵栓 优 点 易放易取易洗，可用2次； 易放易观察，不易掉； 缺 点 易脱落，不易观察。 只能用1次，不能洗，不易取，易粘连。       3、不同气温对受体母羊黄体发育有较大影响  天气晴朗，气温在12℃时受体山羊黄体发育合格率71.4%；阴雨时节，气温在5℃左右时受体山羊黄体发育合格率41.7%，说明气候对山羊的发情和黄体发育有影响。见表3。 表3 不同气候条件对受体母羊同期发情效果比较 项 目 气温5℃ 气温12℃ 气温25℃ 天 气 阴雨 晴朗 多云 同期发情羊数（只） 139 14 95 黄体发育合格数（只） 58 10 75 黄体发育无反应数（只） 50 0 6 黄体发育不好数（只） 16 2 6 黄体退化数（只） 8 1 5 出现卵泡数（只） 7 1 3 胚胎移植数（只） 58 10 98 胚胎移植率（%） 41.7% 71.4% 78.9%         4、不同移植方法对移植效果有影响 手术法移植受体羊10只，返情5只，子宫粘连8只。内窥镜法移植胚胎58只，返情12只，内窥镜法移植的返情率低于手术法移植，见表4。 表4 不同移植方法胚胎移植效果比较 项 目 手术法 非手术法（内窥镜法） 黄体检查（只） 14 139 移植母羊（只） 10 58 返情母羊（只） 5 12 返情率（%） 50.0 20.7 子宫粘连(只) 8 0 子宫粘连率（%） 57.1 0       5、不同羊种胚胎移植效果有差异  黑山羊胚胎移植17头，返情2头，返情率11.7%；白山羊胚胎移植44头，返情13头，返情率29.5%；麻山羊胚胎移植7头，返情2头，返情率28.5%。可见，用黑山羊作为胚胎移植受体的效果较好。见表5。 表6  不同品种山羊的胚胎移植效果比较 项 目 黑山羊 白山羊 麻山羊 胚胎移植数（只） 17 44 7 返情数（只） 2 13 2 返情率（%） 11.7 29.5 28.5         八、存在的问题 在山羊胚胎移植工作中，我们严格按照操作规程进行实施，取得了上述一些经验及成果，但由于开展的时间短，因而还存在一些问题和不足。我们将继续努力学习，不断探索，使之尽快形成生产力。存在的问题如下： 1、手术时，我们对麻醉剂的注射时间和使用剂量掌握得还不够准确，使部份手术羊只出现“快醒”或术后“沉睡”的现象，有待探索改进。 2、受体羊移植胚胎后的保胎方法，目前我们多采用埋置阴道栓法，但经过对比观察结果，认为采用注射黄体酮更为合适。 3、供体羊超数排卵处理方法及药物也还有待进一步深入研究，以不断增加其有效胚胎数量。 二00四年六月二十六日