应用微卫星对大足黑山羊进行亲缘关系鉴定

应用微卫星对大足黑山羊进行亲缘关系鉴定 应用微卫星对大足黑山羊进行亲缘关系鉴 定 第29卷第7期 VO.29NO.7 西南大学(自然科学版) JournalofSouthwestUniversity(NaturalScienceEdition) 2007年7月 Ju1.2007 文章编号:1673—9868(2007)07—0121—05 应用微卫星对大足黑山羊进行亲缘关系鉴定 宋艳画,宋善道,孙燕,王鲜忠,张家骅 1.重庆市牧草与草食家畜重点实验室,重庆400716;2.西昌学院动物科学系,615013 摘要:为了确定大足黑山羊的亲缘关系,本试验选用24个微卫星位点对133只完全没有血缘记录的大足黑山羊基 因组DNA进行扩增,扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,银染显色后获得个体的基因型,用亲缘软件 Cervus2.0进行个体关系分析,最终将子代个体以父权分为了l1个群体,并对l1只种公羊进行聚类分析,得出整 个群体的亲缘关系,本实验结果对大足黑山羊的亲缘关系进行了初步分析,可为该群体的选育选配提供了参考. 关键词:微卫星;大足黑山羊;亲缘分析 中圈分类号:$813文献标识码:A 大足黑山羊是近年在重庆市大足县境内发现的 一 个具有优良遗传特性的山羊群体.该群体中的个 体毛色纯黑,体型较大,生长发育快,产肉性能好, 尤其是其产仔率高,每只母羊平均每年繁殖率在 350,4OO.据普查结果显示,铁山黑山羊每胎 产羔率初产羊为212,经产羊为289.胎产三羔 以上个体大约占4O,5O左右,其中,产4羔以 上者约有1O,产5羔,6羔的个体也占一定比例. 当地农户在长期的自然饲养过程中已经实行了公母 分开饲养,公羊主要由少数的农户分散喂养.目前 正在对该山羊群体进行品种选育,但购入的这些羊 只个体间的谱系不清,不利于选育工作的进行. 对核心群的山羊进行亲缘关系分析,不仅可以 为建立合理的选配提供参考,而且能防止近亲 繁殖引起的品种退化,加快品种选育进程.与传统 的亲缘鉴定如血型,血清蛋白及同功酶多态性 鉴定相比,微卫星DNA多态性更高,可提供更高 的多态信息含量,且在基因组分布广泛,呈共显性 遗传.微卫星技术由于对检验材料要求不高, 而检测方法相对简单,可用一般的PCR和电泳进 行分型等,一般实验室即可完成鉴定工作,但准确 率较高,因此该方法已Et益被广泛地应用于个体识 别和亲缘分析J.本试验验在详细分析山羊的微 卫星序列后,选用了24个微卫星位点对133只完 收稿日期: 基金项目: 作者简介: 全没有血缘记录的大足黑山羊基因组DNA进行了 扩增,对它们的亲缘关系进行了分析. 1材料和方法 1.1材料 所用材料为黑山羊血液样品,共采集133只黑 山羊保种选育场黑山羊的血液样品,其中104只为 青年黑山羊,l1只为当地常年配种的种公羊,另18 只为青年黑山羊的母亲. 1.2方法 1.2.1基因组DNA的获取 颈静脉采取黑山羊血液,加入抗凝剂,低温冰盒 带回实验室,全血经离心清洗等用蛋白酶K消化过 夜后,采用苯酚一氯仿法(Sambrook,1989)叫提取基 因组DNA,提取后进行DNA纯度和浓度的检测. 1.2.2微卫星位点的选择和PCR扩增条件优化 根据Barker(1994)微卫星选择,同时综合 考虑引物序列组成特点,产物片断大小等多方面因 素,在Www.marc.usda.gov和 ra.fr等网站,以及一些已发表文献中选择了35个 微卫星位点合成引物.引物合成后对PCR反应条 件进行优化,以选择出能扩增出产生大量的特异性 产物的微卫星位点及其最优条件. 2007一O5—14 重庆市自然基金重点项目"大足黑山羊多分子标记及其在辅助中的运用研究";重 庆市教委项目"大足黑山羊系谱与进化地位 的研究". 宋艳画(1981一),女,河南许昌人,硕士,助教,主要从事家畜遗传学方向研究. 122西南大学(自然科学版)第29卷 1.2.3优化后的PCR扩增条件 对PCR条件优化选择后,本实验采用2OuL 反应体系,其中各组分的终浓度分别为dNTPs 0.2mM,Mg1.0,2.0mM,taq酶0.8u/体系 (0.04U/uL),上下游引物0.4pmol//xl,DNA模 板2.5ng/uL.PCR反应程序为:94?