[doc] 石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用

[doc] 石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用 石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用 ?24? 工业卫生与职业病 IndHhh&OeeupDis 2008年第34卷第1期 2008,Vo1.34,No.1 石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用 杨跃新,田海林, (1.苏州市疾病预防控制中心,江苏苏州215004; 【专题研究】 时锡金,孙难民,王强 2.苏州大学放射医学与公共卫生学院,江苏苏州215123) 【摘要】目的研究石杉碱甲抑制乙酰胆碱酯酶活性的基本特点,为将石杉碱甲用于预防有机磷神经毒 剂中毒提供依据.方法以浓度为0,0.2,0.5,0.7,1.0,1.5,2.0,3.0,5.0,10,0mg/kg的石杉碱 甲给大鼠灌胃染毒,求得石杉碱甲对大鼠全血,前皮质,小脑,海马乙酰胆碱酯酶活性抑制的剂量一效应 曲线;以2mg/kg的石杉碱甲给大鼠灌胃,分别于染毒后0.5,1,2,4,8,12,24h测定乙酰胆碱酯酶活 力,求得乙酰胆碱酯酶抑制的时间一效应曲线.结果染毒30rain后乙 酰胆碱酯酶活性抑制达到高峰, 24h后全血及脑组织乙酰胆碱酯酶活力基本恢复正常;0.5, 3.0mg/kg石杉碱甲染毒后可获得较合适的预 防有机磷神经毒剂中毒的乙酰胆碱酯酶抑制率.绪论石杉碱甲为可 逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂,可以通过 血脑屏障,可能对有机磷类神经毒剂中毒具有预防作用. 【关键词】石杉碱甲;神经毒剂;乙酰胆碱酯酶 [中图分类号]R?4[文献标识码]A[文章编 号]1000—7164(2008)01—0024—04 InhibitionofHuperzineAonActivityofAcetylcholineEsterase YANGYue—xin,TIANHai—lin,SHIXi—jin,SUNNan—min,WANGQia ng (SuzhouCenterforDiseasePrevention&Control,Suzhou215004China) [Abstract]ObjectiveTostudythebasicinhibitionfeatureofhuperzineAontheactivityofaeetyleholine esteraseandprovidecriteriaforhuperzineAinpreventingorganophosphorousnerveintoxicantpoisoning. MethodsThedosesof0.2,0.5,0.7.1.0.1.5,2.0,3.0,5.0and10.0mg/kgofhuperzineAwere usedtOstudythedose—effectrelationshipofinhibitiononaeetyleholineeste raseactivityofwholeblood,frontal cortex,cerebellum,hippocampusinrats.2.0mg/kghuperzineAwasusedtOstudythetime-effect relationshipofinhibitiononrataeetyleholineesteraseactivityafter0.5,1,2,4,8,12and24hours exposure.ResultsTheinhibitionofacetylcholineesteraseactivityreachedthepeakafter0.5hourand retrievedtOnorma1after24hours.Theinhibitiononacetylcholineesteraseactivityobtainedbythedosesof 0.5--3.0mg/kgofhuperzineAwastheappropriateinhibitionratioforpreventingorganophosphorousnerve