肾移植患者冠状动脉钙化趋势和相关因素探讨（可编辑）

肾移植患者冠状动脉钙化趋势和相关因素探讨（可编辑） 肾移植患者冠状动脉钙化趋势和相关因素探讨 暨南大学硕士学位论文 摘 要 目的:探讨肾移植患者冠状动脉钙化CAC的相关因素及发展趋势。 方法:对46例肾移植患者行冠状动脉多层螺旋CT(MSCT)扫描,计算CAC积分,分为 CAC组和无CAC组,同时采集患者临床信息并检测血清胎球蛋白AFetuin A、血肌酐、血 脂、超敏C反应蛋白HsCRP 等实验室指标。两组的生化指标均数间的比较应用两样本 t 检验。CAC的影响因素采用非条件logistic回归。随访12个月后再次行上述检测。对12 个月前后的生化指标均数间的比较行配对 t 检验,对12个月前后CAC积分均数间的比较行 配对资料的符号秩和检验,分析CAC的发展趋势及影响因素。 结果:CAC 组(15 例,32.61%)与无 CAC 组(31 例,67.39%)在年龄、透析时间、 HsCRP、Fetuin A、低密度脂蛋白(LDL)、血钙等方面存在显著性差异(P均0.05) 。血 清 Fetuin A 的水平在 CAC 组为(0.27?0.04)g/L,明显低于无 CAC 组 [0.34?0.07)g/L, P0.05]。非条件 logistic 回归分析显示:年龄OR1.20, P0.02和 LDL OR4.26, P0.01 是 CAC的独立危险因素。CAC 积分与 Fetuin A水平呈负相关(r -0.48,P0.05) ,与年 龄(r0.51, P 0.05)、透析时间(r0.35, P 0.05)、 LDL(r0.66, P 0.05)、血钙(r0.38, P 0.05)、 HsCRP(r0.48, P 0.05)呈正相关。 Fetuin A水平与 HsCRP(r-0.57, P 0.05)、 年龄(r-0.30,P 0.05)呈负相关,与血钙、血磷、钙磷乘积、甲状旁腺素PHT、高密 度脂蛋白HDL、胆固醇CHOL、甘油三酯TG、LDL无明显相关性(P均>0.05)。 随访 12个月后有 39例肾移植患者[CAC组(14例,35.90%),无 CAC组(25例, 64.10%)]接受再次检测,HsCRP、TG 水平较 12 个月前显著上升(P ?0.05),HDL 水 平较 12 个月前显著下降(P?0.05)。CAC 积分较 12 个月前显著升高,CAC 积分由原来 的 21.59?54.64 上升至 37.15?71.43(Z3.622,P?0.05)。CAC 积分的年平均变化率为 15.56?46.42。经随访 12 个月后,CAC 组患者绝大部分 CAC 积分增加了,其 CAC 积分 为 98.90?91.87。无 CAC组患者有 20 例(80.00%)患者仍然没有发生 CAC,有 5例患者 (20.00%)发生了 CAC,其 CAC积分为 12.88?7.80。 结论:肾移植患者 CAC积分与年龄、透析时间、HsCRP、LDL、血钙等因素呈正相关, 与 Fetuin A水平呈负相关。年龄和 LDL是 CAC的独立危险因素。血清 Fetuin A水平与 HsCRP、年龄呈负相关。CAC的发生是多种因素综合作用的结果。肾移植患者的 CAC发 展趋势是总体上升的。感染、HDL 的降低和 TG 的升高可能是加速肾移植患者血管钙化 I暨南大学硕士学位论文 的重要因素之一。控制感染、调控血脂、缩短移植前透析时间可能延缓钙化进展。合成内 源性的钙化抑制物 Fetuin A 可能将作为患者血管钙化的治疗提供新的途径和方法。 关键词:肾移植;心血管疾病;冠状动脉;钙化;危险因素;胎球蛋白A;高脂血症 II暨南大学硕士学位论文 Abstract Objective: To investigate the factors correlated to coronary artery calcificationCAC and analyze the trends in CAC in renal transplant recipientsMethods: The CAC score was evaluated by multislice spiral computed tomography MSCT in 46 renal transplant recipients who divided into two groups(with CAC group and without CAC group). Other clinical datas of these patients were obtained simultaneously, included blood pressure, pretransplantation dialysis duration, transplantation duration, calcium, creatinine, low density lipoproteinLDL , serum fetuin A, high-sensitivity C-reactive protein HsCRP , et alData between patients with and without CAC were compared by using unpaired t-test. To identify independent factors for