【doc】重组腺病毒介导金黄色葡萄球菌肠毒素A基因在小鼠B16黑素瘤细胞中的表达

【doc】重组腺病毒介导金黄色葡萄球菌肠毒素A基因在小鼠B16黑素瘤细胞中的达 重组腺病毒介导金黄色葡萄球菌肠毒素A 基因在小鼠B16黑素瘤细胞中的表达 中华皮肤科杂志2o05生箜鲞笙塑』,: 重组腺病毒介导金黄色葡萄球菌肠毒素 A基因在小鼠B16黑素瘤细胞中的表达 牟霞陆洪光余德厚吴承龙汪宇 【摘要】目的研究金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因通过重组腺病毒介导转染人B16黑素瘤细 胞中的表达情况.方法用RT—PCR和流式细胞仪检测SEA基因在B16黑素瘤细胞中的表达.结果 在转染SEA基因的B16黑素瘤细胞中检测到SEA基因的转录,并于转染后24h开始有SEA蛋白的表 达.到72h表达量达最高值87.22.之后减弱,直到168h仍有少许表达.结论SEA基因可以在B16黑 素瘤细胞中表达,为下一步黑素瘤的基因治疗奠定基础. 【关键词】肠毒素类;基因表达;黑色素瘤,实验性 TheExpressionofStaphylococcalEnterotoxinA(SEA)GeneonMurineB16MelanomaCell sMediat- edbyReplication-DefectiveRecombinantAdenovirusVectorMXia',LUHong-guang,yZ 一hou, WUCheng-long,WANGYu."DepartmentofDermatology,AfillipedHospitn厶Gu@angMedicalCollege, Gu帆550004,China. 【Abstract】ObjectiveToinvestigatestaphylococcalenterotoxinA(SEA)geneexpressiononmurine Bl6melanomacellsmediatedbyreplication.defectiverecombinantadenovirus.MethotisS EAexpressionon theB16melanomacellswasdetectedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT —PCR)andflow cytometry(FCM).ResllltsRT—PCRandFCMprovedthatSEAcouldbespecificallyexpressedintheB16 melanomacells.ConclusionTheSuccessfulexpressionofSEAgeneontheB16melanomace llsmightbe usedforthetargetedtreatmentofmalignantmelanoma. 【Keywords】Enterotoxins;Geneexpression;Melanoma,experimental 金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)是超抗原 (SAg)家族的重要成员之一.大量研究表明SEA作 为强大的T细胞激活剂,产生杀伤性很强的细胞毒 性T细胞(CTL),有可能成为新一代抗肿瘤免疫分 子].恶性黑素瘤(MM)是一种恶性程度很高的肿 瘤.SEA被越来越多应用于MM的实验研究中.由 于SEA的作用存在两面性.一方面活化T细胞.另 一 方面也可诱导T细胞耐受,且靶组织外的过多聚 集会产生明显的毒副作用,故提高SEA的靶向性,尽 量减少其不良反应成为目前研究的热点[.