intoxicantpoisoning.ConclusionsHuperzineAisareversibleacetylcholineesteraseinhibitor,whichcould breakthroughthebloodbrainbarrier,andmightbeeffectiveinpreventingorganophosphorousnerve intoxicantpoisoning. [Keywords]HuperzineA;Nerveintoxicant;Acetylcholineesterase 有机磷类神经性毒剂是不可逆的乙酰胆碱酯酶 抑制剂,毒性高,不易觉察,即是恐怖活动和化学 战中最可能使用的毒剂,更是国内外防化医学研究 的重点,但目前国际上并无理想的预防用药.石杉 碱甲(huperzineA)是从中草药蛇足石杉中分离得 到的天然产物,其化学名为(5R,9R,11E)一5 一 氨基,11一亚乙基一5,6,9,10一四氢一7一甲 基一5,9一亚甲基环辛四烯并(b)吡啶一2(1H) [基金项目]江苏省高校自然科学研究基金(SZ126510),苏州大学医 学发展基金(EEl26512). I作者筇介]杨跃新(1972一),男,硕士研究生,主管医师.[通讯作者]田 海林 . 副教授,硕士生导师. 酮l1,是一种乙酰胆碱酯酶(ACHE)的可逆性抑制 剂,可能对神经性毒剂引起的中毒具有较好的预防 作用.关于石杉碱甲毒性的研究资料很少,且对乙 酰胆碱酯酶活性抑制的特点不太明了本研究旨在 针对石杉碱甲抑制乙酰胆碱酯酶活性的基本特点, 为研究石杉碱甲预防有机磷神经毒剂中毒提供基础 资料及为寻找最佳预防剂量提供依据. 1材料与方法 1.1动物 成年雄性SD大鼠,体重(204.7?19.8)g,苏 跃新,等.石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用 州大学实验动物中心提供.动物饲养于具有温度控 制的房间内,室温(23?1).C,12hN明(7:()(], 19:00)与12h黑暗(19:()(],7:00)交替进行,全 价营养饲料喂养,自由饮水与取食.实验前饲养1 周以适应环境. 1.2主要试剂及仪器 石杉碱甲,浙江万邦药业公司产品,批号 050503,纯度99.4;碘化硫代乙酶胆碱 (ASCh),5,5一联硫代一双一2一硝基苯甲酸 (DTNB),柳酸毒扁豆碱,还原型谷胱甘肽购自 Sigma公司;其它试剂为国产纯;双缩脲试剂 为南京建成生物公司产品.仪器:723型可见分光 光度计(上海菁华仪器有限公司),电热恒温水浴 箱,低温冰箱,IKAT10Basic匀浆机,高速离心 机,十万分之一分析天平(日本岛津公司). 1.3方法 1.3.1动物分组及处理将60只大鼠随机分成 10组,每组6只,染毒组每组分别以0.2,0.5, 0.7,1.0,1.5,2.0,3.0,5.0,10.0mg/kg剂 量(石杉碱甲溶于生理盐水中)给大鼠灌胃,灌胃量 为5ml/kg.对照组灌以等量的生理盐水.灌胃后 1h断头处死,收集全血于加入肝素的1.5ml离心 管中,反复倒转充分混匀;取出大鼠脑,分离前皮 质,小脑,海马,以上操作均在冰浴中进行].所 有脑组织均保存于一20?冷冻冰箱内待用;另将 48只大鼠随机分为8组,每组6只,选择合适的 石杉碱甲剂量(2mg/kg)给处理组灌胃染毒,对照 组灌以等量的生理盐水.分别于染毒后0.5,1.0, 2.0,4.0,8.0,12.0,24.0h断头取血,脑组织. 1.3.2测定指标(1)全血乙酰胆碱酯酶活力的测 定:用硫代乙酰胆碱一联硫代双硝基苯甲酸(ASCh — DTNB)法测定全血乙酰胆碱酯酶活力,以每毫 升血样在37C温浴6min,水解1微克分子基质为 1个活力单位.求得不同剂量的石杉碱甲对全血乙 酰胆碱酯酶的抑制率,绘制剂量一效应曲线.求得 不同时间点石杉碱甲对全血乙酰胆碱酯酶的抑制 率,绘制时间一效应曲线.(2)脑组织乙酰胆碱酯 酶活力的测定:准确称取脑组织,按1:9的重量 比例加生理盐水,20500r/min匀浆30S,以上操 作均在0C进行.取12l匀浆液,ASCh—DTNB法 测定乙酰胆碱酯酶的活性.匀浆液2000r/rain离心 10rain取上清液,双缩脲法测蛋白.酶的活力单位 为每毫克蛋白在37?温浴6rain,水解1微克分子 基质为1个活力单位,求得不同剂量,不同时间的 石杉碱甲对前皮质,小脑,海马乙酰胆碱酯酶活力 抑制的剂量一效应曲线和时问一效应曲线. 