CAC, multivariable logistic regression analysis was performedAnd a repeat evaluation 12 months later. Continuous data between baseline and 12 months were compared by means of Wilcoxon sign-rank test for nonparametric paired data or paired t-test The study showed that patients with CAC15persons, 32.61% had significantly Results: higher age, pretransplantation dialysis duration, serum calcium level, LDL, HsCRP, albumin, ( ) and lower serum fetuinA level than patients without CAC 31persons, 67.39% P 0.05. The level of serum fetuinA was (0.27?0.04) g/L in patients with CAC, significantly lower than that ) P in patients without CAC [0.34?0.07 g/L, 0.05]. Multivariable Logistic regression analysis showed that serum LDL and Age were independent factors of CACP 0.05. Serum fetuin A , age, pretransplantation dialysis duration, LDL, HsCRP in these 46 patients were related with CAC scorer and P values were r-0.48 P 0.05; r0.51 P 0.05; r0.35 P 0.05and r0.66 P 0.05, respectively.And age, HsCRP were related with serum fetuin Ar-0.30 P 0.05 and r-0.57 P 0.05, respectively. There was no correlation of fetuin A with some laboratory examinations, included cholesterol level , high-density lipoproteinHDL, LDL, calcium level, phosphate level, calcium×phosphate product, Parathyroid hormone, et al39 Patients were evaluated again 12 months later. The level of HsCRP and serum triglycerideTG was significantly higher than at baseline P<0.05. The level of serum HDL P< was significantly lower than at baseline 0.05. Mean SD CAC score increased for all ( ) subjects from 21.59 54.64 at time of 12 months ago to 37.15 71.43 P 0.05There is significant progression of CAC after renal transplantation in most subjects. Mean annualizedIII暨南大学硕士学位论文 rate SD of CAC score change was 15.5646.42. Mostsubjects 80.00% remained without calcification in without CAC group Conclusions: Serum fetuin A, age, pretransplantation dialysis duration, LDL, HsCRP are related with CAC score.Age and LDL are important factors to CAC. The trend in CAC is progressive in renal transplant recipients. The development of CAC is influenced mainly by the level of serum TG and HDL. Improving lipide, shortening pretransplantation dialysis duration, controling infection may reduce the risk of vascular calcification in renal transplant recipientsMay be synthesize endogenous inhibitor of fetuin A help to offer a new method to vascular calcificationRenal transplantation; Cardiovascular diseases; Coronary artery; Calcification; Key words : Risk factors; Fetuin A; HyperlipidemiaIV暨南大学硕士学位论文 目 录 中文摘 要 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„?? 