代谢综合征

一、代谢组学在中药研发中的应用 上个世纪90年代末期, 代谢组学(metabonomics)逐渐兴起, 由于代谢物的复杂性, 很难用一种手段将所有代谢物一次检测清楚, 因此部分学者根据代谢物的特异性对其进行分类研究, 从而形成了一系列分支研究, 如脂质组学及毒素组学等, 作为最重要的代谢组学分支, 脂质组学是研究的焦点。为保证中药产品安全、有效、稳定、可控，代谢组学在中药研发中有以下应用。 1 中药质量研究  道地药材判别 2 中药药效研究 中药作用机制研究 发现新的生物活性物质 3 中药安全性研究 中药配伍减毒机理研究 中药安全性评价研究 二、脂质组学在医药研究中的应用 类脂分子有以下重要作用： 1 通过形成脂双层使细胞具有完整性和独立性 2 为膜蛋白功能的实现和相互作用提供合适的疏水环境 3 通过多种酶的作用，参与信号转导 脂质不仅是生物膜的骨架成分和能量贮存物质, 越来越多的证据表明, 脂质也参与细胞的许多重要功能。 Han等于2003年正式提出了脂质组学(lipidomics)的概念——从系统水平上研究生物体内的脂质, 揭示其相互作用及与其他生物分子的作用, 从而兴起了研究脂代谢调控在各种生命现象中作用机制的新学科。近年来脂质组学引起了世界范围关注, 被广泛应用于生命科学, 尤其是医药研究等领域中。 脂质组学是对整体脂质进行系统的一门新兴学科, 通过比较不同生理状态下脂代谢网络的变化, 进而识别代谢调控中关键的脂生物标志物, 最终揭示脂质在各种生命活动中的作用机制。电喷雾电离-质谱技术是脂质组学领域中最核心的研究手段, 目前已能对各种脂质尤其是磷脂进行高分辨率、高灵敏度、高通量的分析。随着质谱技术的进步, 脂质组学在疾病脂生物标志物的识别、疾病诊断、药物靶点及先导化合物的发现和药物作用机制的研究等方面已展现出广泛的应用前景。 三、脂质组学优势探讨 中药是多成分的复杂体系，人体是更复杂的生命系统，这就决定了中药的药效和作用机制具有复杂的非线性特征，表现出多成分、多层次、多靶点、多代谢途径的特点。因此，采用经典的药理学去研究中药的作用机制，存在着一定的理论差距和现实的技术瓶颈。中药成功的治疗疾病必须使代谢网络中的缺陷部分正常化，同时不得干扰其他维持健康所必须的代谢途径调控。脂质组学研究脂质指纹图谱，不仅研究药物本身的代谢变化，而主要是研究药物引起的内源性脂质的变化，更直接反映体内生物化学过程和状态的变化。通过认识脂质指纹图谱变化的原因，阐明药物作用靶点或受体。 结合这篇文章来说明脂质组学在中药研究中的应用。 背景：目前对代谢综合征中脂质复杂变化的结果和原因只有部分被理解。几个相互关联的过程不断恶化，这意味着多靶向通路可能比基于有限数量的替代标记策略更有效。中药制剂系统流传下来的类似代谢综合征临床特点的可能有助于开发代谢综合征新的干预机制。可用系统生物学和特定的动物模型的研究来进行评估。本文报告了由sub885c干预APOE * 3leiden.CETP小鼠血浆和肝脏脂质沉积的结果。sub885c根据中药治疗代谢综合征的原则制备。1型大麻素受体拮抗剂利莫那班是一个控制体重和代谢反应的通用药物。 方法/主要调查结果：APOE * 3leiden.cetp轻度高胆固醇血症小鼠随机分为sub885c，利莫那班和不给药的对照组。sub885c对体重没有影响，但显著降低血浆胆固醇（249%，P<0.001），CETP水平（231%，P<0.001），CETP活性（274%，P<0.001）和增加高密度脂蛋白胆固醇含量（39%，P<0.05）。