预变性5rain, 94?变性1rain,54?,65?退火1rain,72.C延伸 1rain,经35个循环后于72?延伸5rain. 1.2.4聚丙烯酰氨凝胶电泳和银染 硝酸银染色法灵敏度高且毒害小,操作也较简 便等优点,,因此本试验采用银染法染色u.PCR 产物用8非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳进行分离, TBE,DNAMarker为pBR322 电泳缓冲液为l× DNA/MspIMarkers,用硝酸银进行染色/显色后, 将凝胶进行扫描,保存图像. 1.2.5微卫星基因型的判定 以分子量标记物pBR322DNA/MspIMarkers 为标准,利用BandScan凝胶分析软件读取获得的 电泳图像中各个泳道中PCR扩增产物片断大小并 记录数据.由于微卫星呈共显性遗传,表型直接反 映基因型,根据电泳得到的数据结果可以直接判断 出每个个体的基因型.? 1.2.6个体间亲缘关系的判定 CERVUS2.0是由Marshall等编写的专门的 亲权鉴定软件",本试验中的结果采用CER— VUS2.0进行亲缘关系分析,最后用统计分析软件 DPS3.01数据处理系统对11只种公羊的基因型进 行聚类分析,得到种公羊间关系的聚类图. 2结果 2.1DNA提取及纯度鉴定 从血液中提取的基因DNA的完整性对于后面 的分析是十分必要的,从图1可以看出,本实验中 提取的DNA完整性较好,其质量可满足本实验微 卫星位点扩增的要求. 图1黑山羊基因组DNA琼脂椐检测结果 2.2微卫星位点筛选及PCR扩增条件优化结果 用合成的微卫星位点引物进行扩增后,选择多 态性高(至少有4个等位基因),扩增效果好,扩增 产物片断差别大的引物,最后确定了分别分布于23 条染色体上的24个微卫星位点的引物用于亲缘关 系分析研究.这些微卫星位点资料见表1. 表1微卫星位点相关信息 第7期宋艳画,等:应用微卫星对大足黑山羊进行亲缘关系鉴定123 ILSTS028 OARFCB304 BM4208 BMS1248 INRAO81 0ARFCB48 MAFO65 SRCRSP1O BM3413 BM0143 MAFO70 BM1818 BM1329 ILSTSO05 INRAO63 F:TCCAGATTTTGTACCAGACC 114 R:GTCATGTCATACCTTTGAGC F:CCCTAGGAGCTTTCAATAAAGAATCGG 191O R:CGCTGCTGTCAACTGGGTCAGGG F:TCAGTACACTGGCCACCATG 99 R:CACTGCATGCTTTTCCAAAC F:GTAATGTAGCCTTTTGTGCCG 514 R:TCACCAACATGAGATAGTGTGC F:CGGCTCACGGTCTCTATCGG 267 R:GCGAACCCAAGAATCAGACTC F:GAGTTAGTACAAGGArGACAAGAGGCAC 17ll R:GACTCTAGAGGATCGCAAAGAACCAG F:AAAGGCCAGAGTATGCAATTAGGAG 159 R:CCACTCCTCCTGAGAATATAACATG F:ACCAGTTTGAGTATCTTGCTTGGG 89 R:AGGAAGTTTATTGGACAGTGCTGG F:TCCCTGGTAACCAATGAATTC 21R:cAATGGATTTGAcccTccc1O F:ACCTGGGAAGCCTCCATATC R:CTGCAGGCAGATTCTTTATCG91 F:CACGGAGTCACAAAGAGTCAGACC 48 R:GCAGGACTCTACGGGGCCTTTGC F:AGCTGGGAATATAACCAAAGG 238 R:AGTGCTTTCAAGGTCCATGC F:TTGTTTAGGCAAGTCCAAAGTC 68 R:AACACCGCAGCTTCATCC F:GGAAGCAATGAAATCTATAGCC 1O11 R:TGTTCTGTGAGTTTGTAAGC F:ATTTGCACAAGCTAAATCTAACC 18?6 R:AAACCACAGAAATGCTTGGAAG 148——18O 137—195 163—211 131167 162214 158—196 123—161 265319 187—225 1OO一140 126—186 239—309 14O一216 16—219 17—223 2.3PCR扩增结果 从图2可以看出,本试验所选用的微卫星位 点,在PCR扩增后,?