英文摘 要 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„? ? 目 录„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„? 第一章 前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 第二章 资料和方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„5 第三章 研究结 果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„10 第四章 讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„18 第五章 结论与展 望„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„23 参考文 献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„24 缩略词 表 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„29 附录 1 患者资料登记 表 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„30 附录 2 相关图 片 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„31 在学习期间发表论 文 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„32 致 谢 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„45V暨南大学硕士学位论文 第一章前言 1 肾移植患者心血管疾病的流行病学研究 随着器官移植技术的进步,肾脏替代治疗越来越普及,终末期肾脏病ESRD患者的 生存时间明显延长,影响患者生活质量及长期生存的并发症随之增加。即使是成功的肾移 植术后,其心血管疾病(Cardiovascular Disease,CVD)仍是肾移植患者死亡的主要原因 [28、50] [23] ,其致命或非致命的 CVD 每年的发生率为 3.5% - 5% 。资料统计表示肾移植患者 [24-25] 的 CVD分别占移植后短期和远期死亡的 30% 和 75% 。因此 CVD已被认为是肾移植 患者的“高度危险因素”。 肾移植患者的 CVD表现主要有1冠状动脉疾病:临床或实 验室检查诊断的急性冠状动脉综合征或冠状动脉血管造影证实冠状动脉疾病;行冠状动脉 旁路手术或经皮腔内血管成形术。2左心室肥厚:超声心动图检查示左心室质量指数增 大。3充血性心力衰竭。 4 大血管动脉粥样硬化性疾病:超声或血管造影证实动脉病 变。5脑卒中:缺血性脑梗死或出血性脑血管意外。 2 CAC可作为肾移植患者 CVD 独立预测指标的研究进展 CAC 可导致心律失常、心肌缺血、心肌梗死、心脏瓣膜功能不全、血管壁的弹性下 降等,是造成肾移植患者 CVD高发病率和患病后高死亡率的重要因素之一。大量临床研 究表明, MSCT测定的 CAC积分可作为冠心病的监测指标, 能预测心血管事 件的发生率。 [26、27] 研究证明 CAC积分高低与心绞痛和心肌梗死发病率密切相关 。 Adragao对 CAC积分 高低和 CVD危险度进行研究后发现,CAC 积分越高,其发生心血管事件的危险度越高, 死亡率也越高。 [ 26 ] Niimura H 和等 Mit sutake R 通过使用 MDCT 对 466 名日本人的冠状动脉检测的 研究显示:存在冠状动脉狭窄的病人,其 CAC积分较无冠状动脉狭窄病人显著增高,提 [27] 示 CAC 积分与狭窄程度密切相关。美国学者 Budoff, MD 和 Matthew 等发现,对于无 心血管临床症状的患者而言,其死亡率与 CAC 积分的高低呈正相关,提示 CAC 是一个 强烈的独立于传统因素以外的预测心血管事件和全因死亡率的指标。Seyahi N和 Kahveci A应用 16排 MSCT 对肾移植患者计算 CAC积分,发现 CAC是肾移植患者心血管事件的 [57] 强烈的独立的预测指标 。 