骨髓间充质干细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症试验的初步报告

骨髓间充质干细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症试验的初步报告 骨髓间充质干细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症试验的 初步报告 北京大学 博士学位论文 骨髓间充质干细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症试验的初步报告 姓名:王丽平 申请学位级别:博士 专业:神经病学 指导教师:王荫华;樊东升 20050301 北京大学博士学位论文 骨髓间充质干细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症试验的初步报告 中文摘要 本研究采用病例对照 对于符合世界神经病学联盟的 El Escorial 1998 诊断中 确诊 级别和 很可能 级别的散发性肌萎缩侧索硬化 ALS 患者 进 行自体骨髓间充质干细胞 MSCs 移植的试验性治疗 通过与两组 非特殊治 疗对 照组1和力如太治疗对照组 同样诊断级别的ALS患者对照 包括全面体格检 查 试验室检查 主观症状的变化 APPEL评分 ALS FRS评分 ALS/HSS评分和 Zung 抑郁量表评分的 完成MSCs移植治疗ALS的安全性与有效性的初步报告 目的 探讨自体骨髓间充质干细胞移植治疗散发性ALS的安全性与有效性 方法 试验组 35例患者分别进行骨髓穿刺 对骨髓间充质干细胞进行分离 6 提取 培养 鉴定 收集 21 28天后通过腰椎穿刺将总量为 3 10 个 以 0.9 的生理盐水定容为 5ml的MSCs注入蛛网膜下腔 试验组在治疗前 治疗后1周 2 个月进行一般情况 APPEL评分 ALS FRS评分 ALS/HSS评分和Zung抑郁量表的 记录 对照组1非特殊治疗组进行间隔时间为2个月的两次APPEL评分 对照组2 力如太组 记录开始服用力如太 100mg/天及服用两个月后的 ALS FRS评分 使 用SPSS11.0软件包对试验数据进行统计分析 结果 1骨髓间充质干细胞移植治疗的安全性评价 MSCs移植治疗后仅有短 时的轻微发热和头痛 未见严重不良事件发生 短期安全性较好 2 骨髓间充质 干细胞移植治疗的有效性评价 A.与对照组1比较 试验组与对照组1个体性别构 成 年龄分布匹配 MSC移植治疗一周后与治疗前相比 APPEL评分总分和各分项评 分变化差异无显著性 p0.05 APPEL 评分总分在 MSC 移植治疗 2 个月后 91.20?30.282 与治疗前 88.43?31.835 相比有统计学显著性差异 p0.033,p0.05 各分项的评分变化中 延髓功能评分 呼吸功能评分和肌肉力 量评分无显著性差异 p0.05 而下肢肌肉功能和上肢肌肉功能评分有显著性差异 p0.05 说明接受细胞移植治疗后 试验组患者的病情仍在进一步发展 虽然肌 肉力量评分的变化无显著性差异 但是以肢体活动功能评分的变差为主 对照组 1 2北京大学博士学位论文 两个月前后APPEL评分总分和各分项评分变化中 延髓功能评分和呼吸功能评分变 化无显著性差异 p0.05 而肌肉力量评分 p0.012 下肢肌肉功能p0.013 上肢肌肉功能评分p0.009以及总分p0.011均有显著性差异p0.05 反映出 对照组1的患者在肌肉力量 肢体活动和总体病情方面均在加重 若以APPEL评分 变化速度为指标来反映病情发展速度 即APPEL评分变化 2个月后 治疗前 /单 位时间 2个月 则试验组病情发展速度 2.77?7.369 较对照组 12.35?20.273 为慢 有统计学显著性差异P 0.014 B.与对照组2比较 试验组与力如太组个 体性别构成 年龄分布以及病情程度匹配 试验组和力如太组LS-FRS评分变 化均无 显著性差异 p0.05 以ALS-FRS评分变化速度为指标来反映病情发展速度 试验 组和力如太组之间也无统计学显著性差异 C.试验组还有一些主观症状的改 善 并 有少数患者在治疗后症状 体征发生比较明显的改善 显示出 病情逆转 的 特征 Zung抑郁量表在一定程度上反映试验组患者接受MSC移植后没有明显的抑 郁或焦虑 的情绪变化 能够平静的接受试验治疗和配合各项评分检查 结论 自体骨髓间充质干细胞移植治疗散发性ALS是比较安全的 与非特殊 治 疗患者比较 MSC治疗在2个月的观察时间内显示了一定的延缓疾病进展的 趋势关键词 肌萎缩侧索硬化 骨髓间充质干细胞 力如太 移植 3北京大学博士学位论文 Preliminary report of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis Abstract Recently it has been shown in animal models of amyotrophic lateral sclerosis ALS that stem cells significantly slow the progression of the disease and prolong