其产物用非变性聚丙烯酰胺凝 基 胶电泳分离,硝酸银染色后,能清楚将不同的谱带 区分开来,图2为位点CSSM31在部份山羊中的扩 增结果. 图2CSSM31位点电泳扩增图谱 2.4微卫星位点基因分型分析 本实验中共24个微卫星位点,其位点的平均 等位基因数是9.87个(4,14),微卫星位点的多态 性都达到了进行亲缘分析所需的要求,等位基因最 多的是BP28和BMS1248两个位点,都为14个, 具体结果见表1. . 124西南大学(自然科学版)第29卷 2.5不同羊亲缘关系分析 由基因型数据库用CERVUS2.0算出各位点 的等位基因频率以及多态信息含量排除概率等参 数,再运行simulation10000次,算出不同置信水 平(95和80)的Delta值标准等,最后用软件判 定亲子关系,根据可疑父亲的基因型计算其LOD 值,按照LOD评分高低判定亲子关系,最后以父 权为依据将子代山羊分成11个群体,见表2. 表2按父权分群结果 父亲标号子代编号 61+,4+,64+,9O+,66+,6*,52*, O5o051 82(母亲已知)55+,81,292,2O0+,212 +,214+,282+,324+,184一,220一, 238一,8+,94+,84(母亲已知) 71*,11+,634-,79一,234一,244一, 124+,14O+,158+,194+,2364-,302 +,3164-,268*,294*,298*,31O*, 312*,62,138,172,270,304 4+,56+,884-(母亲已知)1304-,208 +.2964- 2+,58(母亲已知)77一,272一,196+, 2804-,216 7O4-(母亲已知)67*,162*,2844-,328 一 ,146,232,318,326 128,246,278,118一,152一,156+,166+ 1*,72+,744-(母亲已知)75一,286一, 142,19O,25O,288 l484-,274+.16O一,306— 78+,8O*(母亲已知)l92*,3204-,l32, 290 6O+,764-(母亲已知)5*,65一,266*, 276*,l54+,l64+,262+ 表中子代编号上标代表该亲权关系鉴定置信度 水平,"*"为95,"+"为809/6,"一"为低于 80,没有上标的代表Delta值未定义.(Delta是 最可能父亲(mostlikelycandidateparent)和其次可 能父亲(secondmostlikelycandidateparent)的 LOD值的差值,Delta是检测将亲权关系归于最可 能父亲的可信度的一个统计量.Delta值未定义即 最可能父亲未能确定). 2.6公羊之间的亲缘关系 由于所分析的这些个体之间的亲缘关系没有任 何记录,只有极少一些养殖户口述配种公羊的大概 情况,所以进行分析可参考的依据很少,通过亲缘 关系的分析,将买进的子代山羊按父权分为了11 个群体,并对11个种公羊进行了聚类分析,得出该 群体中个体间总的亲缘关系,可为育种过程提供一 定参考依据. DT000l DT0009 DTOOll DTOOl7 DJ00l8 DZ0003 DJ000l DJ0025 5005l DZ000l DTOOl5 O,OO17.8135,6153,4271,2389,O3 图311只种公羊间的聚类图 3讨论 微卫星技术在亲缘鉴定方面的应用越来越多, 其父权鉴定的结果主要受到母亲样本数和置信水平 设置两方面的影响.母一子关系清楚的情况下,父 权鉴定的排除概率和置信度都比较高,而在在本实 验中缺乏母亲资料的情况下,鉴定结果的置信水平 有较多低于80.在集体统一管理的圈养条件下所 有潜在父亲样本都是可以获得的,然而对于本实验 而言,黑山羊个体是从分散农户养殖的羊只中选择 集中的,农户没有系谱记录,甚至无法说清配种的 公羊,有的连母子关系也难确定.