3 肾移植患者CAC的检测方法及CAC积分计算方法 一般情况下,肾移植患者合并CAC可以没有特殊的临床表现,即使发生了心血管事件, 也不能就说明是CAC导致,单纯靠临床表现我们无法明确,现在多采用影像学进行诊断, 常用的方法有如下两种:1暨南大学硕士学位论文 3.1电子束CT(Electron Beam Computed Tomography,EBCT),亦称为超高速CT,是 发现钙化和检测钙化进程的无创性检查。检查时一次屏息完成扫描,能无创地显现CAC并 [15] 能对CAC进行钙化积分定量测量,精确地评价CAC的程度。Arad等 研究结果提示对于 CAC积分?160的患者的心血管事件预测的特异性、敏感性、阴性预测值分别为82%、89 %、99%,其CVD发生的机率为无CAC者的35.4倍。国外对于EBCT在患者CVD中的应用 研究开展较广泛,其价值是肯定的,但其研究结果存在变异性和重复性较差等缺点,所以 应用EBCT追踪CAC的进展或者消退还存在一定问题,除非积分明显增加才考虑是病变进 展,而不是检查的误差所致,由于空间、密度分辨率较低和检查费昂贵而限制了它的普及。 3.2多层螺旋CT(Multislice Spiral CT,MSCT),MSCT可以清晰地显示冠状动脉的主 干及其2-3级分支,对冠状动脉不同程度的钙化均敏感,可以清楚的显示斑块的长度、位 置、形态以及斑块与冠状动脉分支的关系,同时结合3D成像显示管壁、管外及管腔的情况。 与EBCT相比,MSCT在空间分辨率和密度方面占很大的优势,利用MSCT检测CAC,方法 [16] 简便易行,敏感性及特异性均高,对于预测及早期诊断CAC具有重要价值 。Sharon进行 [17] 的回顾性研究,结果证实MSCT可以作为代替EBCT评价CAC的昀佳方法 。Becker等用 EBCT和MSCT同时对100位患者进行钙化定量,发现MSCT的有效X线光子量显著大于 EBCT,具有较高的时间和空间分辨率,更能在临床上推广应用。目前CT的冠脉成像受心 率的影响很大。一般要求心率降到60次/min ,其重建的斜面图像和曲面图像的软斑块诊断 [18 ,19] 的特异性和敏感性可在90 %以上,并需有一定经验的医生进行重建操作 。8 层、16 层 CT 已可分辨0.16mm大小的软斑块。软斑块的判断主要依靠CT值,根据不同CT值还可以分为 软斑块,中等度软斑块,硬斑块,但具体的CT 值界限还需进行大量临床和大样本的研究观 察。临床实践证实,尚未完全钙化的粥样硬化软斑块是十分危险的, MSCT 是目前显示冠状 动脉软斑块的唯一方法。MSCT 是一种非常好的评价CAC 方法。但需要更多的研究来比 较EBCT和MSCT 的作用,尤其在CAC 低水平时。 3.3CAC 积分的测定为 CAC 面积乘以 CT 值,参照 Agatston 的 CAC 定量方法,要求 2 所测得的面积应在 0.5mm 以上,将 CT 值 130HU 作为判断是否钙化的阈值,同时 CT 值 在 130~199HU 间的为 1 分,200~299HU 间为 2 分,钙化 CT 值 300~399HU 间的钙化 为 3分,400HU为 4 分,总 CAC积分为各个层面右冠状动脉、左冠状动脉、左前降支、 左回旋支 CAC积分之和。美国心脏协会认为,若 CAC 积分10,冠心病发生率 低;积分 为 11~400,表明冠状动脉狭窄存在,临床需加以重视;当积分400,则说明一定有冠心 病存在,且有高危险。一般来说,钙化越广泛,发生冠状动脉狭窄者越多,其程度越重。2暨南大学硕士学位论文 4肾移植患者发生 CAC相关因素的研究进展 肾移植患者CAC是多方面的因素共同作用的结果。肾移植患者具有“传统的”和“非 传统的”心血管危险因素。传统的危险因子是指“费明汉心脏研究”用以评估症状性缺血 [28-30] [40、41] [37、34、 性心脏病(IHD)危险型的危险因子,如吸烟、高龄 、脂代谢紊乱 、高血压 35] 、高半胱氨酸血症等。非传统的危险因子是指急性排斥反应、移植肾功能不全、氧化应 [12、40] [37-39] [3、43、44] [35] 激、炎症 、免疫抑制药物 、钙磷代谢紊乱 、血管钙化、肥胖等 。 [51、52] 近年来细胞分子机制研究表明 ,血管钙化的形成过程是一个基因与蛋白介导与 骨发育相似的主动的、可逆转的、高度可调控的生物学过程。主要特征是血 管平滑肌 (VSMC)细胞发生骨样变化的主动调节过程。血管钙化是钙化促进因素与抑制因素不平 [50] 衡的结果 。 已知的抑制血管钙化因子主要有Fetuin A、基质Gla蛋白 MGP、骨桥蛋白 OPN、 [21] 骨保护素OPG 。钙化促进因子有骨形态发生蛋白(BMPs)、细胞结合因子a1(Cbf a1)、 脂质过氧化产物 ox - LDL 、碱性磷酸酶AKP。 [6] Fetuin A是一种肝脏分泌的多功能蛋白,有改善内皮功能 ,可以通过其钙鳌合作用 [7-8] 抑制钙、磷沉积,还能通过抑制骨形成蛋白- 2 BMP - 2的活性抑制成骨细胞分化 。 它一方面与MGP及钙磷酸盐矿物质结合形成循环蛋白矿物复合物以防止血管钙化发生,另 一方面还可抑制骨形成发生蛋白BMP 和转化生长因子- β TGF - β 的促钙化作用。 研究显示Fetuin A在正常人血管钙化主动调节过程中, 占钙磷沉积抑制作 用的50%以上。人 Fetuin A的血清浓度约为0.5-1.5g/L。 试验证明靶向缺失胎球蛋白基因的大鼠发生严重的多器官钙化,证实Fetuin A在抑 [9] 制血管钙化起着重要的作用。Mori 等 进行的研究亦证实Fetuin A水平与颈总动脉钙化有 [10] 关, Fetuin A水平持续下降是加速血管钙化进展的原因之一。 