survival. This study was designed to investigate the safety and validity of a method of transplantation of autologous mesenchymal stem cells MSCs into subarachnoid space in 35 well-monitored patients with ALS. The case-control method was taken. The general physical examination, laboratory results, changes of subjective symptoms, APPEL score, ALS-FRS score and ALS/HSS score were recorded and compared among experimental group and two control groupscontrol group 1 was without specific treatment, control group 2 took Riluzole 100mg/dayObjective: To investigate the safety and validity of a method of transplantation of autologous mesenchymal stem cells MSCs into subarachnoid space in ALS patients Methods: The 35 cases of experimental group: Bone marrow collection was performed according to the standard procedure by aspiration from the posterior iliac crest. Ex vivo expansion of mesenchymal stem cells was done at the Stem Cell Center of Peking University. The cells were suspended in 5 ml of physiological saline and transplanted into subarachnoid space through lumbar punctureThe general condition, APPEL score,ALS-FRS score,ALS/HSS score and Zung score were recorded before transplantation,one week after operation,and 2 months later. Control group 1 was recorde twice with APPEL score in a day and 2 months later. The ALS-FRS score of control group 2 was recorded in the day when patiens began to take 100mg Riluzole per day and 2 months later. All datas were analysed by SPSS 11.0 software package 4北京大学博士学 位论文 Results: 1 The evaluation of safety in MSC transplatation: No patient manifested major adverse events such as respiratory failure or death. Minor adverse events were gently fever and headache. The short term security was relatively well.2 The evaluation of validity in MSCs transplantation : A pared with control group 1: The experimental group and control group 1 were matched with ages and gender.Nor was it significantly different in APPEL total score and all subscore before operation and one week after transplantation p0.05 .There was significant difference between the day before transplantation and 2 months later in APPEL total score p0.033, p0.05 .In the changes of subscores,the changes of bulbar function score , respiratory function score , and muscular strength were not significant p0.05They were significant in limbs function score p0.05 .This phenomenon may mainly show that the state of disease was gradually deteriorated in despite of little change of some subscore after transplatation.Within control group 1,the changes of bulbar function score and respiratory function score were not significant. There was significant difference of muscular strength and limbs function. It reflected the illness of control group 1 aggravated from aspect of muscular strength, limbs function, and general state. The velocity of changes in APPEL score can reflected the speed of aggravating of ALS. From this point the speed of aggravation of experimental was slower than control group1.It has significant difference in statistics. B. Compared with control group 2: The experimental group and control group 2 were matched with ages and gender. There were not some significant findings between these two groups. Some cases transplanted MSC shown the relatively great well change in symptoms and signs, displayed reversion characteristic of some degree. There was not significant change between preoperation and postoperation in Zung scoreCONCLUSIONS: Our results appear to demonstrate that the autologous mesenchymal stem cells transplantation into subarachnoid space through lumbar puncture is safe and well tolerated by ALS patients. Compared with control groups, MSCs transplantation shown some ability to slow the progression of the diseaseKey words : Amyotrophic lateral sclerosisMesenchymal stem cell Transplantation Riluzole5北京大学博士学位论文 文献综述 骨髓间充质干细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症的初步报告 一 肌萎缩侧索硬化概述 1. 流行病学和临床特征 1.1 历史回顾 1869年 Charcot和 Jeffroy报道 2例肌肉萎缩伴脊髓后侧部病变 1874年 Charcot 根据 20 例临床病例和 5 例尸检资料 明确提出了肌萎缩侧索硬 化症 amyotrophic lateral sclerosis ALS 的概念 Charcot的临床及病理描述 非 常确切 至今仍无很大变动 其中最关键部分是认为存在脊髓中皮质脊髓束 前角 及脑干运动核的原发性病变 而神经根和肌肉改变为继发性变化 20世纪 30年代 后期 美国著名棒球运动元 Lou Gehrig 因患 ALS而退出棒球界 从此 ALS被社会 广泛重视 并在美国被称为 Lou Gehrig病 1 2 1.2 流行病学 根据流行病学特征可将ALS分为三类 散发型ALS sALS 家族型ALS fALS 和西太平洋地区 ALS 来自不同地理环境 种族和社会经济条件的世界各地的研究 6 6 表明 sALS的年发病率为0.2 2.4/10 患病率为0.8 7.3/10 1 4 ,以北京 市 1 300万人口计算 每年约新增病人26 312个 确诊的ALS病人总数约为104 949个左右 Juergens 等的研究表明 ALS的发病率随年龄的增加而增高 