【doc】牛奶中蛋白质含量的直接电位测定方法研究

【doc】牛奶中蛋白质含量的直接电位测定方法研究 牛奶中蛋白质含量的直接电位测定方法研 究 l》}譬第2期广东奶业 牛奶中蛋白质含量的直接电位 测定方法研究 秦立虎,寇云娟,任江红,孙武斌 (1.西安东方乳业有限公司,西安710027; 2.两安光明乳业有限公司,西安710054; 3.上海汇普化学品有限公司,上海200023) 摘要:在碱性条件下牛奶中的两性氨基酸与甲醛溶液反应.氨基上的两个氢原子被次甲基所 取代,失去了氨基的碱性特性,释放出游离的羧基,从而使牛奶的电化学特性发生变化.据 此,笔者提出并建立了一种全新的快速测定牛奶中蛋白质含量的直接电位方法实验研究结 果表明,其蛋白质含量的线性测定范围为2,4-3.()%,回收率高达95%v~上该方法具有操作 使用简单方便快捷准确等特点,在乳品企业的生产实践中具有一定的推广使用价值 关键词:牛奶蛋白质直接电位测定方法 Theresearchofdriectvoltagetestingabouttheproteininmilk QinLihuKouYunjuanRenJianghongSunWubin (1.XianOrientalDairycorp,Xian710027,China;2.XianBrightDairyCorp,Xian710054,Ch ina; 3.ShanghaiNCEChemicalCorp,Shanghai200023,China) Ab吐mc ,:Inthispaperwemakearesearchondiscoveringawaytomeasuretheproteininmilk aboutdirectvolatage.Theresultofexperimentindicatedthatthismethodmeasuringofprotei n aboutmilkinlinerang2.4-3.0%,recoverratereach95%,andthismethodcanbeusedtomea— suretheproteinofmilkinprocessing. :milkprotein,directvoltage,measuringmethod O引言 牛奶中的蛋白质含量是衡量其营养价值高低 的一项重要的指标,因此有关牛奶蛋白质的分析 对于乳品企业来说就显得尤为重要.目前国 内外所采用的有关牛奶中蛋白质含量检测的方法 主要有凯氏定氮法,紫外吸收法,双缩脲分光光度 法,染料结合分光光度法,lowry法(Folin一酚试剂 法),Bradford法(考马斯亮蓝法),毛细管电泳分析 法,罗丹明生物探针法以及高效光谱遥感技术分 析法等几种方法_5_,其中经典的凯氏定氮法以其测 定结果的准确稳定及其重复性强等方面的优点而 被国内外所广泛采用和认可,但该方法存在着操 作繁琐,试剂消耗量大,操作过程费水,费电,费时 等缺点,在消化的同时排放出来的二氧化硫以及 硫化氢等有害气体,还会造成环境污染,危害人体 健康,而其他的几种方法则存在着需要有专门的 仪器或特定的试剂等方面的原因目前还很难适应 大规模T业生产的需要,而尽管不时有改良之法 出现,但也存在或多或少的缺点,从而使其离生产 实践的需要还有一定的距离.有鉴于此,笔者在广 泛的研究前人有关牛奶蛋白质的各种分析检测方 法及其方法的优缺点的基础上,以蛋白质中的氨 基酸与甲醛溶液在化学反应中所表现出来的电化 学特性变化为依据提出并建立了一套全新的牛奶 中蛋白质含量的直接电位测定方法.这种方法的 最大特点就是采用常规的检测仪器及试剂,通过 国 馕第2期广东奶业 电位值的测定再经过曲线回归方程的计算, 即可获得令人满意的测定结果.该方法目前在国 内外文献资料中尚未见有过报道 1测定原理] 氨基酸是由具有酸性的羧基(一COOH)和碱性 的氨基(一NH)相互作,}}j而形成的一种中性的内 盐,当在碱性条件下加入甲醛溶液时,氨基酸便与 甲醛反应,形成一种化合物,i亥化合物氨基卜的两 个氢原子被次甲基所取代,于是便失去丁氨基的 碱性特性,从而使其呈酸性的羧基释放出来,并使 其溶液的电化学特性发生变化.由于该化学反应 是可逆的,而且一定要有适当过量的甲醛存在,才 能使该反应进行充分并迅速的达到化学反应平衡 状态,这样我们就可以利用直接电位方法来求出 牛奶中的游离氨基酸的含量.并且再根据生鲜牛 奶中的游离氨基酸与其蛋白质之间总量保持衡定 比例关系的原理,从而利用电位法就可直接求出 牛奶中蛋白质的含量.