sub885c对脂类组学中的类胆固醇酯和甘油三酯影响最大。利莫那班能减少体重（29%，P<0.05），但对血脂只有一个温和的改善。在体外，sub885c提取物对3T3-L1细胞中的脂肪水解产生刺激作用，对脂肪生成产生抑制作用。 结论：sub885c是一个多组分制剂，能对APOE * 3leiden.cetp小鼠产生与已知疗效的药物化合物（如利莫那班，阿托伐他汀，烟酸）相似的血脂抗动脉粥样硬化变化，本研究成功地说明脂质组学对病症干预效果产生的作用，可以帮助寻找治疗与生活方式相关的代谢异常的新的目标或成分。 代谢综合征： 代谢综合征(metabolic syndrome,MS)是一组代谢紊乱性疾病的总称,是以中心性肥胖、胰岛素抵抗、高血压、高三酰甘油血症、低高密度脂蛋白胆固醇(HDL- C)、糖耐量下降或Ⅱ型糖尿病为主要临床表现的一个症候群。MS患者一般同时表现出多重心血管危险因素。随着社会经济和生活方式的改变, MS的患病率逐年上升。MS已成为一种新的慢性病和公共卫生问题[1～3]。虽然临床上对MS早有认识,但有许多问题尚未解决。 MS为多重危险因素聚集所致,综合干预为其主要防治手段。 聚合药片（Polypill）可降低心血管疾病风险。聚合食谱作为一种不使用药物的安全、廉价、美味的疗法，有望取代“聚合药片”。从中药等其他医疗保健系统获得膳食预防或干预的新见解。 对APOE * 3leiden CETP转基因小鼠给予中药制剂sub885c后，其血浆和肝脏脂质沉积产生的影响进行分析。 sub885c是根据中药组方原理制得的含有八种天然成分的多组分制剂。其核心处方是中国用于治疗代谢综合征和早期2型糖尿病与肥胖的药物。据报道，与对照组相比，在糖尿病前期对APOE * 3leiden CETP小鼠的干预研究表明sub885c能显著提高胰岛素的敏感性。同时，sub885c对其他抗炎活性成分代谢的影响已有报道。因此，我们推测，sub885c对脂质代谢和胰岛素敏感性发挥多靶向作用。 为了研究这个问题，用有轻度高胆固醇血症和肥胖的雌性APOE*3leiden CETP转基因小鼠一个平行对照的干预研实验。 APOE * 3leiden.cetp小鼠模型是通过杂交获得的APOE * 3leiden小鼠，小鼠能表达人类CETP。它可以产生类似人类的降脂和对高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）提高干预的反应。 结果参数包括体重，食物的摄入量，血浆脂质、脂蛋白及血浆和肝脏脂质沉积。 大麻素1型受体（CB1）拮抗剂利莫那班作为研究中评估控制体重和代谢反应的一般药物。本文进一步探索了3T3-L1脂肪细胞的脂肪形成和脂肪水解。 与化学试剂 sub885c由八中天然成分（山楂，荷叶，罗布麻叶，玫瑰花，大黄，芒硝，海藻，甘草）的干燥切片的水提物组成。将其干燥成固体，作为制剂的干预研究。 对小鼠的干预研究 24只ApoE*3Leiden.CETP转基因小鼠（6–10周龄） 动物给予为期四周的半合成的改性西式食物，其中含0.2%的胆固醇，15%的饱和脂肪和40%的蔗糖。形成轻度高胆固醇血症和体重增加的动物模型。在此期间，按照小鼠体重与血浆甘油三酯（TG）水平（禁食4小时后），分为三组，每组八只动物（对照组，利莫那班和sub885c组）。剂量均为10毫克/公斤/天，且每组均添加调味方糖。每只老鼠的体重和食物摄入量在第0，2，3，4，9，11，14，21，28天分别测定。