发病的高峰期为 55 75岁 年龄是ALS最有意义的危险因子 ALS的生存与年龄有关 起病年龄越 小 生存期越长 5 Eisen 等证实40岁以前起病的ALS病人的生存期比60岁以 后起病者生存期长3倍 绝大多数的报道都认为ALS以男性为多见 男女之比为1.4 2.5 1 但是 以延髓症状起病的ALS病人则以女性多见 从各国的平均生存期和中位数生存期的资料来看 ALS起病后的平均存活时 间 为3年 一般为31 43个月 有15 30 的病人能存活5年以上 50岁以前发病 的病人 一般存活时间长 1.3 病理改变 病理诊断ALS的标准是 运动皮质的大锥体细胞消失 脊髓前角和脑干的运动 7北京大学博士学位论文 神经元脱失并出现异常的细胞病理改变 皮质脊髓束变性和脱髓鞘 6 与临床表 现相关的主要病理学改变包括 1 脊髓前角和脑干颅神经运动核下运动神经元 前 角细胞 数量和体积减小和 2 继发于轴突变性的皮质脊髓束脱髓鞘 UMN Betz 细胞 异常有较大的变异 受累最严重的病例可见Betz细胞明显丢失伴有反应性胶 质细胞增生 病理改变通常仅限于上 下运动神经元系统 但是目前也有报道可有 更多部位受到累及 7 包括脊髓小脑束和皮层下白质等 还可有额叶 颞叶甚至 部分感觉皮质的皮层细胞发生变性 1.4 病因和发病机制 关于ALS的病因曾提出许多学说 包括自由基氧化损伤学说 兴奋性毒性学 说 骨骼肌异常学说 自身免疫异常学说 神经营养因子以及环境因素影响等 8 在 正常情况下机体产生的少量自由基可被体内的自由基清除剂VitC VitE和过氧化物 歧化酶 SOD 过氧化氢酶 CAT 谷胱甘肽过氧化物酶 GPX 清除 不致引起病 理效应 氧化应激是指体内氧化 抗氧化这两个拮抗体系的失衡引起的机体生化生 理过程异常 即活性氧 ROS 的产生超过了抗氧化体系的防御能力或体内抗氧化剂 消耗过多而难以消除正常生成的 ROS 氧化应激产生的有损害作用的自由基有超氧 - - - - - 阴离子 HO O 羟自由基 OH 脂自由基 RO ROO 过氧亚硝基 ONOO 2 2 2 等 参与一系列生理和病理过程例如老化 缺血性细胞死亡以及神经系统变性疾病 氧化导致的细胞损伤已经在散发性和家族性 ALS患者和过度表达一种变异 SOD 的 转基因小鼠模型中被证实 但这种损伤的机制及其致病的重要性尚不清楚 ALS患 2+ 者谷氨酸 Glu 水平较高 故易被谷氨酸所致的过度兴奋毒性机制激活 使 Ca 2+ 进入细胞内 激活Ca依赖的神经元型NOS NOS催化生成NO 过量的NO具有神经 2+ 毒性 Dawson等在原代神经细胞培养时证实过量的NO有助于Glu的毒性 9 Ca - - 进入线粒体功能受损 产生的O 等氧自由基增多 从而OH 增加 突变型SOD 可 2 - - 使O 与NO的反应加快 生成化学性质更为活泼的ONOO 这一过程的速度是SOD 2 - - - - 清除 O 速度的 3倍 NO也可与 HO生成 ONOO ONOO是比 O强得多的氧化物 2 2 2 2 可与体内众多物质发生反映生成硝基化产物 由于ALS患者过氧化物酶活性较高 产生的氧自由基可以导致各种细胞毒性 例如使膜磷脂中的不饱和脂肪酸发 生脂质 过氧化 改变其分子结构 导致黏度增大和流动性变差 从而影响细胞与外界物质 进行交换 脂质过氧化产生的自由基可使蛋白变性形成蛋白自由基 并进一步引起 蛋白分子的聚合 肽键断裂等变化 自由基还导致细胞膜 线粒体 轴突受损 影 响轴浆运输 作用于核酸可发生碱基修饰和链的断裂8北京大学博士学位论文 已有研究显示遗传因素对于ALS来说是重要因素 约3 4 的SALS和20 的 家族性ALSFALS与 Cu-Zn SOD 基因突变有关 后者定位于21q21.2 22.2 目前 证实有115种以上的突变发生在该基因的5个外显子上 10 其中87种为错义突 变 10种为非错义突变 11个部位23处为内含子变异 说明ALS的基因多态性 研究发现一种进展缓慢 以远端肢体肌萎缩和锥体束受损为临床特征的青少年常染 色体显性遗传的ALS与常染色体9q34相关另一种致命性的先天性挛缩综合征亦与 9q34连锁 其特点为脊髓运动神经元的变性 11 ALS隐性遗传型则多表现为青少 年型和缓慢型 主要累及上运动神经元及其轴突和面 舌神经核 这两型与 2q23 相连锁 12 随着研究的深入 一些新的位点将被发现 2 SOD的 Cu的螯合物 CCS 存在于健康人和 ALS患者的神经元上 Cu 结合到 SOD Cu的结合位点上 使铜直接嵌入载脂蛋白 从而使游离状态的铜维持在正常 的微量水平 突变的SOD 与Zn的结合力下降 Cu的结合位点暴露 使大量游离 2 的Cu 进入酶促反应的激活位点上 使酪氨酸磷酸化被阻断 导致酪氨酸磷酸化介 导的信息传导发生改变 产生可能具有毒性作用的新功能蛋白质 有研究证实突变 的 SOD 如果敲除了 Cu则毒性作用消失 因此 Cu的暴露在突变 SOD 的毒性作用 中起关键作用 铝在ALS中也具有神经毒性作用但机制不清 试验表明铝可以改变 2+ Ca的内流和细胞内外平衡 使膜的脂质过氧化容易进行 谷氨酸 Glu 是中枢神经系统内一种重要的兴奋性神经递质 其兴奋毒性可 能参与ALS的病变过程研究表明ALS患者脑脊液中Glu水平比80 对照组高 3倍 