但是,由于牛奶本身胶体体 系的复杂多变性以及直接电位法在测定中易受其 它因素的干扰影响等诸多原因,从而就使得其测 定值与实际含量之问可能存在着较大的偏差.为 了使直接电位法测定牛奶中的蛋白质含量的这一 方法变为现实,笔者采用凯氏定氮法所测定的牛 奶中蛋白质的含量对牛奶与甲醛溶液在反应后的 平衡电位值作图.再经过讣算机数据处理.从而得 出了牛奶中蛋白质的含繁与其最终平衡电位值之 间的线性回归关系方程,这样我们就可以通过测 定其电位值,并经过标准曲线的线性回归方程的 计算就可以直接得到牛奶中蛋白质的含量 2材料与方法 2.1实验材料 0.05mol/L的NaOH溶液,40%的碱性甲醛溶 液(PH=9.20),50ml碱式滴定管,PHS一3型数字式 精密酸度计,FA1004型电子分析天平,KDJ一1型蛋 白质测定仪, 2_2测定方法1卅 2.2.1凯氏定氮法按照GB5009.5—1996中的有 关要求进行操作. 2.2.2甲醛溶液的处理目前市场上销售的甲醛 溶液中常含有微量的甲酸,应当除去,否则易产生 正误差,容易使牛奶中蛋白质含量的测定结果偏 团 高.具体的处理办法为:用0.1mol/L的NaOH溶液 中和甲醛溶液,同时用酸度计控制其溶液的PH 值,直到PH=9.20为止. 2.2.3蛋白质的测定计算取待检测的牛奶样品 20m1.将其温度调整到1O一20?.然后_}}j0.05mol/L 的NaOH溶液将其滴定至PH=9.20(用酸度计控 制),即刻加人40%的碱性甲醛溶液5ml混和均 匀,2rain后测其溶液的PH值.每个样品的PH值 总共平行测定三次,取其平均值.然后再根据标准 曲线的线性回归方程的计算就可以直接得到牛奶 中蛋白质的含量. 3结果与讨论 3.1蛋白质测定条件的确定 从该方法的测定原理及其所涉及的相关化学 基础知识来看,甲醛溶液的用量,反应平衡时间, 测定的温度范围等因素都将直接影响到PH值的 测定,并最终影响到牛奶中蛋白质含量测定结果 的准确性.按照2.2.3中的测定方法在固定其他因 素不变的情况下,对其中的每一个因素进行最佳 测定条件的选择试验.通过一系列的实验最终所 确定的牛奶中蛋白质含量的测定条件为40%碱性 甲醛溶液的用量为5ml,甲醛溶液与牛奶的反应时 问为2rain,PH值的测定温度范围为10—20~C.此处 甲醛溶液的用量较其理论计算值的需要量偏大, 这主要是考虑到氨基酸与甲醛溶液的反应本身是 一 个化学平衡反应,加大甲醛溶液的用量可以缩 短反应平衡所需要的时问.另外,在甲醛溶液加人 后,混合搅拌的时间也不宜超过lmin,这主要是因 为甲醛在搅拌的过程中容易与空气中的氧气发生 化学反应产生甲酸,从而使牛奶中蛋白质含量的 测定结果偏高 3_2蛋白质测定计算公式的确定[] 分别取不同蛋白质含量的生鲜牛奶样品.按照 2.23中的测定方法以及3.1中所确定的最佳测定 条件测其与甲醛溶液混合后的最终PH值,同时用 GB5009.5—1996中的凯氏定氮法测定每个样品中 的蛋f:】质含鼍,最后再用MicrosoftExce12003应用 软件对测定结果进行处理得到如下图一1所示的 c—PH曲线.从C,PH值曲线图中我们可以看 出,牛奶巾蛋白质的含量与其最终平衡PH值之间 的线性系方程式为c=(一2.09PH+17.94)%.其相 墨6第2期--广东奶业 关系数R为O.9051.从c—PH曲线图及其随后 所做的大量实验数据的处理结果来看,直接电 位法测定牛奶中蛋白质含量的最适宜的线性 测定范为2.4—3.0%.对于蛋白质含量在3% 以上的牛奶样品虽说仍然可以使用直接电位方 法来进行测定计算,但其测定结果的误差相对 来说就会更大一些 832 X 03.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.O 7.17.27.37.47.5 墨一Jc-确曲蟪圈PH 3.3蛋白质测定方法的精密度试验 取一份生鲜牛奶样品在l5?的温度条件下 按照本文中所提出来的直接电位测定方法对其 蛋白质的含量依次平行测定7次,其结果如表一1 所示.经统计学计算得知.这七次测定结果的平 均值为2.92%,标准偏差为0.034%,变异系数为 1.16%.实验数据充分说明本方法测定结果的精 密度非常令人满意. 表一1精密度试验结果 序号蛋白质含量(%) 3.4测定蛋白质中的回收率试验 取一一份生鲜牛奶样品,用凯氏定氮法测得其 蛋白质的含量为2.85%,将其分成五份,分别添加 不同量的令脂淡奶粉(蛋白质的含量已预先测 定),混合均匀后再用直接电位法测定其蛋白质含 量.