3个品种猪生长激素基因的多态性分析

3个品种猪生长激素基因的多态性 3个品种猪生长激素基因的多态性分析 第23卷第3期 2005年9月 上海交通大学(农业科学版) JOURNALOFSHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITY(AGRICULTURALSCIENCE) V01.23No.3 Sep.2005 文章编号:167I一9964(2005)03-0280-04 3个品种猪生长激素基因的多态性分析 俞沛初,华修国,郭传甲2 (1.上海交通大学农业与生物学院,上海201101; 山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801) 2. 摘要:采用PCR.RFLPs技术,对香猪,上海白猪,大约克夏猪生长激素基因一119+715区域共834bp片段的扩增产物分 别用apaI,DraI,MspI3种限制性内切酶酶切位点的多态性.结果显示:ApaI酶切时,3个品种的猪都产生了3种基因 型(AA,BB和AB),BB基因型的频率以大约克夏猪最高,AB基因型的频率以香猪最高,3个猪种间基因型频率,等位基因频 率的差异不显着(P>0.05);DraI酶切时,各品种猪均未呈现酶切位点的多态性;MspI酶切时,仅大约克夏猪表现出2种 基因型(CC,CD),香猪,上海白猪未产生酶切位点多态性.结论:AB基因型的频率以香猪为最高,它可能是小型猪的有利基 因型;在香猪和上海白猪中DraI和MspI酶切位点的多态性比较贫乏. 关键词:猪;生长激素基因;聚合酶链式反应.限制性片段长度多态性 中图分类号:S814.1文献标识码:A PolymorphismAnalysisofPorcineGrowth HormoneGeneinThreePorcineBreeds YUPei—chu,HUAXiu—guo,GUOChuan-fia. (1.SchoolofAgricultureandBiology,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai201101; 2.SchoolofAnimalScienceandTechnology,ShanxiAgricultureUniversity,TaiguShan~030801,China) Abstract:ApaI,DraIandMspIpolymorphismsofa834bp(一119, +715)fragmentofporcinegrowthhormone(pGH)gene wereanalyzedbyPCR— RFLPsinXiangPig,ShanghmWhiteandLargeYorkshire.Theresultsshowedthattherewerethreegeno. types(AA,BB,AB)ineveryporcinebreedwhenthePCRproductswerecutbyapaI.BBgenotypefrequencyofLargeYorkshire washighestinthreebreedsandABgenotypefrequencyofXiangPigwashighestinthreebreeds,andthedifferenceofgenotype frequenciesandallelefrequenciesinthreebreedswasnotsignificant(P>0.05).NoDraIpolymorphismofpGHgenewasseenin theseporcinebreeds.WhenthePCRproductswerecutbyMspI,thereweretwogenotypes(CC,CD)inLargeYorkshirebreedand threewerenotpolymorphismofpGHgeneinXiangPigandShanghmWhite.Conclusion:ItispossiblethatABgenotypeisthehelpful genotypeofminiaturepigforitshighestgenotypefrequencyinXiangPig.DraIandMspIrestrictionenzymesitepolymorphismsof pGHgeaear.poorinXiangPigandShanghmWhite. Keywords:pig;pGHgene;PCR-RFLPs 猪生长激素(porcinegrowthhormone,pGH)是由猪垂体前叶中嗜酸性细胞合成和分 泌的单链多肽激 素,具有调节新陈代谢,促进生长速度的作用.1987年,Vize等…成功地克隆了pGH 基因,该基因全长为 2231bp,由5个外显子和4个内含子构成.Yerle等用高分辨G带染色体原位杂交将 pGH基因定位于 12号染色体的P一P区域上.