Glu的转运蛋白已被克隆 分别是GLT-1EAAT GLAST EAAC EAAT EAAT 主 2 1 4 5 要在星型胶质细胞中表达Glu胶质性转运蛋白的是EAAT和GLAST 其作用是清除细 2 胞外增加的Glu所致的兴奋毒性 13 有研究发现EAAT在ALS患者皮层和脊髓的 2 水平较对照组低 43%的ALS患者存在Glu转运蛋白的功能丧失 提示ALS患者的兴 奋性氨基酸 EAA 转运系统有损害 14 对A4V和I113转基因鼠的研究 15 提 示 SOD 突变型介导的兴奋毒性是由于过度兴奋性毒性机制引起的 即主要是 Glu 2+ 作用于受体后导致Ca内流 激活了一系列的降解酶 如蛋白激酶C 蛋白酶 NOS 2+ 等使蛋白质分解 自由基生成和脂质过氧化致神经元自行溶解 过量的 Ca也可激 2+ 活核酸内切酶使 DNA断裂及核崩解 目前还认为线粒体内 Ca超载也是由 Glu的兴 2+ 奋毒性引起的 且Ca超载可能是运动神经元死亡的重要原因 16 神经微丝在运动神经元胞体和核周体上聚集是ALS的病理特征 Lee等动物试 9北京大学博士学位论文 验表明神经微丝轻链 NF L基因点突变时可复制出人类ALS的临床病理特征 17 已有试验证实缺氧可以导致神经微丝破坏并发生聚集 另外 神经微丝在 SOD 基 因突变型患者的前角细胞中也有发现 但起何种作用并不清楚 目前认为蛋白酪氨 酸硝基化与运动神经元选择性死亡关系密切 因为运动神经元是含神经微丝轻链最 2+ 2+ 丰富的神经元 神经微丝轻链与Zn有高度亲和力 可使突变的SOD 与Zn的亲和 - 力进一步下降 加重ONOO对酪氨酸的硝化 从而选择性使运动神经元变性死亡 这 些研究表明神经微丝在ALS中起重要作用 神经营养因子能促进运动神经元的生长 减少细胞变性和死亡 并经动物 临 床试验证实能延缓运动神经元病的病情进展 包括脑源性神经营养因子 BDNF 神 经营养因子-3 NT-3 神经营养因子-4/5 NT-4/5 睫状细胞神经营养因子 CNTF 白血病抑制因子 LIF 心肌营养因子-1 CT-1 肝细胞生长因子 HGF 胰岛素 样生长因子- 和 IGFs- 和IGFs- 胶质衍生的神经营养因子 GDNF Neurturin Persephin 在运动神经元上均有其相应的受体 神经元营养因子可有 选择性地作用于外周和中枢特定的神经元 增强其存活 生长和分化的生物效应 神经营养因子减少或者活性降低 或运动神经元对其缺乏反应 都可导致运动神经 元变性进而发生MND 试验发现CNTF能减少患MND的小鼠的神经元丢失 延缓病情 发展 ALS患者脊髓前角发现 CNTF免疫活性显著降低 IGFs- 能减少脊髓运动神 经元死亡 并能促进失神经支配的运动神经元的生长 研究表明ALS患者的血清对体外培养的运动神经元有毒性作用 在患者的大脑 运动皮层和脊髓灰质上有免疫复合物沉积 激活的T淋巴细胞及小胶质细胞大量增 生 同时ALS患者可伴发单克隆免疫球蛋白血症和增殖性淋巴瘤 部分患者 的血清 中存在抗神经节苷脂GM1抗体和IgG免疫复合物增高 多数患者的血清中存在抗电 压依赖性钙通道抗体 其滴度与ALS病情进展程度相关 此外ALS患者和免疫诱导 的动物模型的运动神经元末梢有免疫球蛋白结合 这些都提示自身免疫异常可能与 本病发生有关 但目前自身免疫在ALS中所起的作用尚不清楚 尚无可靠的研究结 果支持自身免疫是ALS的主要致病机制 ALS的病因 发病机制以及影响ALS进展的因素尚未明了 可能是某些因素相 互作用的结果 其中一些因素为导致疾病的直接原因 另一些与临床表型和进展速 度相关 1.5 临床特征对于诊断ALS 临床症状和体征比任何辅助检查都重要 ALS的症状和体征是 10北京大学博士学位论文 皮质 脊髓运动神经元变性的结果 主要分为上运动单位损害综合征 UMNS 和下 运动单位损害综合征 LMNS 而在临床上 ALS病人的表现因人而异 这不仅取决 于起病方式 也与疾病的不同阶段有关 下运动神经元损害表现为疲劳 力弱 肉 跳和动作不协调等 查体可见肌肉萎缩 肌力下降 中 重度 肌张力降低 腱反 射减弱 真性延髓性麻痹 肌肉痛性痉挛以及肌束颤动等 其中舌肌纤颤是一个高 度提示ALS诊断的体征 上运动神经元损害的表现为力弱 动作不协调 僵硬和肢 体远端动作减慢等 体征包括运动技巧性降低 肌力减退 轻度 肌张力增高 腱 反射增强 假性延髓性麻痹 伸肌痉挛 病理征如Babinski征和Hoffmann征阳性 等 18 19 最初发病时症状通常不对称并且可能相当的局限 肢体远端起病的病 例最初出现如系扣子 用钥匙锁门 捡拾物体困难等 这些是最常见的起病方式 偶尔近端肢体在疾病早期受累 表现为行走 跑步或上楼困难 尽管存在力弱和肌 肉萎缩 某些重复性协调动作得以相对完好保留 这可能是因为感觉反馈是正常的 但由于同时存在痉挛性肌张力增高 导致患者出现动作减慢和精细动作不协调以及 异常姿势 肌阵挛在ALS患者中非常罕见 患者通常死于呼吸功能衰竭 随着病情发展患者会出现球部症状 但也可能作为一种突出的临床表现 特别 是在中年女性患者 对于老年女性以及男性患者来说 肢体或躯干受累更为普遍 散发性 ALS中肢体起病的患者约为65 80 球部起病者则占20 25 18 球 部症状包括构音和吞咽困难 并且通常与呼吸肌肉的力弱和用力肺活量 