并计算其回收枣,其结果如表一2所示. 表一2回收率试验结果 序号蛋白质计算值(%)蛋白质测定值(%)回收率(%) 从表一2可以看出,直接电位测定牛奶中蛋白 质含量的回收率高达95%以上 35工艺过程对测定结果的影响 牛奶中蛋白质含量的上述测定算公式是以 生鲜牛奶为基础研究概括出来的.为判定研究工 艺过程是否会对本方法的测定结果产生影响.笔 者选择均质压力和杀菌温度这两个因素在实验室 和生产车间用该方法对其原料奶,不同均质压力, 不同杀菌温度工艺处理后的牛奶产品的蛋白质含 量进行了测定,其结果如表一3所示. 表一3不同均质压力下蛋白质的测定结果(%) 表一4不同杀菌方式下蛋白质的测定结果(%) 从表一3,表一4可以看出,均质过程对用本方 法所测定的牛奶中蛋白质含量的测定结果没有影 响.巴氏杀菌方式对牛奶中蛋白质含量的测定结 果也没有影响,而超高温灭菌则会使其蛋白质的 测定结果明显偏低,这主要是与在超高温灭菌的 加工条件下牛奶中的游离氨基酸与乳糖所发生的 固 %%姻 2222222 1234567 毳曦第2期 梅拉德化学反应有关,同时也与在超高温灭菌的 加工条件下部分的乳清蛋白质由于受热变性发生 沉淀有关 4结论 4.1上述实验研究结果表明,直接电位法测定 的变异系数为1.16%,本方法只需要一些常规的检 测仪器及试剂,具有操作使用方便简单快捷准确 等特点,完全可以代替文献资料中所介绍的测定 方法来进行常规性的生产检测,具有一定的推广 使用价值. 4.2对于蛋白质含量超过3%的牛奶样品,可以采 用通过对待测样品进行适当加水稀释后用直接电 位法来现行测定,最后再通过相应的换算得到牛 奶中蛋白质的含量. 4-3牛奶样品中如果掺杂添加有钱盐离子或者氨 基酸以及动植物水解蛋白等成份,都会使其蛋白 质含量的测定结果偏高.另外,牛奶中蛋白质含量 测定计算公式中的两个参数与奶牛的品种,饲养 地区环境,水质和饲料等因素有关,所以该方法在 具体的使用过程中应先结合本地区的实际情况求 出相应的校正系数后再行测定计算,这样使测定 结果就会更加准确一些. 主要参考文献 [1]GB5009.5—1996,食品生检验方法理化部分[s]一E 京:中国标准m版社.1996. [2]宁正祥.食品分析[M]一E京:中国轻工业出版 社.1998. [3]陈耀祖.有机分析化学[M].北京:中国化学工业出版社. 1995. [4]王美兰.甲醛法测定总氮含量的若干问[J].大学化 学.2002(6):35—38. [5]刘立明.罗丹明生物探针法测定蛋白质[J].湖北大学学 报,2005(4):363,365. [6]赵思明.计算机在食品T程中的应用[M].北京:中国化 学T业出版社.2005. LIS4王-LLLLLL|s止j止LLIsLLLLLLLLLLISLLLLL.LLLLLISLL (上接第14页) 3小结与讨论 3.1MMULT函数是指返回两数组arrayl与array2 的矩阵乘积,arrayl的列数必须与array2的行数相 同,而且两数组中都只能包含数值.返回后的矩阵 乘积的行数与arrayl的行数相同,列数与arrav2的 列数相同.在单元格中输入MMULT或 MINVERSE等数组函数后,如果直接按EEnter]键, 只能返回一个数值,必须同时按下『Ctr1]+『Shift]+ [Enter]后才能返回一个数组值. 3.2笔者在本文中是制作了二项式(二元)至五项 式(五元)回归方程的计算模式,基本能满足畜牧统 计上的多项式(多元)回归分析的需要.在制作该 计算模式时,读者应尽量避免在输入公式时使用绝 对地址,应使用相对地址.这样可以保证在插入或 删除行,列或单元格时,公式不用重新输入.如果 在单元格A11:A22之问插入或删除行.并录入或 修改自变量x与依变量y的数值后,能很快计算出 多项式(多元)回归方程式.因此,这个计算模式就 成为一个多项式(多元)回归分析的小程序,可以重 团 复使用. 3.3FINV函数是指返回F概率分布的反函数值, 即是平时查F值表中的值,可以省却读者查F值 表的麻烦.在Excel2000有许多这样的统计函数, 可很方便地进行统计分析.如返回t值表的函数为 "TINV",返回协方差的函数为"COVAR"等.读者不 防试一试. 3.4以上介绍的是多元回归与多项式回归分析最 基本的步骤,在实际工作中可能还需要做复相关系 数与偏回归系数的显着性检验,标准偏回归系数与 偏相关系数的计算,通径分析等工作,这些工作在 Excel软件中均能轻易完成,由于篇幅所限,在此不 作介绍