Ktteler 等 的研究表明长期血 液透析患者的血清中Fetuin A水平较低,此血清在体外试验中抑制钙磷沉积的能力受到损 [11] 害,加入重组的纯Fetuin A后可逆转此现象。国外有报道 ,肾移植后患者Fetuin A水平升 、 [10 12] 高,虽比正常人稍低,但两者无统计学差异。亦有报道 在肾移植术后患者血清Fetuin A 的浓度升高与心血管死亡率的降低和CAC积分的减低密切相关。从而提示Fetuin A可能参 [13] 与阻止慢性肾脏疾病患者的血管钙化 。但是,同时也有研究表明:在肾移植术后3个月, Fetuin A是无明显增高的,反而,肾移植后2个星期会有所下降,随后其浓度会在3个月内上 [14] 升至移植前水平 。关于肾移植后Fetuin A水平的变化,国内目前没有相关的报道,有待 进一步深入研究。3暨南大学硕士学位论文 5 肾移植患者CAC发展趋势的研究进展 研究表明,血管钙化一旦形成,即使是肾移植也不能逆转其进展。昀近,国外 A.-S[1-3] Bargnoux,S.A. Abedi, M.K等学者的研究资料表明 ,肾移植能减缓、阻止,甚至逆转 血管钙化进展,其机制可能是:恢复肾功能及血清钙调节蛋白水平、调节矿物代谢、炎症 指标的下降、清除血管钙化毒素、使继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT)自然消退、改善 [5] 肾性贫血、脂代谢紊乱、肾性骨营养不良。国外也有报道说 肾移植早期(6 月)CAC 积分有所升高,但肾移植后期(6月) CAC明显变慢, CAC积分维持于6月水平。 Mazzaferro [4] S 对 41 例肾移植患者和 41 例透析患者的为期 2 年的病例对照实验表明,肾移植术后患 者的 CAC 是向前发展的,肾移植并不能阻止钙化的进展,但是与透析患者相比,肾移植 患者的 CAC 进展速度比透析患者的 CAC 进展速度明显减慢。鉴于上述的研究结果,血 管钙化能否被逆转,肾移植后患者 CAC的发展趋势又有何改变?有待进一步探查。 6 本课题研究的目的和意义 本课题通过应用 MSCT 对46例肾移植患者行 CAC检测,了解肾移植患者 CAC 发生情况,探讨 CAC 与血压、透析时间、移植时间、Fetuin A、HsCRP、LDL、CHOL、 HDL、TG、骨特异性碱性磷酸酶BAP、甲状旁腺素PTH、血钙、血磷的关系,并对肾 移植患者行 12个月的随访追踪,再次测定其 CAC积分和生化指标,研究肾移植患者 CAC 发展趋势,及其影响因素,从而为肾移植患者 CAC 的发生、发展以及 CVD 的防治提供 更多的信息参考。 4暨南大学硕士学位论文 第二章 资料与方法 1 研究对象 1. 1 病例纳入标准 1.1.2已行肾移植手术的患者,血肌酐133umol/L。 1.1.2均无感染(HsCRP5mg/L)。 1.1.3均服用免疫抑制剂,他克莫司 FK506 加泼尼松 Pred 加吗替麦考酚酯MMF。剂 量:FK506 1-8mg/d Pred5-15mg/d MMF0.5-1.5g/d 。 1. 2 病例排除标准 1.2.1既往12个月内有心力衰竭、不稳定心绞痛、心肌梗塞病史者。 1.2.2临床有明显感染、严重脑血管病变、急性血管炎、肝功能损害(包括肝硬化、肝炎) 、 恶性肿瘤。 1.2.3存在精神疾病而不能配合实验者。 2 研究方法 2.1 实验步骤 2.1.1 严格按照纳入标准及排除标准筛选研究对象。 2.1.2 记录患者年龄、性别、透析时间、移植时间、血压、身高、体重等一般数据,测定 入选时患者血钙、血磷、钙磷乘积、PTH、HsCRP、TG、CHOL、HDL、LDL、白蛋白、 血红蛋白、血清 Fetuin A、BAP等指标,进行冠状动脉 MSCT检查,测定 CAC积分。对 有 CAC患者和无 CAC患者进行统计学分析,将 CAC 积分与相关因素进行相关性分析和 非条件 logistic回归分析。 2.1.3 分别于随访 12 个月后再次测定 CAC 积分并分别测定患者血压、血钙、血磷、钙磷 乘积、PTH、HsCRP、CHOL、LDL、白蛋白等指标。对入选时及随访 12 个月后的上述 生化指标进行配对 t检验,对 12个月前后 CAC积分行配对资料的符号秩和检验(Wilcoxon sign-rank test)。 2.2 CAC评价方式 首先对患者进行 MSCT 扫描,扫描范围自主动脉根部至心尖部。冠状动脉的 MSCT 解剖按解剖学定义,左冠状动脉由左冠状窦发出后至分叉前的短而粗的干为左主干,其后 分为两大支,行走于左房室沟者为回旋支,由右冠状窦发出行走在右房室沟者为右冠状动 脉。 MSCT 扫描采用心电门控触发成像,单次扫描时间为 0.32秒,共 4层,每层厚为 2mm。 5暨南大学硕士学位论文 设备为飞利浦 16排 MSCT 机,检查前训练患者屏气,并控制患者心率 ?80次/分,难以配 合者可含服硝酸甘油 1 片,扫描全过程约 25-30 秒。钙化灶定义为 CT 值?130HU。将扫 描资料输入工作站,应用美国普林斯顿大学开发的心脏软件包,由计算机自动将 CT值峰 值 ?130HU 的钙化灶标记为彩色,从冠状动脉根部开始逐层观察图像,圈出右冠状动脉 (RCA)、左冠状动脉主干(LM)、左前降支(LAD)、回旋支(LCX)上所有 CT值?130HU 的病灶,分别加上定位标记。