近年来,国内外学者已经对pGH基因的结构做了大量基础性研究,但 收稿日期:2005.O卜13 基金项目:上海交通大学农科合作研究基金(AE150042) 作者简介:俞沛初(1962.),男.上海人,副教授,博士,研究方向:猪遗传育种及营养 第3期俞沛初,等:3个品种猪生长激素基因的多态性分析281 pGH基因研究的主要工作目前仍集中在多态位点的寻找,且研究区域主要集中在5端至外显子3起始处D, 所研究的猪种也不多.本实验采用PCR—RFLPs技术检测香猪,上海白猪,大约克夏猪三个猪种pGH基因的 多态性,以寻找我国小型猪种,培育猪种和国外引人猪种生长激素基因座位的差异性,为今后研究我国小型 猪种和培育猪种的基因特征与生产性能的关系提供依据. 1材料与方法 1.1实验材料 上海市闵行区畜禽种场上海交通大学农业与生物学院小型猪繁育场的香猪18头, 的上海白猪和大 约克夏猪各15头.取耳组织样品于干净小瓶中,置一70~C冰箱备用. 1.2试验方法 1.2.1基因组DNA的提取将30mg剪碎的耳组织置1.5ml离心管中,加人0.5ml抽提缓冲液及32l 浓度为2mg?ml的蛋白酶K,置55~C水浴消化过夜.加161xlRNaseA后置37?水浴1h,离心5min并取 上清液.用等体积饱和酚及等体积氯仿各抽提2次,二倍体积无水乙醇沉淀DNA(一70~C20min),用80% 乙醇洗涤DNA,冻干机冻干,加80lTE溶解(55~C),一20~C保存备用. 1.2.2引物及PCR反应参照GenBank中公布的pGH基因序列(M17704),用Stanford大学的引物 软件设计引物,上游引物:5一1TrATccA1TrAGcAcATGccTGcc一3;下游引物:5一TAccTcTGTcc. CTCCGGGATGTA一3.引物由上海捷倍思基因公司合成. PCR反应体系:10xPCRBuffer5.0pA,25mmol?L—MgC123.0pA,10mmol?L,dNTP1.0l,上游引 物(201xmol?L)和下游引物(201xmol?L)各1.0pA,TaqDNApolymerase(3U?l)0.51xl,DNA (50ng?l)3.0l,加水至50.0pA.PCR反应条件:94~C预变性4min;94~C变性50s,67~C退火50s,72~C 延伸70s,共30个循环;72?延伸10min.取PCR产物81xl进行琼脂糖凝胶电泳,并在Tanon计算机凝胶 成像系统上观察扩增效果和照相. 1.2.3酶切反应ApaI和DraI反应体系:PCR产物12.5Ixl,Buffer2.51xl,BSA2.51xl,ApaI(或DraI) 0.81xl,加水至25p~1.MspI反应体系:PCR产物12.51xl,Buffer2.51xl,Msp10.81xl,加水至25l.ApaI,Dra I和MspI酶切反应条件均为37?,3.5h.取酶切产物121xl进行琼脂糖凝胶电泳,并在Tanon计算机凝胶 成像系统上观察,照相. 1.2.4统计分析不同品种猪酶切突变位点的基因型频率和等位基因频率的差异,使用SPSS11.5计 算软件进行x检验. 2结果与分析 2.1酶切产物的电泳结果 对各样品pGH基因的一119至+715 区域共834bp片段的扩增产物用ApaI内 切酶酶切后,在3个品种的猪中均检测到 一 处酶切突变位点,从而构成A(449bp, 283bp,102bp)和B(316bp,283bp,133bp, 102bp)2个等位基因,产生了AA,BB,AB 3种基因型(见图1).经测序发现,等位基 因A是由位于第1内含子的+295位处的 酶切位点缺失所造成,导致切点缺失的原 因是+295位上发生了G—A突变. 449 珏3 133 l02 l2345 图1猪生长激素基因舾I酶切图 Fig.1ThePCR—RFLPspatterninthesequenceofpGHgenewithApaIdisestion (M:DNAmarker;,2.5:AAgenotype;1,3:BBgenotype;4:ABgenotype~ ?????? 伯752 282上海交通大学(农业科学版)第23卷 将各样品的pGH基因的扩增产物用 DraI内切酶酶切后,在仅有的一个DraI 酶切位点上未见突变情况,在香猪,上海 白猪,大约克夏猪3个猪种中均未检测到 多态性(见图2). 对各样品pGH基因的扩增产物用 MspI内切酶酶切后,结果显示:在扩增的 pGH基因片段中有一个多态位点,但仅发 现在大约克夏猪品种中出现这个酶切位 点的多态性,在香猪,上海白猪品种中未 出现.在大约克夏猪中由于这一酶切突变 位点,造成了CC(373bp,172bp,137bp)和 CD(373bp,274bp,172bp,137bp)2种基因 型(见图3).经测序并对照公布的序列 (M17704)后得知,3个猪种pGH基因第2 内含子中+563位均发生了T—c突变, 从而增加了一个MspI酶切识别序列,产 生了等位基因C;而部分大约克夏猪的等 位基因D则是由于在该位点未发生突变, 274bp的碱基片段未被等分为两个172bp 的片段之结果. 