多路径效应评价脂类组学搜集血样从第0周到4周通过CB 300 LH microvettes进行尾静脉取血获得。血浆样品收集的血液样本在6000转4℃时离心10分钟。在干预结束时（4周），动物迅速采用CO2的窒息。冰上进行肝脏解剖获得样本称重后快速冷冻在液氮中。血浆和肝脏样本均存储在-80℃备用。 脂肪细胞的研究 采用3T3-L1前脂肪细胞株（ATCC）进行研究，3T3-L1细胞经培养及分化成为成熟的脂肪细胞。4毫升甲醇提取物中可获得300μg的sub885c。甲醇提取液蒸发后，使其溶解在100ml二甲基亚砜中。为了研究脂肪水解，生长培养基除去后每孔用1毫升HBSS冲洗两次。然后，每孔加入250mlHBSS，其中含有2%的BSA和2.5μl用DMSO稀释的sub885c提取物。在2.5ml二甲基亚砜中加入1mM异丙肾上腺素作为阳性对照。加入2.5ml二甲基亚砜或不加任何药液作为阴性对照。孵育3小时后释放的甘油用一个商业脂肪水解测定试剂盒测定。对于添加sub885c的脂肪转化分析在细胞分化时开始。sub885c提取液与分化培养基一样，采用不同的稀释度。介质置换均需添加新鲜的提取物。经过九天的分化，对细胞转化为脂肪的量进行测量。 血浆生化分析和脂蛋白分析 等离子体胆碱，TG，HDL-C，脂蛋白，CETP水平与丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性在第0周和4周测定。血浆总胆固醇（TC）和甘油三酯浓度均采用酶法试剂盒测定。用快速高效液相色谱法测定混合脂蛋白。用新鲜的样品测定TC，TG和磷脂含量。使用磷酸脂B试剂盒测定磷脂。载脂蛋白沉淀后用血浆中HDL-C定量测定血浆高密度脂蛋白。因此，10μl肝素和10μl0.2mol/LMnCl2加到20μl血浆中，混合物孵育20分钟，在室温下在13000克转速4℃下离心15分钟。混合样品使用Boehringer测定血浆ALT。3H-胆固醇在24小时4℃平衡后的血浆胆固醇在3小时。随后37uc孵育，含有apoB脂蛋白的肝素/ MnCl2除了沉淀。从脂肪中的沉淀物和标记的胆甾醇酯标记的未酯化的胆固醇对硅胶柱，用液体闪烁计数法分离提取。 脂类组学分析 对血浆脂质提取 血浆样品解冻至室温并用 CH2Cl2/MeOH 2:1提取。取30μl含有肝素钠的血浆置于2ml小瓶中。首先添加30μl加了内标（IS）组成的混合物（lpc-19:0，pe-30:0，pc-38:0和tg-45:0相应浓度分别为30，30，150和60μg/ml)，其次依次加入190μl甲醇和380μl二氯甲烷。混合前后进行彻底的涡旋。再次加入120μl涡旋。6000克转速10℃离心10分钟，取300μl转移到一个新的自动采样瓶中并存储在-20℃备用。进行LC-MS分析，取脂质提取物25μl，用475μl乙腈/ IPA /水65:30:5（V / V / V）稀释，取10μl进样。 肝脂质提取样本 冷冻肝样品存放在-80℃冻干并磨成粉。称取十毫克的肝粉置于干净的1.5 mlEP管中以便于随后进行的脂质提取。肝脂质提取用CH2Cl2/MeOH混合物（2:1，V／V）进行液-液萃取（LLE）实现。最终的萃取液稀释40倍,取10μl进行LC-MS分析。 LC-MS脂质分析 LC-MS的分析是一个混合的液相色谱分析的线性离子阱傅立叶变换离子回旋共振质谱系统。使用这种方法，七种不同的脂质类，包括极性脂质如溶血磷脂酰胆碱（LPC），溶血磷酸乙醇胺（LPE），磷脂酰胆碱（PC），磷酸乙醇胺（PE），鞘磷脂（SPM）和非极性脂质如胆固醇酯（CHES）和TG从柱离子电喷雾电离正离子模式洗脱。