CAC积分的计算方法:使用 Agaston 及其修正方法,CT值 在 130~199HU之间的钙化定位 CT分值为 1,200~299HU 之间定为 2,300~399HU之 间定为 3,CT 分值 400HU 及以上为 4,各个钙化灶的 CT 分值乘以其面积,得到各个钙 化灶的积分,将所有积分累加即获得整个 CAC的积分。全部标记完后机器将自动计算出 冠状动脉各个分支病灶的数量、面积和钙化积分及该患者的 CAC总积分,并自动生成检 查。 2.3 生化检查 采用双缩脲法检测血清总蛋白浓度;采用干式电极法全自动电解质分析仪检测血钙、 血磷浓度;采用血红蛋白法检测血清血红蛋白浓度;采用胆固醇氧化酶终点法检测血清 CHOL;采用酶学终点法-2检测 TG;采用选择性反应法检测 LDL;采用选择性掩蔽法 检测 HDL;采用电化学发光法检测 PTH;采用溴甲酚绿法检测血清白蛋白浓度;采用乳 胶增强免疫散射比浊法检测血清 HsCRP水平。Fetuin A使用双抗体夹心酶联免疫吸附法 ELISA 测定。 2.4 人血清 Fetuin A检测过程 图 1双抗体夹心酶联免疫吸附法ELISA原理 2.4.1方法学原理:采用双抗体夹心酶联免疫吸附法 ELISA 测定人血清 Fetuin A的含 量。用纯化的 Fetuin A抗体包被微孔板,制成固相载体,往微孔中依次加入标本或标准 6暨南大学硕士学位论文 品、辣根过氧化物酶HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物四甲基联苯胺TMB 显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成昀终的黄色。 颜色的深浅和样品中的 Fetuin A浓度呈正相关。(具体见图 1)2.4.2使用仪器 1. 低速离心机:型号 TDL-50B,产地 中国 2. 电子天平:型号 TMP-1, 产地 中国 3. 隔水式恒温箱:型号 GNP-9080 ,产地 中国 4. 超低温冰箱:型号 Forma702,产地 美国 5. 1L量筒 6. Bio-Rad 680型酶标仪:机身号 12893, 产地 美国 2.4.3使用试剂 1.蒸馏水 2. Fetuin A检测试剂盒:美国 R?D公司广州市鲁诚生物科技有限公司提供, 见表 1。 表 1 血清 Fetuin A检测试剂盒的组成 成 份 数量 Fetuin A标准品 1 瓶 标准品稀释液 1 瓶 包被 Fetuin A单克隆抗体的 96 孔酶标板 1 个 HRP标记的亲和素酶标试剂 6ml 样本稀释液6ml 30 倍浓缩洗涤液 20ml 显色剂 A 6ml 显色剂 B 6ml 终止液 6ml 封板膜 2 张 密封袋 1 个 2.4.4操作过程 (1)采外周静脉血(无需抗凝)于常温下 3000rpm/min离心 15min,离心后取血清 200ul, 置-80?保存待测。 (2)外周血中 Fetuin A的检测 ?. 准备:从冰箱取出试剂盒,室温复温平衡 60分钟。7暨南大学硕士学位论文 ?. 配液:用蒸馏水将 30倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。用样本稀释剂按 1:2系 列稀释 Fetuin A标准品(初浓度 480μg/ml)。 ?. 加标准品和待测样本:取酶标包被板,分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照 孔,记录各孔位置,在标准品孔中加入标准品 50μL;待测样本孔中先加入待测样本 10μL,再加样本稀释液 40μL即样本稀释 5倍;空白对照孔不加。 ?. 温育:用封板膜封板,37?恒温箱温育 30min。 ?. 洗板:弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,震荡 30 秒,甩去洗涤液,吸水 纸上拍干,如此重复洗板 5次,拍干。 ?. 加酶标试剂:每孔加入酶标试剂 50μL,空白对照孔不加。轻轻震荡摇匀,37?恒温 箱温育 30min。 ?. 洗板:弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,震荡 30 秒,甩去洗涤液,吸水 纸上拍干,如此重复洗板 5次。 ?. 显色:每孔先加入显色剂 A 液 50μL,再加入显色剂 B液 50μL,用手轻轻震荡混 匀,37?避光显色 10min。 ?. 终止:取出酶标板,每孔加终止液 50μL,终止反应颜色由蓝色立转黄色。 ?. 测定:以空白孔调零,在终止后 15分钟内,用 450nm波长测量各孔的 OD值。 2.4.5数据处理:根据标准品的浓度及对应的 OD值,应用 CurveExpert1.3 软件,以实际 测的吸光度值为纵轴,以 1:2系列稀释后的 Fetuin A标准品的浓度为横坐标,绘制标 准品曲线。计算出标准曲线的直线回归方程,再根据样本的 OD值,在回归方程上计算 出对应的样品浓度。昀终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。 3 统计方法 x 采用 SPSS.13.0 软件系统计算均值, 所有计量资料数值以均数?标准差( ?s)表示, 正态分布资料的两组均数比较采用两样本 t 检验。不符合正态分布的计量资料比较用秩和 检验。