1.3.3不自主运动(IM)及流涎,流泪,排尿,排 便(SIUD)评分依据Moser等的胆碱能中毒的功 能指标评分方法评分].IM评分:2一正常,3一 轻微震颤,4一全身震颤,5一肌痉挛反射,6一阵 挛性惊厥;SIUD评分:1一正常,2一轻微,3一 中度,4一重度.剂量一效应分析于染毒后1h处死 前对IM及SIUD等胆碱能中毒症状评分并记录. 时问一效应分析分别于染毒后0.5,1.0,2.0, 4.0,8.0,12.0,24.0h对IM及sIUD等胆碱能 中毒症状评分并记录. 1.4统计学处理 数据录入Excel工作表中,用SPSS13.0统计 软件分析.IM及SIUD以中位数?四分位问距表 示l4j,乙酰胆碱酯酶含量以?s表示.处理组与对 照组的结果比较用单因素方差分析,两两比较用 Dunnett—t检验. 2结果 2.1石杉碱甲抑制乙酰胆碱酯酶活性的剂量,效 应关系 由图1可见,1.5,2.0,3.0mg/kg~1]量对大 鼠全血乙酰胆碱酯酶的抑制率在20左右,分别 为17.38,18.57,22.75. 一 一 静 葬 晕 酱 酱 蟮 g Ol234567891Olll2 石杉碱甲(mg/kg) 图1石杉碱甲抑制大鼠全血 乙酰胆碱酯酶活性的剂量一效应曲线 石杉碱甲可以穿透血脑屏障,对脑内前皮质, 小脑,海马的乙酰胆碱酯酶活性均有不同程度的抑 制,其中对前皮质的抑制作用强于小脑及海马. 1.0,1.5,2.0,3.0mg/kg石杉碱甲对乙酰胆碱 酯酶的抑制率达到20以上,结果如图2所示. ???加m0 ? 26? 50 —45 40 褂35 柱l0 N5 0 024681012 石杉碱甲(mg/kg) 图2石杉碱甲抑制大鼠脑内 乙酰胆碱酯酶活性的剂量一效应曲线 前皮质 小脑 海马 2.2石杉碱甲抑制乙酰胆碱酯酶活性的时间一效 应关系 石杉碱甲口服后吸收迅速,0.5h后即可达到 抑制全血乙酰胆碱酯酶活性的最高峰(18.13), 0.5h组与1h组相比无统计学意义(P>0.05); 0.5h组及1h组与对照组相比有统计学意义 (P<0.05).2h后酶的抑制开始下降,但仍可以 维持8h左右,24h后酶的活力基本恢复 (P>0.05),结果见图3. o2468l0l2l4l6l820222426 染毒后时『日J(h) 图3石杉碱甲抑制大鼠全血 乙酰胆碱酯酶活性的时间一效应曲线 石杉碱甲在短时间内即可对大鼠脑组织的乙酰 胆碱酯酶活性产生抑制,对前皮质,小脑和海马的 抑制在0.5,1h即可达到最高峰,小脑与海马酶的 活力恢复得较快,2h后即开始有不同程度的恢复, 8h后基本恢复正常(P>0.05).对前皮质乙酰胆碱 酯酶活性抑制时间较长,可以维持8h以上,24h后 酶的活力基本恢复正常(P>0.05),结果见图4. 2.3石杉碱甲对乙酰胆碱能中毒症状的影响 低剂量的石杉碱甲对大鼠的SIUD症状(流 涎,流泪,排尿,排便)无明显影响,仅在l0mg/kg 组有轻微症状,SIUD评分为2?0.00,与对照组 比较有统计学意义(P<0.05).自1.5mg/kg开始 可见对IM症状(不自主运动)有影响,症状出现较 工业卫生与职业病2008年第34卷第l期 024681o1214161820222426 染毒后时间(h) 图4石杉碱甲抑制大鼠脑组织 乙酰胆碱酯酶活性的时间一效应曲线 快,平均10min左右即有胆碱能中毒症状的出现. 1.5,2.0mg/kg组出现轻微震颤,IM评分为3? 0.00;10mg/kg组症状最明显,出现肌痉挛反射 (IM评分为5?0.75),与对照组比较有统计学意 义(P<O.05),结果见图5. 00_20.50.7l1.5235lo 石杉碱甲(mg/kg) 注:与对照组比较,*P<0.05. 图5不同剂量石杉碱甲致大鼠胆碱能中毒评分 2mg/kg剂量的石杉碱甲在染毒后各时间点对 大鼠的SIUD症状均无影响(P>0.05);对不自主 运动有影响,0.5,1,2h3个时间点IM评分分 别为3?0.75,3?0.75,3?0.00,与对照组比较 有统计学意义(P<0.05).2h后胆碱能中毒症状 消失,此时大鼠全血胆碱酯酶活力也基本恢复,结 果见图6. oo.5l248l224 石杉碱甲(mg/kg) 注:与对照组比较,*P<0.05. 图6石杉碱甲染毒后不同时间大鼠胆碱能中毒评分 如加m0 一一器嚣避酱掣蔷 65432?0 mm50 一一斛磊嚣避赶髻挂 65432?0 避 杨跃新,等.