MS检测是在全扫描模式进行一系列的质荷比（M / Z）400–1500。血浆和肝脏样本分别进行检测。 脂类组学数据处理 结果 sub885c不影响APOE * 3leiden.cetp小鼠的食物摄入量和体重 与对照组相比，在前20天sub885c没有对载脂蛋白E * 3leiden.cetp小鼠的食物摄入量产生影响，没有影响平均体重，21天之后，sub885c组小鼠食物摄入量增加。给予利莫那班的小鼠在前2天表现出食物的摄入量减少趋势。平均体重显著减少。图1。 sub885c降低血浆胆固醇，甘油三酯和增加HDL-C的含量 与对照组相比，4周后sub885c治疗组小鼠血浆中胆碱含量显著下降（P<0.01）图2A。在为期4周的干预期间，sub885c治疗组和对照组血浆TG水平分别降低67%（P<0.01）和46%（P<0.01）。4周时，sub885c组TG水平往往是低于对照小鼠（图2A），但这种差异并未达到显著（P = 0.06）。与对照组相比，sub885c组血浆HDL-C显著增加39%（P<0.05）。脂蛋白组分的分析表明，与对照组相比，sub885c治疗引起极低密度脂蛋白减少3倍，甘油三酯和极低密度脂蛋白磷脂减少2.5倍（2 B–D图）。载脂蛋白E * 3leiden.cetp小鼠，血浆TC随着低密度脂蛋白胆固醇的降低而降低；而血浆HDL-C随着HDL-C含量的增加而明显增加。与对照组相比，利莫那班治疗组小鼠血浆胆碱显著降低（P<0.05）。然而，血浆甘油三酯和HDL-C到干预结束时都没有显著的变化。三组小鼠均无不良体征且ALT水平也在参考范围。 sub885c降低血浆CETP水平和活性 与对照组相比，sub885c干预组（图2A）APOE * 3-leiden.cetp小鼠CETP水平和活性分别显著降低31%（P<0.001）和74% (P<0.001）。然而，利莫那班没有显著影响在相同的实验条件下CETP的水平或CETP活性。 脂类组学揭示了sub885c产生的脂质变化 选取血浆和肝脏脂质沉积中两个主成分，这两个主成分含量分别为67%和57（图3A，B）。在PCA双标图表明了对照组和sub885c组小鼠两组间血浆和肝脏脂质的主要变化。 结果发现，86（61%）22（16%）的血浆和肝脏脂质的140和137分别sub885c干预4周血脂水平与对照组相比显着改变后。在sub885c干预下血浆和肝中15种血脂变化明显（表S2和S3）。相关分析表明，数据与正态分布的皮尔森和未经Spearman，是来评估这些脂质在血浆和肝脏中的浓度有关系。只有TG-O（50:0）显示其血浆和肝脏浓度呈正相关关系；其他无明显相关性。 MTC分析后，三组显着改变的肝脂质和68的70（97%）显着改变血脂下调sub885c处理。 sub885c能刺激脂肪分解和抑制体外脂肪生成 探讨sub885c对3T3-L1脂肪细胞的水解作用，用sub885c孵育后测定介质释放的甘油。阳性对照异丙肾上腺素，是已知的能引起Tg水解增加，刺激3T3-L1脂肪细胞水解的一种非选择性的β-肾上腺素能受体激动剂，（图4a）。稀释500倍后，与20μM异丙肾上腺素对照组相比，sub885c提取物引起的甘油的释放高出22%。当sub885c提取物稀释2500倍后，甘油释放低于20μM的异丙肾上腺素达到20%，但仍高于DMSO和空白组。作为阳性对照的细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α），它会干扰脂肪细胞的分化。