FVC 下降 有关 作为一种敏感提示膈肌功能的床旁检查 用力吸气能力的数值也是降低的 夜间睡眠明显减少 白日睡眠增多 醒后头痛以及夜间多汗都是呼吸功能衰减的早 期表现 球部功能受累的患者预后很差 球部起病的ALS患者的生存期也较肢体起 病者短 疾病不断进展是诊断中一个主要的组成部分 ALS进展速度差异较大 从几周 至几年不等 起病后症状逐渐向其他区域发展 19 肌电图检查 临床评估以及肌 力测定都表明这种进展逐渐累及邻近的肌肉 因此最接近首发症状的肌肉紧接着受 到累及 对运动系统不同部位和不同程度的累及导致临床表现并不相同 但随着病 情进展 最终临床表现却非常一致 即肌肉萎缩和肢体痉挛非常明显 在疾病晚期 可有锥体外系通路的受累 表现为帕金森样症状 20 10 的散发性ALS患者会出 现痴呆 以额叶受累为主 21 与其他导致瘫痪的神经系统疾病不同 ALS患者很 少发生褥疮 即使是在卧床的患者 这可能与ALS患者感觉系统未受累有关 也可 11北京大学博士学位论文 能与皮肤中胶原的某一特性有关 散发性ALS一般不累及眼外肌 但某些球部起病的患者在脊髓区域受累之前眼 球活动减慢的症状比较突出 排尿和肛门括约肌功能相对保留直到疾病晚期 这些 肌肉接受位于第三骶髓的Onuf核团的支配 类似地 喉部的外展肌肉和环咽括约肌 也不易受累 另外 感觉系统异常也比较少见 一小部分散发性ALS患者可以出现 行为和人格障碍 认知功能评价显示患者在制定 执行策略和完成复杂连续工 作方面受损 尽管痴呆不是ALS的原发症状 这些临床表现反映出病程中额叶功能 的受累 并且在球部受累的患者中更为普遍 22 在疾病早期 缺乏明显的感觉系 统异常 括约肌功能异常或者眼球活动异常通常用于区分ALS和其他下运动神经元 疾病 影像学和电生理检查在疾病早期是除外其他诊断的重要手段 通过 El Escorial 23 标准做出的临床诊断主要是基于临床表现 电生理检查和神经影像 学检查的结果 二 诊断和病情评估方法 2.1 诊断标准和分类诊断ALS必须具备有上运动神经元和下运动神经元同时受累的症状和体征 根 据两个系统是否同时受累 可将 ALS进一步分为 4个亚型 典型 ALS 进行性延髓 麻痹 PBP 进行性脊肌萎缩症 SMA 和原发性侧索硬化症 PLS 或认为后三个 亚型为典型ALS病程的不同阶段 根据有无遗传史 可分为散发型和家族型ALS 为了便于开展ALS的临床研究和治疗试验 必须要有一个较统一的诊断标准 1994 年世界神经病学联盟 World Federation of Neuology WFN 提出了 EL Escorial诊断标准 23 见表1 1998年又对这一标准进行了补充和修订 目前 这一标准已在国际上得到了广泛认可 24 43 表2 表3 我国也在其基础上制 定出我国的ALS诊断标准 25 表 1 ALS的 El Escorial诊断标准 1994年 确定 球部和 2个脊髓节段或者3个脊髓节段有上下运动神经元受损的体征 很可能 2个或以上节段有上下运动神经元受损的体征 这些节段的表现可能不同 但 是上运动神经元受损的表现应较下运动神经元受损的表现更为突出 可能 只有 1个节段有上下运动神经元受损的体征 或者 2个或更多节段有上运 动神 经元受损的体征 但下运动神经元受损的体征更突出 可疑 至少2个节段有下运动神经元受损的体征12北京大学博士学位论文 表 2 WFN诊断 ALS的 El Escorial标准 1998年 存在 缺乏 1.临床 EMG或神经病理学检查有下运 1.有能解释下运动神经元损害和 或 动神经元损害的证据 上运动神经元损害体征的其他疾病的 电生理和病理学依据 2.临床检查有上运动神经元损害的证 2.有能解释临床和电生理体征的其他 据 疾病的神经影像学依据 3.通过病史或体检发现症状或体征在 一个部位内进行性扩展或扩展至其他 部位 表 3 诊断 ALS的 4个部位 症状和体征脑干 颈 胸 腰 骶 下运动神经元 颌 面 颈 背 背 损害体征 软腭 上肢 腹 腹 肌无力 舌 手 下肢 肌萎缩 咽 膈肌 足 束颤 上运动神经元 下颌反射亢进 Hoffmann征 腹壁反射消失 拇趾背屈反应 损害体征 咽反射增强 病理性深反射 病理性深反射 病理性深反射 腱反射亢进病 吸吮反射 亢进 亢进 亢进 理征 假性延髓性麻 萎缩无力的肢 萎缩无力的肢 痹的特征 体反射保留 体反射保留 病理性深反射 亢进 2.2 常用病情评估方法 选择适当的指标予以观测对于 ALS 病情评估很有意义 观察指标可以分为 两 类 基本指标是肌力变化 呼吸功能和死亡率 二级指标是功能变化 日常生 活能 力 电生理变化和神经影像学变化 26 27 依据病史 主观诉说 客观检查和观察 辅助检查等方法和手段 可以对MNDs 进行全面的状态 功能和病情程度的评估 目前最常用于ALS病情评估的量表是ALS 功能分级量表 ALS FRS 其依据于病情程度和联合帕金森病分级量表 UPRS 而 建立 主要观察延髓和呼吸功能 4项 上肢功能 2项 下肢功能 2项 和其 他能力 2项 表4 按照临床检查和主诉/病史建立的Norris量表 改良Norris 量表 Appel量表和Plaitakis评分亦被广泛用于临床 且各有特色 28 ALS 健康状态量表 ALS health