高效液相色谱法测定氯硝安定血脑浓度

高效液相色谱法测定氯硝安定血脑浓度 ?a18 北柬医科大学 JOURNALOFBEIJINGMEDICALUNIVERSITYVo1.26No.4199d -jlc} R卵f.( t 高教;丧棚老,甜吁 高效液相色谱法测定氯硝安定血脑浓度 北京医辩大学第一医院儿科研究室王丽JEdgePDWalson 氯硝安定(CIonazepam,CZP)是效力最强的一 种苯=氨革类抗痫新药.由于牺床应用时『?1短,且体 内含量甚微,因而血浓度测定方法建立较晚.国内尚 未建立CZP血浓度潮定方煞本文应用高教液相色谱 皓加以改进,使之更趋完善,更适合临床应用. 方法 一 ,铡定原理,用氟硝安定(Fiunitrazepam, FZP)为内标准的异丙醚基冲液(pH9.5)提取血浆 中的CZP,将提取浪蒸干后甩流动相重组进行色谱分 析,在紫外检测器波长313[Jm检测含量. =,实验方法: (一)试剂与配制. 1.标准品,氨硝安定(CZP),氟硝安定(vzP) 匈为Hoffman—LaRoche公司赠. 2.乙睛,色谱绳. 3.1mol/L廿氨酸氢氧化钠缓冲液:将1mol/L 甘氨酸750ml,加入1mol/L氢氧化钠250ml,混 合.调pH至9.5,室温下可保存6个月 .6.1mol/L乙酸盐缓脉液68g乙酸钠溶于 00mI击离子水中,再加2.0ml冰醋酸(色谱纯), 调pH至.7,室温下保存6个月. 6.流动相.乙睛820m1,加入680mI6.imol/L pH4.7的乙酸盐缓冲液,混匀,封好.用前脱气,宣 温下保持稳定. 6.冲洗/储存液I乙猜320ml,加680ml击离子 水,封好,宣温下保持稳定. (=)实验配液z 1.CZP标准诸存液(1mg/mI).准确称取CZP 10mg,盐人10皿】容量瓶,用甲醇(色谱纯)混句, I冰箱可保存2个月 2.CZP标准中间液(1O~g/m1),准确量取100 IlICZP储存液董l0m1容量瓶中,甩甲醇(色谱纯)稀 释,混白,置|?冰箱可保存1个月. 3.CZP标准工作液(1~g/m1):准确吸取1.Om CZP中问液至10ml容量瓶,用甲醇溶至翔度,混合. 置4?冰箱可保存一个月. 4.FZP内标储存渡(Img/mI);准确称取FZP 10mg,放人IOmI容量瓿中,用异丙醇(色谱纯)溶 至刻度,混匀,储于4?冰箱可保存2个月. 5.FZP内标中闻披(10IEg/m)准确量取100 1内标储存液至1Om1容量瓶中,用异丙醇藩至翊成, 混句,4.C礅籍可保存一个月 6.FZP内标工作液(1p.g/mI).准确量取1.0 mIFZP内标中问液至10mI容量瓶中,用异丙醇稀释 至刻度,混匀,4?冰箱可保存一个月. 7.空白血请-儿童医院血库供应健康无药^血 清 8.质控血清zUtakLaboratories公司购人. (三)仪器: 1.高效液相色谱倪,Waters,美国.包括紫外 检测器(ModeI440A),溶剂传进系统(Model6000 A),自动遗样器(wisP)及积分记录便(Mode, 4270). 2.其他仪器有微量进样器,微量吸管,磨口带 塞试管,旄转震荡器,超声波发生器,包括恒温水i挣 的蒸干器及氮气钢瓶 (四)色谱分析条件分析柱为不锈钢色谱柱,内' 径4.6cm,鞋长15cm,填充料为十八烷基硅烷5. 流动相流速为2.6mI/min,柱压为130kg/cm.捡漕 器波长为313nm,记录纸速为0.5cm/min.