CAC的影响因素采用非条件 logistic回归分析。符合正态分布的两组计量资料的相 关性采用 Pearson 相关分析;不符合正态分布的两组计量资料的相关性则采用 Spearman 等级相关分析。计数资料率的比较使用卡方检验。对入选时及随访 12个月后的生化指标 进行配对 t检验,对 12个月前后 CAC积分行配对资料的符号秩和检验 (Wilcoxon sign-rank test) 。假设检验水准 α0.05(双侧)。 4 研究过程中的质量控制问题 4.1对于存在主观影响的数据,如 CAC评分过程,采用所有病例 CAC评分均有同一医生、 8暨南大学硕士学位论文 固定仪器完成,尽量减少主观因素对数据的影响。 4.2严格按照试剂盒说明步骤进行操作,并请专业人士指导。 4.3 调查过程中,尽量减少对回忆所得结果的依赖,而结合患者的住院、门诊病历及信息 中心查询所得结果。 4.4调查期间对数据的完整性和准确性进行严格的质量检查和核对。 4.5数据录入后反复多次检查,确保录入准确无误。 4.6统计过程请统计专家予以指导、核对。 9暨南大学硕士学位论文 第三章 研究结果 1 患者的一般资料 在我院已行冠状动脉 MSCT平扫的肾移植患者共 46例,男性 32 例(69.6%) ,女性 14 例(30.4%),年龄 40.85 ? 10.15 岁 24 岁-65 岁),移植时间 49.33 ? 46.54 月(4 月-216 月。 5例患者从来没有经历透析治疗(10.87%)。 33例患者有高血压病史(71.74%)。 5例患者有糖尿病病史(10.87%)(其中有 CAC者占 3 例和无 CAC者占 2例)。 表 246例肾移植患者原发病情况 疾病名称 病例数 慢性肾小球肾炎 29 高血压肾病 4 慢性间质性肾炎 5 多囊肾2 狼疮性肾炎 2 过敏性紫癜性肾炎 2 糖尿病肾病 1 先天性海绵肾1 图 2 已行冠脉 MSCT检查的 46例肾移植患者原发病比例 10暨南大学硕士学位论文 2 CAC 相关因素分析 2.1 46例肾移植患者发生 CAC的情况 46例患者中存在 CAC的患者 15例,无 CAC的患者 31例, CAC发生者占 32.61%, 平均 CAC 积分为 50.88?226.14 分(0~1513.00分)。透析时间?24个月 15例,CAC 发生者占 6.67%(1例),透析时间 24-48 个月 15例,CAC发生者占 53.3%(8例), 透析时间?48个月 16例,CAC 发生者占 37.5%(6例)。 2.2 不同性别间 CAC 发生情况的比较 不同性别肾移植患者的冠状动脉钙化率间差异无统计学意义(P 0.05)。不同性别 肾移植患者的 CAC积分差异无统计学意义(P 0.05)。见表 3。 表 3 不同性别肾移植患者 CAC发生情况的比较( x ?s) 性别例数 CAC 钙化率(%) CAC 积分 男32 37.5 69.3?269.8 女14 21.49.4?27.2 2.3 不同原发病间 CAC发生情况的比较 不同原发病肾移植患者的冠状动脉钙化率间差异无统计学意义(P 0.05)。见表 4。 表 4 不同原发病肾移植患者的 CAC发生情况的比较( x ?s) 原发病 有 CAC无 CAC 合计 钙化率(%) 慢性肾炎 92029 31.0 非慢性肾炎 61117 35.3合计 15 3146 32.61 2.4血清中 Fetuin A测定的结果 应用 CurveExpert1.3软件,以 1:2系列稀释后的 Fetuin A标准品的浓度为横坐标, 以实际测得的标准品 OD值为纵坐标,绘制出标准曲线。由图可知:Fetuin A标准品的浓 度 10ug/ml-300 ug/ml,其浓度与测得的 OD值接近直线关系,为正相关。直线回归方程为: y0.0037317x-0.008542857,相关系数 r?1,表明标准曲线的拟合度较好。所测结果详见 表 611450nm 暨南大学硕士学位论文 1 0.8 吸光度( 0.6 0.4 ) 0.2 0 50 100 150 200 250 300 标准品浓度(μg/ml)图 3 ELISA法测定人血清 Fetuin A的标准曲线 表 5 ELISA法测定人血清 Fetuin A标准品浓度与吸光度值 标准品浓度(μg/ml) 240 120 60 30 15 标准品吸光度 0.89 0.432 0.224 0.093 0.045 2.5 46例肾移植患者 CAC与观察指标的研究结果 2.5.1 一般情况方面, CAC组与无 CAC组在年龄及透析时间存在显著性差异P0.05, CAC组高于无 CAC 组。而移植时间、抗排斥药物的剂量间的差异无统计学意义。生化检 查方面,血钙、HsCRP、LDL、白蛋白等因素 CAC组与无 CAC 组存在显著性差异(P 均 0.05),CAC 组的血钙、HsCRP、LDL、白蛋白等数据均高于无 CAC 组。与无 CAC 组 相比较,CAC组的 Fetuin A浓度偏低,两组血清 Fetuin A浓度的检测水平有显著性差异 (P 0.000)。而收缩压SBP、舒张压DBP、血磷、TG、CHOL、PTH、BAP 等因素无 显著性差异,具体数据详见表 6。 2.5.2对所有肾移植患者行相关性分析,CAC 积分和 Fetuin A 呈负相关(r-0.475,P 0.05)。