state scale, ALS/HSS 由医生将病人的语 言 上肢日常生活能力和行走功能综合评估 分为四期 非常简明实用 2913北京大学博士学位论文 测定肺活量 FVC 最大通气容量和用鼻吸气时的鼻压有助于了解肺功能 是 目前已知的预示病程和判断治疗疗效的可靠的指标 26 电生理检查可进行运动单位计数 复合肌肉运动电位 CMAP 的波幅与功能损 害 预后及MVIC变化有非常好的相关性 30 33 用MRS测定病人脑中NAA/肌酸比率 34 35 用经颅磁刺激测定配对脉冲抑 制 PPI 和配对脉冲易化 PPF 的变化均可能成为很好的评估病情的指标 34 37 生命质量评估是病情评价必不可少的重要内容 38 疾病影响测验 Sticks Impact Profile SIP 是当前广泛应用的有效方法 它包括136个是/否选择问答 题 涉及身体活动 行走 运动 肢体活动 心理 警觉性 交流 情感 社交 和其他 进食 居家 娱乐 睡眠 工作 三方面 是很好的反应生命质量的评估 手段 但使用较为复杂 近年推荐使用40项的ALS评估问卷 ALSAQ 40 有较好 的可靠性和重复性 另外 由于生命质量的评估依据于主观性评估 故难以避免偏 差 38 39 目前并不建议将生命质量评估作为病人病情的基本或核心的观察指标 38 40 2. 治疗现状 随着对ALS的病因学和病理生理学认识的不断深入 人们对此难治性疾病的挑 战作出了一系列令人瞩目的努力探索了许多针对病因的经验性和理论性治疗 41 前者包括使用促甲状腺素释放激素 环磷酰胺 尼莫地平 维拉帕米 美沙芬 加 巴喷丁等 后者则有脑源性神经营养因子 胰岛素样神经生长因子等各种生长因子 和力如太等 41 42 对ALS的治疗包括病因治疗 对症治疗和各种非药物治疗 当前病因治疗的发 展方向包括抗兴奋性氨基酸毒性 神经营养因子 抗氧化和自由基清除 新一代钙 通道阻断剂 抗凋亡 基因治疗及干细胞移植治疗 过去十几年在了解肌萎缩侧索硬化的道路上出现了令人振奋的进步 但知识的 发展仍不能满足探索治疗ALS的方法的需要 找到肌萎缩侧索硬化的治疗方法是一 项长期 艰巨的任务 其中包括了解使运动神经细胞再生的条件 或增强神经细胞 的自我修复能力等 必须指出 ALS是一类异质性疾病 致病因素多且相互影响 发病机制尚不完全明了 治疗应该是多种方法的联合应用 当然 要将当前最新的 研究成果转变为对成千上万的病人和家庭的益处还需要一段时间 还需要更多的基 础科学研究和严密的临床研究14北京大学博士学位论文 二 骨髓间充质干细胞概述 1. 概述 骨髓基质细胞 bone marrow stromal cells BMSC 的发现至今有135年的历 史 在体外的分离培养有26年的历史 骨髓基质细胞是成分混杂的一组细胞 由细胞形态和生化特征都明显不同的细胞类型组成 骨髓成纤维细胞 脂肪细 胞 成骨细胞 巨噬细胞和内皮细胞 骨髓基质细胞中非造血前体细胞也称为 间充质干细胞 mesenchymal stem cell, MSC BMSC和MSC的概念常被混用 近年来 BMSCs日益成为研究的热门对象 原因是不断发现它有多种多样的分化 能力 不仅能分化出中胚层的骨 软骨 肌肉 肌腱 脂肪 血管内皮等 43 而且还令人惊奇地可以跨胚层横向分化 transdifferentiate 出内胚层的肝 细胞 44 肺泡上皮细胞 45 和外胚层的神经细胞 2 骨髓间充质干细胞在体外诱导为神经细胞的研究Woodbury等 53 在2000年报道了在体外诱导骨髓基质细胞向神经细胞转化 的试验 神经诱导液含抗氧化剂BME -mercaptoethanol -巯基乙醇 DMSO dimethylsulfoxide 二甲亚砜 BHA butylated hydroxyanisole 丁羟茴醚 在诱导液的作用下 部分骨髓基质细胞形态在60分钟后发生变化 3小时后反应细 胞具有神经细胞的形态特征 扁平的胞体收缩 逐渐成球形 折光强 呈现典型的 核周体外形 同时细胞膜突起 形成初级和次级分支 以及生长锥样的末端膨大和 可能的丝足突起 和细胞外形的改变同步的是BMSCs的表型的变化 作者检测了多个指标 包括 Nestin 巢素蛋白 一种中间丝蛋白 表达于神经上皮前体细胞 随神经细胞的成 熟逐渐减少 NSE NF-M一种神经元特异性中间丝 有助于轴突的延伸 tau分 化过程中的神经元表达的神经元特异性的微管蛋白 trkA 高亲和力的神经生长因 子的受体 试验结果表明 诱导后未反应细胞有轻微的NSE染色 而反应细胞的 NSE表达不断增强 绝大多数胞体变为圆形有突起的细胞表达高水平的NF-M 部分 反应细胞只在突起中表达NF-M 显示成熟神经元的表型 神经元样细胞的胞体和突 起中均有tau表达 所有的神经元样细胞都表达NSE 但是只有一部分表达NeuN 暗示这部分细胞是有丝分裂期后的成熟的神经元 诱导5小时后 部分MSC来源的 神经细胞高水平表达Nestin 随着诱导神经的延长 Nestin的表达逐渐减少 到第 6天就检测不到了 但trkA从5小时到6天的时间段中持续表达 这些表明了神经 细胞不断成熟的过程 反应细胞的GFAP染色为阴性 表明在体外诱导中 MSC不向 15北京大学博士学位论文 星型胶质细胞分化 联合应用 DMSO/BHA时诱导 MSC成为神经元的比例最高 