潞量程 暖光度为0.01A. (五)撮作步骤取带塞玻璃试管10支,分别船 人标准CZP应用披0,10,20,O,6O,80,lO0 2OOng/ml标本血清爰质控血清前8支试管在通风 橱内蒸干后,加入1mI空白血清.后2支准确加入 披捌血清和质控血清lm1.各管均加入FZP内标1亡 作液各100pI,再分别加入1mol/L甘氯酸氢氧化锵 缓冲液2mI,异丙醚3ml.置入旋转震荡器震荡2o 分钟,离心(3000r/rain)30分钟用尖暖管尽置 将上层醚相移人另外相应干净试管,在4O?水格内 Nt燕于,密封置4冰箱可保存一周.用100流曲 ?美国俄衰掘卅立大学几童医院拓床药理毒理科. 相重淳样本后,对号放人自动进样器中,依敬自动进 样60pI进行色谱分析. (六)计算根据药物及内标的峰高(峰面积)计 算峰高比.以血清标准应用液的峰高比为纵坐标,以 回归方程计算出CZP含量(ngim1). 结果 一 ,色谱图形如图t 宙CZP色请鼬 FZP. l—CZP,2-- 二,血清标准应用液的线性关系甚好,在5~200 ng/m1范围,实值与涮值浓度之同的相关系数大于 0.9990. 三,重复性l在25,50,100ngiml3种浓度, 日内差异(—to)分踟为25-~1,50--4"--2,97.-E4ng/ m1.日问差异(=to)分别为26----4"2,5o?3,98士 其变异系数均<10. 四,回收率:7种浓度的CZP回收率如表. 表CZP回收率结果 旅度 (?g/m1) M+S () lO 20 50 '0 80 10D 2o0 99十2 1D3+9 99+2 9十5 99+3 1O2+4 z0D+3 _均;l0. 五,最小检测限以峰高大于3倍噪声值相当瞻 t为最小捡测量;5),即为5ng/ml 六,稳定性,将CZP样本分g置于室温,4oC, 一 20?及一70?下像存,每周一改,监测1O周.除宣 温下,一周后裱度变化较大外.其余浓度均无明显韭 化. 讨论 HPLC方法具有精密,准确,特异,撖置,快速等 优点,还具有同一样本可同时监羽l数种药物爰其代酣 物的优点.是目前临床治疗药物监谢(TDM)工作中 的理想方法.本文根据Petters方法进行如下修改t用 异丙醚作提取液更理想,CZP提取更纯,回收率高} 泷动楣作较大改进,用乙腈:乙酸盐(s2:6B'使药物 与内标保留时间缩短且分离良好}紫外检验器313lilt, 取ft原254IlllNI,更为灵敏f另外在仪器厦预处理,测 定程序中也有些改动.经修正后的HPLC方法更适用 于临床. 应用本文方法,还可进一步测定CZP脑浓度. 拄齄组织1g加生理盐水至10mJ,匀浆器匀60秒, 离心(2OO0g)30分钟,取上请液1ml俄脑样本. 与血浓度测定程序相同.CZP脑与血浓度标准曲线相 关甚好(r=0.9997). CZP有效浓度为20~g0ngiml.有^报道lCZP 血浓度与疗效美系不大,甚至无相关.但却均来挂明 准确的采血时同.经本方法临床应用后发现,CZP口 服后2,3小时达峰浓度,开始吸收与分布相很快,紧 随有一个较长而明显的消除相.如采血时间是在服药 后1,4小时内,则相同剂量所致的血浓度差尝达100 倍之多.这点临床上必疆引起重视.限定于消除相采 血方有临床意义. 另外,CZP的所有容器必须是玻璃崩晶,周它晶 与塑科发生化学反应.对于脑样浓度结果,莆乘10c' 换算成.gig脑组织的浓度单位.对稀释过的标本,耍 按稀释倍数予以相应校正. (1992一oa-27段稿) ,