研究发现sub885c存在剂量依赖性地抑制体外培养的脂肪细胞（图4b）。其他的稀释液没有明显表现出对细胞形态的影响。TNF-α，作为对照，并没有显示出任何对核数和密集的细胞层的影响。 讨论 本研究表明，基于对代谢组学的多组分制剂的分析可以用来研究潜在的目标或新成分。 在以前的研究中发现sub885c通过提高胰岛素的敏感性而控制前期糖尿病，APOE * 3leiden老鼠喂食高脂肪的饮食10周造成APOE * 3leiden.cetp小鼠模型，该模型可以降低血脂和增加HDL-C 显示它的干预作用。 在本研究中，sub885c显示了多个效应来改善脂质代谢，并总结在图5。具体地说，sub885c治疗诱导血浆高密度脂蛋白胆固醇增加，同时伴随着低密度脂蛋白水平的减少。产生的作用通常被视为抗动脉粥样硬化。高密度脂蛋白代谢的重要调节器，CETP的水平和活性降低可能与三酰甘油水平降低有关。综上，sub885c对HDL-C的影响可能是由于：1）降低CETP活性和CETP水平；2）降低LDL水平；3）提高胰岛素的敏感性。sub885c显著降低血浆TC，这可能反映了减少（V）治疗小鼠sub885c LDL-C浓度。 sub885c的影响可能更多的是与血浆脂蛋白代谢。sub885c证实（不是利莫那班）显著降低3leiden.cetp APOE *CETP小鼠CETP的水平和活性（图2A）。 在表2中，sub885c与一些有效药物相比（即利莫那班，阿托伐他汀，托塞曲匹，烟酸和替格列扎）均可用于调节血脂水平。由于不同的药物有不同的设计，没法对它们进行详细的比较，但与这些药物引起的副作用比较，如精神异常（利莫那班），严重的潮红（烟酸），头痛（阿托伐他汀），心血管疾病的发病率和死亡率增加的风险（托塞曲匹），，肾小球滤过率升高的血清肌酐和相关的减少（替格列扎）；而与sub885c相关报告的副作用稀少。只有药材含蒽醌类（即大黄素大黄酚）的报道引起腹泻。因此，sub885c可能比其他的治疗措施有更高的效益风险。 与利莫那班相反，sub885c在4周的干预期间没有减轻小鼠体重或食物摄入量。利莫那班是CB1受体反向激动剂，已被开发并上市用于改善代谢综合征的症状。不久后，由于其副作用如抑郁症和其他精神异常在欧洲被撤回。结合研究使用的细胞膜的制备表达人类的大麻素CB1受体，sub885c总提取物能够取代绑定放射性配体3h-cp55940（数据未显示）。这可能表明一个或一个以上的混合物中化合物对CB1受体有亲和力。然而，需要更多的数据来证实这。 在体外实验结果显示，sub885c能够刺激脂解和抑制3T3-L1脂肪细胞分化。在这个阶段，很难猜测可能的机制及其在整体的相关性，因为有几个化合物可能产生这样的效果，但不限于CB1受体阻滞剂。 需要进一步的研究来揭示sub885c调制的途径和过程。单个sub885c活性成分例如，山楂（山楂浆果提取物）可用于心血管问题并且已被报道具有抗炎的特性和调节线粒体功能。玫瑰花提取物已被报道可增加抗氧化酶活性，降低脂质过氧化作用。大黄，甘草已被报道可抑制脂肪酸合酶，从而有助于减肥。大黄中大黄素被称为11 β抑制剂羟类固醇脱氢酶1型，可改善用饮食诱导的肥胖小鼠代谢紊乱。这种酶是现在是代谢综合征的药理目标之一。 总之，我们的研究表明，一个基于中药组方原则制得的多组分的制剂是能够对APOE * 3leiden.cetp模型小鼠的血脂产生抗动脉粥样硬化的变化。这些结果可用于开发新制剂，预防代谢综合征或改善其首发症状。