本研究 课题所采取的腺病毒为基因组El区,E3区缺失的5 型腺病毒,通过复制缺陷型腺病毒载体的介导,将 SEA基因导人小鼠Bl6黑素瘤细胞中,并通过RT— PCR及流式细胞仪检测SEA在B16细胞中的表达 一 ,细胞系 材料与方法 基金项目:国家自然基金资助项目(D一39960071) 作者单位:550004贵阳医学院附属医院皮肤科(牟霞,陆洪光, 余德厚,汪宇);贵阳医学院微生物教研室(吴承龙) 通讯作者:陆洪光,E—mail:hongguanglu@hotmail.COrn 365 ? 论着? 小鼠黑素瘤B16细胞系(购自中国科学院细胞 库),培养条件为1640培养基,含10%的小牛血清 (Fetalcalfserum,FCS),37oC,5%CO2. 二,病毒 携带SEA基因的复制缺陷型腺病毒(Ad—SEA) 及未携带SEA基因的腺病毒(Ad)['7_. 三,主要试剂 PMI一1640培养基(Gibco公司),小牛血清(杭 R 州四季青公司),Trizol试剂(BBI原装),焦碳酸二乙 酯(DEPC,BBI原装),RT—PCR试剂盒(Promega公 司).PCR引物:SEA引物(上海生工生物工程技术 服务有限公司合成):上游:5一AAAGAGAA1TrcATG AAAAAAACAGCA一3,下游:5'-CGGGGGAArlTCrlTA AC3TGTATATAA一3;内对照引物:上游:5一GCCAT TCTCACCGGArlTCAGTCGTC一3,下游:5,_GACTGA ACTGCCCTGCCGCCGA一3.0.25%胰蛋白酶(上海生 T生物工程技术服务有限公司),SEA单克隆抗体 (第四军医大学免疫教研室),FITC标记小鼠IgG(:IE 京中山公司). 四,主要仪器 rl??b21105J^)1?*1Chi,,JI}hiJl[I?2o()586 I'【H仪(I.]pl?lf?fMal?I,『i1<lienl 司):流』?细毗抒析仪(1{Il}A(I:aliI…II) t|;浇 I啦腺病毒^一I^转染III6细胞:取2× 1个计墩1长…n胞.将蚺乔液啦….接种 c】I(I1…IIillielIv一?fiI…?)为!?f_{』惊病毒城体 AtJ—SIi;A.]'j71,5tlc】r2lll川每】5mi. 摇幻1坎均0J感2Il后.37'1.5c? 继续蚺挥同II-f"腺J圩lAJ)转牲的…6巢素临 细忸…]埘照,最件同实验组 2Ac1l^秆导们^辘…l:l{i6细胞叶?的 丧: (I)I{I6细胞RA的提取:收Ixl0个转 豆川IV.iJ竹I{I6细胞尢处胛世的微{离 心符illl八IIhI.fI八蕞【仿/啦(24: I)41,l2【】【】f)r/m…离心10mil】_取l.清液,加入 【丰_开阵,一2f】存放05h.I2000f/mm. 4离心10…lii7{)%洗涤2次,I2000n'/min 4':,离心5…ini.滞I,if然风沉涟厂L』I】I(PC水 溶斛.一l1萍 (2)IfII,I=『{:I:1所iv.?l{^A为模板按u?剃 盒求盯』_AMv,rfl5x反』缓冲混flN'I'I】 ,JF游j1物25iiiii-[/fMgSO..AMVJ堕转 临nII)NA檗合兀NA水rPI;I{仪f世什 增,J眦体系如5I)I增祭什勾:48:孵奇 45nl_[1lq4{预竖性2…ii1.94Y:变?一.521逊 火【itiill_72蜒仲2…in.40个栅环址J|l721埏 仲7-rilll4Tf仔井【l,戡卒腿病毒转的I{I6细 胞为一纠照 f3)流『u胞仪分折检测^rjEA,r导的^ 琏…lI6细i胞cFiIt<1表]占:取转^tISEAI'TzJIII6 细胞.分圳J染靠24I48Ii72h96hI20hI44 hI68hJI25%肢牌化细胞I于s npRS洗潦2次.八sEAi克隆抗体(t'l守腺病 蘸硬I640怍阴别l喂f?白引麒).混J胃于 4?