被检的可能父亲 的样本数同样影响到实验结果的准确性,Cervus软 件的Simulation程序考虑了被检父本概率这一情 况,本实验中由于种公羊由农户分散饲养,又有买 卖及死亡等原因的影响,根据采样情况及调查结果 我们把分析过程中父亲样本的获得概率设定为 65,以降低实验误差.亲缘软件Cervus2.0的优 点就在于考虑到在进行亲缘分析可能碰到的各种问 ,例如对母子关系已知和未知的情况就采用了不 同的计算方法,对于可疑父亲样本不能完全获得的 情况设计了不同的计算方法,这些都可以使分析结 果更准确.但是真正要提高亲缘分析的准备性,关 键还是要尽可能多的收集到疑似父亲的样本及确定 母子关系的母亲的样本和相关的交配记录,所采得 的样本材料及相关记录越全面,鉴定结果的可信度 就越高. 微卫星位点选择个数也会影响到实验结果统计 最终的准确度.吴继法等分别用9个,10个,17个 位点为一组对同一群实验对象进行分析,结果证实 叭??叭叭叭?啪一一一一一一一一一 第7期宋艳画,等:应用微卫星对大足黑山羊进行亲缘关系鉴定125 随着采用的微卫星位点数的增多,所得到的排除概 率会越来越高.,实验最初合成35对引物,经多次预 实验优化选择等最终选取了24个提供多态性信息 较多的微卫星位点,在一定程度上可提高分析的准 确性.根据分群结果来看,属于铁山镇公羊后代的 平均个数最多,尤以050051和DT0015的后代为 最多,这两只公羊都是铁山镇西北村农户所养大公 羊,这与购买子代小羊时农户提供亲缘相吻合,同 时具有同胞关系的4号和6号,54号和56号及78 号和8O号其鉴定结果也与记录相同.本实验最终 将原来完全没有任何可参考血缘记录的山羊群体根 据父权分成了11个群体,并对11只种公羊的亲缘 关系进行了聚类分析,为群体选配选育及在品种选 育工作中建立合理的配种制度提供参考. 参考文献: [1]GuoWei,ShenZuo—rui.PolymorphismofMacrosatel [2] [3] [4] liteDNAanditsApplicationl-J].Lettersinbiotech— nology,2004,15(2):158—159. 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ParentageAnalysisofDazuBlackGoatsViaMicrosatelliteTechnology SONGYan—hua一,SONGShan—dao,SUNYan, WANGXian—zhong,ZHANGJia—hua 7.ChongqingKeyLaboratoryofForage&Herbivore,Chongqing400716,China; 2.DepartmentofAnimalScience,XichangCollege,XichangSichuan615013,China Abstract:Twenty-fourmicrosatellite1ociwereusedinPCRamplificationoftheDNAof133Dazublack goatsthathavenoparentagerecord,andindividualgenotypeswereobtainedaftertheproductsofPCRam— plificationweredetectedbynon— denaturalizedpolyacrylamidegelelectrophoressanddyedbysilvernitrate. Theoffspringwereassignedto11groupsaccordingtopaternityanalyzedbyusingCervus2.0,andcluster analysiswasdoneamongthe11malestudgoats.Atlast,thekinshipofthewholegroupwasobtained, whichcanofferreferencetothebreedingofthegroup. Keywords:microsatelliteDNA;Blackgoat;parentageanalysis 责任编辑汤振金