CAC积分与年龄(r0.505, P 0.05)、透析时间(r0.354, P 0.05)、 LDL(r0.659 P 0.05) 、血钙(r0.384, P 0.05)、HsCRP(r0.479, P 0.05)呈正相关。具体数据详见 表 7。Fetuin A与 HsCRP(r-0.678, P 0.05) 、年龄(r-0.296, P 0.05)呈负相关,而与 12暨南大学硕士学位论文 血钙、血磷、PTH、BAP、LDL、TG 等生化指标无明显相关性(P 均0.05)。具体数据 详见表 8。 2.5.3对单因素分析筛选的 7 个危险因素进行非条件 logistic 回归分析,按照 α0.05 水 准,结果显示 CAC 组与无 CAC 组的年龄、LDL 存在显著性差异,OR 值分别是 1.196、 4.263。P值分别是 0.015、0.009。证明了年龄、LDL是 CAC的危险因素。 表 6 CAC组与无 CAC组相关因素的比较( x ?s)观察项目 CAC 组(n15) 无 CAC 组(n31) P 值 年龄(岁) 48.87 ?10.66 36.97 ?7. 34* 0.001 性别(男/女) 12/3 20/11 0.29 透析时间(月) 22.13 ?18.58 11.11 ?13.85* 0.006 移植时间(月) 57.07 ?49.90 45.58 ?45.19 0.128 血钙(mmol/L) 2.48 ?0.11 2.37 ? 0.17* 0.011 血磷(mmol/L) 1.23 ?0.36 1.11 ? 0.28 0.331 钙磷乘积 36.35 ?10.41 31.65 ?7.89 0.15 Fetuin A g/L 0.27 ?0.04 0.34 ?0.07* 0.000 HsCRP(mg/L) 4.24 ?1.23 2.79 ?1.95* 0.003 PTH(pg/ml) 81.40 ?24.85 80.39 ?62.66 0.081 BAP(ug/ml) 26.15 ?23.35 15.87 ?12.82 0.297 TG(mmol/L) 1.61 ?0.97 1.38 ?0.56 0.888 CHOL(mmol/L) 5.82 ?1.29 5.06 ?1.28 0.068 HDL(mmol/L) 1.44 ?0.56 1.48 ?0.46 0.916 LDL(mmol/L) 3.53 ?0.60 2.65 ?0.58* 0.000 白蛋白(g/L) 44.02 ?2.60 41.86 ?3.28* 0.025 SBPmmHg 134.67?9.56 132.52?12.42 0.673 DBPmmHg 79.33 ?6.52 78.74 ?7.84 0.802 他克莫司(mg/d) 2.67 ?1.79 3.31 ?2.01 0.332 泼尼松(mg/d) 6.50 ?2.96 6.67 ?2.73 0.785 吗替麦考酚酸(g/d) 1.17 ?0.59 1.28 ?0.46 0.129 注:与 CAC组比较,* P0.0513暨南大学硕士学位论文 表 7CAC积分与肾移植患者观察指标的相关性 观察项目 r值 P 值 年龄*0.505 0.000 移植时间 0.221 0.139 透析时间* 0.354 0.016 血钙* 0.384 0.008 血磷 0.416 0.331 血肌酐 0.1070.480 TG 0.0930.539 HDL 0.032 0.834 LDL* 0.659 0.000 HsCRP* 0.487 0.001 PTH 0.1590.114 钙磷乘积 0.219 0.143 Fetuin A* -0.475 0.001 注:* CAC 积分与年龄、透析时间、血钙、HsCRP、LDL 、FetuinA 呈直线相 关,P 0.05表 8 血清 Fetuin A水平与肾移植患者观察指标的相关性 观察项目 r值 P 值 年龄*-0.296 0.046 移植时间 -0.109 0.471 血钙 0.046 0.760 血磷 -0.213 0.155 血肌酐 -0.162 0.284 TG -0.241 0.107 CHOL -0.095 0.531 HDL -0.057 0.708 LDL -0.205 0.171 白蛋白 0.154 0.307 HsCRP* -0.588 0.000 PTH -0.068 0.652 钙磷乘积 -0.213 0.156 注: *血清 Fetuin-A 水平与年龄、HsCRP呈直线相关,P 0.05 3 12 个月后复查各观察指标情况(n39) 随访 12 个月后 46 例肾移植患者中有 39 例患者愿意回院接受第二次冠状动脉 MSCT 检测,采用配对资料 t 检验分别对肾移植患者 12月个前后的各观察指标进行统计学分析, 14暨南大学硕士学位论文 按照 α0.05 水准,随访 12个月后, HsCRP 、 TG的浓度显著升高, t 分别为(2.251、 2.142), P均 0.05,HDL的浓度显著下降,t 2.43,P 0.05。其余血钙、血磷、钙磷乘积、血 压等指标均无显著性差异P0.05。 表 9 12个月前后 39 例肾移植患者各观察指标的比较 x ?s 观察项目 12 个月前 随访 12 个月后 P 值 血钙(mmol/L) 2.41?0.16 2.41 ?0.22 0.922 血磷(mmol/L) 1.15?0.33 1.10 ?0.23 0.216 钙磷乘积 33