侏存II5阱?s的IJI{s洗涤2次,加凡? 标l的小鼠Ig}:,4f仃Ih.5%s的I—l洗涤 2次,流式细胞分析删定』土 结果 ,…^圳胞的Jl_K状怎 t镜下转淝A?I-^前,BI6圳飚梭彤.火 小一致.细胞之问紧衙稚.t层?壁:K清 晰川辨.感染腺痫+ArjSEA24h.圳胞" M:,夸…物I:转 rlf~; B监ii 婿…现细胞病设心,细胞世同.聚集成州细儿也川 块之lJJ隙变赶(罔i,2) 一l{,i—:I1 只转啦A—I—rAn0III6细胞巾,才能榆删 到EA的转录一庄第i泳啦lI1J'700I)I,到800hp 之I1r』i-J796I…生祭带:第3淋道转卒脓病 毒的BI6胞,没fi-sl^鞋n竹々(3) ,暇惊病毒介导的^牲J捌在…6细胞ilt 的 转架AII—Y;I;i^24h48h72h96hI20hI44 ll_108h后的I6绷胞,经流』?圳胞但删.细胞表 …nA仆fr24Ii后JF精仃蠢I凡鹾达 I972曙.48hl282I%.刮72h8722cA之后减 弱96h2392r/c.I20lj为27i8%144h为 9*JLI68h仍可有少许表达.阪为622%nI 以中腺病毒山川l牛副嫩肢l640卒门副麒的则没 s^的A逃 我J噬掸日曲用最广泛的复缺『崭腺悯面 拽体印导A壁….川=)itJl,lq~:{的硅治疗研究 本验剜l_Ill;ll和流』?细胞仆析,检测剥 SEAJqnl{I6紊嘶细胞i均转求盟表达情况 证 圆 叫 ; . l 囤^ 皮肤科杂志2005年6月第3鲞筮塑hi』,June,. 并能客观地对SEA于靶细胞内的表达进行定量.应 用RT—PCR检测了重组腺病毒介导的SEA基因在 Bl6细胞中的转录.在重组腺病毒介导的SEA基因 转染的B16细胞中才能检测到SEA基因的转录,转 染空腺病毒的Bl6细胞中,无SEA基因的转录.流 式细胞仪检测到重组腺病毒介导的SEA基因转染 的Bl6细胞中有SEA的表达,且表达的量与转染时 间上存在一定的关系,而转染空腺病毒的B16细胞 中没有SEA的表达.我们发现重组腺病毒导入B16 细胞后24h,SEA开始有表达,随着时间的延长,到 达72h时,表达的量达一高峰,之后逐渐下降,转染 后7d,仍能检测到SEA的表达,但表达量比较小. 肿瘤细胞往往低表达或不表达MHC—I1类分子,不 能进行有效的抗原提呈.我们将超抗原SEA基因通 过复制缺陷型腺病毒作为载体重组后导入B16黑 素瘤细胞,使B16黑素瘤细胞免疫原性增强.这样, 转染SEA基因的肿瘤细胞能表达特异的SEA抗 原,为机体免疫系统所识别,激活机体特异性免疫, 有效地活化细胞,产生抗肿瘤免疫.并且超抗原SEA 通过转染入肿瘤细胞,进一步降低SEA的不良反 应.将免疫反应局限在肿瘤局部,发挥超抗原依赖的 细胞介导的细胞毒作用(SDCC)杀伤肿瘤细胞l81, 367 可提高肿瘤治疗的靶向性,为本课题后继研究打下 基础[. 参考文献 1TonesBA,KominskyS,PerrinGQ,eta1.Superantigens:thegood, thebad,andtheugly.ExpBiolMed(May'wood),2001,226:164一 l76. 2余德厚,陆洪光,程波,等.金黄色葡萄球菌肠毒素A对B16恶性 黑素瘤细胞的杀伤作用.中华皮肤科杂志,2004,37:609. 3余德厚,陆洪光,程波,等.超抗原治疗恶性黑素瘤的实验研究进 展.国外医学皮肤性病学分册,2002,28:123—125. 4LuH,EdwardsC,GaskellS,eta1.Melanincontentanddistribution inthesurfaceeomeocytewithskinphototypes.BrJDermatol, 1996,135:263—267. 5陆洪光.