石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用 3讨论 目前美国,法国的军队将溴化吡啶斯的明作为 神经毒剂的预防剂,有机磷神经毒剂中毒后以硫酸 阿托品,甲磺酸磷定,阿维扎封(催眠镇静药)等3 种药物组成的混合药物立即救治.溴化吡啶斯的明 是一种可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂,与乙酰胆碱酯 酶结合后短时间内即可解离,从而使乙酰胆碱酯酶 恢复活性l5].但是研究结果证明,若提前使用溴化 吡啶斯的明作为预防,在有机磷神经毒剂中毒后, 硫酸阿托品等3种混合药物救治尚不能控制神经毒 剂引起的中枢神经系统中毒症状癫痫的持续发 展l6],溴化吡啶斯的明通常情况下并不能穿过血脑 屏障,对神经毒剂引起的中枢毒性无预防作用.有 学者认为”海湾战争综合征”可能和战争期间服用 溴化吡啶斯的明有关],因此,溴化吡啶斯的明并 不是很理想的预防用药. 石杉碱甲是一种新型石松类生物碱有效单体, 1994年成功开发应用于治疗阿尔采末病(AD),商 品名为”哈伯因”.石杉碱甲的化学结构独特,对 脑内乙酰胆碱酯酶具有极高选择性抑制,可持续提 高脑内乙酰胆碱水平达6h,优于加兰他敏,安理 申或他克林l8一.石杉碱甲易透过血脑屏障,口服生 物利用度好,能选择性抑制脑内乙酰胆碱酯酶,且 持续作用时间更长. 本次实验结果表明,石杉碱甲口服吸收迅速, 0.5h即可达到对全血乙酰胆碱酯酶的最大抑制; 对外周胆碱能神经副作用很弱,仅在最高剂量组 (10mg/kg)时才有较明显的SIUD症状,低剂量 时无明显影响.乙酰胆碱酯酶抑制剂要达到有效的 预防神经毒剂中毒的剂量必须是对人的乙酰胆碱酯 酶的抑制达到2O左右,因此本次实验采用 2mg/kg的剂量研究石杉碱甲抑制乙酰胆碱酯酶活 性的时间一效应关系,该剂量对乙酰胆碱酯酶活性 的抑制可达18.57%,效果可以维持8h左右,24h 以后酶的活力才基本恢复,药效较长. 结果显示,石杉碱甲可以透过血脑屏障,对脑 内前皮质,海马,小脑的乙酰胆碱酯酶活性均具有 良好的抑制作用.1.0mg/kg的剂量对大鼠前皮质 乙酰胆碱酯酶抑制率即可达到20以上,随着剂 量的增加,抑制率不断提高.低剂量石杉碱甲对3 个脑区乙酰胆碱酯酶的抑制相似,对海马乙酰胆碱 缝夔戢终铡事珞低.>2.0rag/k殳剂量时,对前皮 质的乙酰胆碱酯酶的抑制作用强于海马和小脑. Iomg/kg石杉碱甲对脑组织乙酰胆碱酯酶的最大 挪制率可达43.74.此时,动物出现流涎,流 泪,排尿,排便等症状(SIUD评分为2?0.00); 骨骼肌症状明显,出现肌痉挛反射(IM评分为4.5 ?1.00).由于该剂量对脑组织乙酰胆碱酯酶的抑 制没有超过5O,受试动物未出现阵挛性惊厥. 2mg/kg石杉碱甲染毒的时间一效应曲线表明,染 毒后0.5h,脑内乙酰胆碱酯酶的活性即受到较明 显的抑制,1h达到抑制最高峰,维持时间可达6 , 8h,24h后对前皮质乙酰胆碱酯酶仍有一定程 度的抑制(13.49),此时对海马和小脑乙酰胆碱 酯酶的抑制基本消失. 由于石杉碱甲可以透过血脑屏障,与酶预先结 合,保护酶不与神经毒剂结合,且作用时间较长, 可能对有机磷类神经毒剂中毒有较好的预防作用. 参考文献: [1]王斌,何煦昌,白东鲁.老年痴呆症药物石杉碱甲类 似物研究V.光学活性(一)一1一甲基石杉碱甲的合 成[J].药学,1999,34(6):434—438. [elKantGJ,BaumanRA,FeasterSR,etal,The combinedeffectsofpyridostigmineandchronicstress onbraincorticalandbloodacetykhohnesterase, corticosterone,prolactinandalternationperformance inrats[J.PharmacolBiochemBehav,2001,70: 209—218. E33MoserVC,McCormicJp,CreasonJp,eta1. Comparisonofchlordimeformandcarbarylusinga functionalobservationalbattery[J].FundAppl Toxicol,1988,l1:189—206. 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