2.2多态位点的基因型频率和等位基 因频率 对香猪,上海白猪,大约克夏猪3个 5o0 334 V'23456 图2猪生长激素基因DraI酶切图 Fig.2ThePCR—RFLPspatteminthesequenceofpGHgenewithDraIdigestion (M:DNAmarker;,1.2:LargeYorkshire;3,4:ShanghaiWhite;5,6:XiangPig) U'2345 图3猪生长激素基因MspI酶切图 Fig.3ThePCR-RFLPspatterninthesequenceofpGHgenewithMspIdigestion (M:DNAmarker;,1,2,3,5:CCgenotype;4:CDgenotype) 猪种却aI多态位点的基因型频率和等位基因频率的统计结果见表1.由表1可见,AB基因型的频率以香 猪最高,大约克夏猪最低,BB基因型的频率则以香猪为最低,AA基因型的频率在各猪种间较一致;等位 基因A的频率以香猪最高.经x.检验,各品种间基因型频率和等位基因频率的差异不显着(P>0.05). 表1apaI多态位点的基因型频率和等位基因频率 — Table1Ge — notypefrequen — cie — sandallele~equenciesofpGHgene,vitllapaIdigestion Note:Thefigureinthebracketmeansthenumberofdifferentgenotypiepigs. 由香猪和上海白猪的个体所扩增的pGH基因片段中未见MspI酶切位点的多态性,而大约克夏猪则 呈现多态性,所构成的CC和CD2种基因型的频率依次为46.7%和53.3%等位基因C,D的频率分别为 73.3%,26.7%. 3讨论 3.1不同猪种pGH基因ApaI酶切位点的多态性 第3期俞沛初,等:3个品种猪生长激素基因的多态性分析283 本实验所扩增的834bp覆盖了pGH基因5端调控区至外显子3起始区,包括完整的第一和第二外显 子,第一和第二内含子,5端调控区,涉及到绝大部分学者对pGH基因所研究的片段.实验中,用ApaI对 扩增片段进行酶切后在3个猪种中均呈现多态性,其中,BB基因型的频率以大约克夏猪最高(46.7%), 香猪最低(22.2%);而AB基因型的频率以香猪最高(55.6%).这些趋势预示着BB基因型可能会更多地 出现在大体型猪种中;AB基因型则可能更多地出现在小型猪种中,可能与小型猪表现其生长慢和矮小特 性有关,有待今后进一步分析不同基因型对血中pGH的基础值和生长速度的作用效应.本研究结果与宋 成义等?的研究结果相一致,他们在对姜曲海猪pGH基因进行ApaI酶切后发现了+295一十300的酶切 多态位点,且BB基因型个体的20日龄体重,45日龄体重略高于AA和AB基因型个体,BB基因型个体的 70日龄体重和0—70日龄日增重都极显着高于AA和AB基因型个体.邢晋棉等?1在分析大约克夏猪和 长白猪GH基因的ApaI酶切位点多态性时,也检i见0到了+295一十300的酶切多态位点,并认为等位基因 C可能是该酶切位点的切点缺失产生的. 3.2不同猪种pGH基因DraI酶切位点的多态性 Soren【5首次在丹麦4个猪种中用限制性内切酶DraI和pGH探针进行分析,发现在+216位存在一 个DraI多态位点,其品种间等位基因频率有显着差异.接着,Nielsont引对上述4个猪种和另外2个瑞典 猪种进行RFLPs检测,发现并证实了该DraI多态位点.本试验中对香猪,上海白猪,大约克夏猪3个种群 的pGH基因用DraI酶切后,在酶切位点上未见突变情况,有待今后进一步检测和证实. 3.3不同猪种pGH基因MspI酶切位点的多态性 用MspI内切酶对3个猪种pGH基因PCR扩增产物进行酶切后,在香猪,上海白猪中未发现多态性, 只是在大约克夏猪中发现由+563位处酶切位点产生的多态性,表现出cc和CD2种基因型.本试验中 大约克夏猪存在MspI酶切位点多态性之结果与Kirkpattickt对大约克夏公猪的检测结果一致,他在对 pGH基因+206一十711片段扩增,酶切后检测到了MspI多态位点;也与PierzcahalaI.1对欧洲猪种的检i见0 结果一致,他检测到了欧洲猪种pGH基因的MspI多态位点,并分析了不同基因型与生产性能的关系.宋 成义等?在我国地方猪种(姜曲海猪)中也检测到+563一十566位的酶切多态位点,而两种基因型个体的 生产性能没有差异.本试验未在香猪(我国地方猪种)和上海白猪(我国培育猪种)两个猪种中检测到该位 点的多态性,提示我们应进一步对我国其它猪种开展研究与比较. 参考文献 [1】VizePD,WellsJRE.Isolationandcharacterizationofporcinegrowthhormonegene[J】.Genetics,1987,55:339.344. 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