黄种人与白种人正常皮肤痣和黑素瘤组织中优黑素和褐 黑素含量比较.中国皮肤性病学杂志,2000,14:149—151. 6汪宇,陆洪光,程波,等.金黄色葡萄球菌肠毒素A基因全序列的 克隆,鉴定与扩增.贵州医药,2003,27:675—679. 7汪宇,陆洪光,程波,等.金黄色葡萄球菌肠毒素A基因在 C57BL/6小鼠淋巴细胞中的表达.中华皮肤科杂志,2005,38: 297-299. 8HuangC,YuH,WangQ,eta1.Potentantitumoreffectelicitedby superantigen—linkedtumorcellstransducedwithheatshockprotein 70gene.CancerSci,2004,95:160—167. 9KrullF,HolzerU,IhleJ,eta1.Superantigen—inducedlysisof melanomacells.MelanomaRes,1997,7:214—222. 1O牟霞,陆洪光,吴承龙,等.B16小鼠皮肤恶性黑素瘤模型的建立. 中华皮肤科杂志,2004,37:613. (收稿日期:2004—05—20) 游泳池肉芽肿一例 齐焕英蔡林赵亭张建中 患者女,23岁.2003年6月右手中 指出现水疱,自行挑破后未在意,1个月 后局部出现红褐色小丘疹,逐渐增大,无 破溃史,有触痛,后右前臂屈伸侧及右肘 关节处先后出现皮下结节,渐增大.外院 诊断丹毒,慢性感染,给予头孢拉定,鱼 石脂等治疗无效.2004年2月来我院就 诊.患者以卖热带鱼为职业,发病以来精 神食欲好,大小便正常.既往无药物过敏 史,无肝炎,结核病,溃疡病,糖尿病等病 史.体检:一般情况好,各系统检查无明 显异常.皮肤科情况:右手中指可见一蚕 豆大结节,红褐色,质较韧,表面呈乳头 状.右侧滑车淋巴结蚕豆大小,活动度 好,无压痛.实验室检查:血常规正常.纯 作者单位:100044北京大学人民医院皮 肤性病科(齐焕英,蔡林,张建中);北京结核 病控制研究所(赵亭) 蛋白结核菌素试验(PPD)(++).真菌镜 检及培养均阴性.病变处取活检,将组织 块分3份分别做如下检查:?病理为表 皮增生,角化过度及角化不全;真皮内弥 漫性肉芽肿性炎症浸润,可见组织细胞, 上皮样细胞,多核巨细胞,淋巴细胞及浆 细胞.?涂片做抗酸染色阴性.?活检组 织用Bactec960(7x9液体培养基)培养 呈阳性,菌种分离鉴定:生长速度为7d: 菌落形态为光滑型;黑暗中不产生色素, 光照后可产生明显的黄色色素:对硝基 苯甲酸(PNB)(+),噻吩一2一羧酸酰肼 (TCH)(+十+),5%NaC1(一),麦康盖琼脂 (一),铁离子吸收(一);生化反应试验:耐 热触酶(+),硝酸盐还原(一),吐温80水 解试验(++),尿素酶试验(++),芳香硫酸 酯酶(++),亚硝酸盐还原试验(+++).菌 种鉴定结果为分枝杆菌?群(速生菌群) ? 病例报告? 海分枝杆菌.?和?在北京结核病控制 研究所进行.诊断:游泳池肉芽肿.治疗: 给予利福平450mg/d.乙胺丁醇750me,/ d,治疗2个月,皮疹痊愈. 讨论游泳池肉芽肿是由海分枝杆 菌(Mycobacteriummal'inum)感染导致的 皮肤和皮下组织的炎症性疾病.约占非 结核分枝杆菌non—tuberculousmycobac— terium)感染的50%,80%,已引起临床 的日益重视.本病皮疹好发于四肢易受 外伤部位如手足和四肢,也可见于面部. 皮损表现为暗红色丘疹,结节和斑块.有 时破溃,可单发,多发或沿淋巴管播散, 类似孢子丝菌病.皮损处皮温不高.诊断 主要根据病史(特别是患者的职业,业余 爱好以及创伤史),临床表现,组织病理, 细菌学检查等,确诊靠细菌学检查. (收稿13期:2004—06一l1)