有约 80 的细胞表达NSE和NF-MMezey等 51 在体外检测 BMSCs 的神经细胞表型 发现急性分离的细胞培养 4小时后 Nestin 染色阴性 加入含 PDGF platelet-derived growth factor 10 ng/ml的DMEM-10% FCS中培养15天后 18 50 的细胞为Nestin阳性 Sanchez-Ramos等 54 发现 BMSCs用含 EGF的培养液培养 表达 Nestin的 蛋白和mRNA 加入0.5m RAall-trans-retinoic acid,全反式视黄酸 10ng/ml BDNF brain-derived neurotrophic factor 脑源性神营养因子和10 FCS的诱 导液后 BMSCs 中 fibronectin 阳性细胞的数目明显减少 许多大而扁平的 fibronectin 阳性细胞变为有长突起的针样细胞或者小的卵圆形的细胞 其 fibronectin阴性 NeuN阳性和GFAP阳性细胞分别占总细胞数的0.5 和1 5 5 在BMSCs和神经细胞的共培养试验中 2.5 10个大鼠BMSCs种在2.5 10大鼠中 脑细胞上 使用含 RA和 BDNF的 N5培养基 2周后固定染色 约 2 5 BMSCs的 NeuN阳性 人BMSCs和大鼠中脑细胞共培养1周后 2 4 BMSCs的NeuN阳性 聚集在大鼠中脑细胞周围 呈椭圆形或者针形 但没有表达 MAP-2 microtubule-associated protein-2 5 8 BMSCs的 GFAP阳性 共培养的 试验表明 细胞之间的相互接触和营养因子 细胞因子对细胞的分化有重要作用 NeuN最开始出现在神经干细胞脱离细胞增殖周期开始向神经元分化的时候 而MAP2 的表达在发育过程中晚于NeuN, 在新生大鼠一般多出现在出生后10 20天 BMSCs 源的神经细胞表达NeuN而不表达MAP2说明细胞处于不成熟神经元的阶段 其向成 熟神经元的分化需要进一步的长时间的试验观察 Deng等 57 发现未分化的 hMSCs表达某些神经细胞标志 如 MAP1B TuJ1 neuron-specific tubulin NSE Vimentin 波形蛋白 用 0.5mM IBMX isobutylmethylxanthine/ 1mM dbcAMP dibutyryl cylic AMP诱导 hMSCs 2 天后出现典型的神经元样外形 6天后占细胞总数的25 而且有生长锥样末端结 构和未分化细胞接触 细胞生长减慢 但未死亡 细胞表达NSE和 Vimentin 升高 但MAP1B和TuJ1没有变化 在未诱导和诱导细胞中均未发现 NF-M MAP2 tau GFAP S-100 成熟星型胶质细胞标志 MBPmyelin basic protein 少突胶质细胞标志 的表达 说明 hMSCs诱导成为早期的神经前体细胞 从诱导 6天的 hMSCs中撤去 IBMX/dbcAMP后培养 所有神经元样细胞死亡 说明 hMSCs向神经细胞分化是不可 16北京大学博士学位论文 逆的 IBMX是磷酸二酯酶抑制剂 dbcAMP是cAMP的类似物 二者都可以提高细胞 内的cAMP水平 诱导hMSCs成为神经前体细胞 3.骨髓基质细胞在体内向神经细胞转化的研究发现骨髓基质细胞在体内向神经细胞转化是一个偶然的过程 为了研究成体动 物的脑中的小胶质细胞是否可以来源于中枢神经系统外的造血系统 1997 年 Eglitis 46 将有逆转录病毒基因标记或者雄性小鼠的骨髓通过尾静脉注射移植到 雌性小鼠的体内用原位杂交的方法发现3天后移植的骨髓细胞通过了血-脑屏障出 现在受体的脑中 并且数量不断增加 广泛分布于脑皮质 海马 丘脑 脑干 小 脑 表达小胶质细胞的标志 F4/80 并令人惊奇的发现表达星型胶质细胞的标志胶 质纤维酸性蛋白GFAP glial fibrillary acidic protein 移植 4周后 GFAP 阳性细胞占受体脑内存活的供体细胞的0.5% 到2%受此启发 在接下来的几年中 将骨髓基质细胞移植到脑组织中的研究成为一 个热点 Azizi 47 等将人的骨髓基质细胞在体外培养 加入bis-benzamide中培 养24小时标记 通过钻孔将10 l约100 000个细胞注射到大鼠脑中 分别在5 14 30 72天取材检测 试验发现72天后植入的细胞有约20 在大鼠脑中存活 并且沿着和植入的神经干细胞相同的路径迁移 广泛分布于脑中 移植的细胞不再 表达 型胶原 fibronectin 纤维结合素 的表达也明显降低 此项研究表明骨髓 基质细胞在脑中有较强的存活或者增殖能力 表型也随移植的环境发生改变 Brazelton等 48 试验在生理条件下诱导骨髓基质细胞向神经细胞转化 用表达 GFPgreen fluorescent protein 绿色荧光蛋白的成年 8 10周 小鼠骨髓经 6 过尾静脉注射到成年小鼠体内 每只小鼠注射6 10个有核细胞 2-12个月后取材 发现GFP + 的细胞在脑中存活 20 以上不表达CD45和CD11b GFP + 细胞大 部分 平均63.5 表达F4/80 小胶质细胞/巨噬细胞的表型 无细胞表达GFAP 小部分 平均36.5 细胞表达神经元特异性标志NeuN neuron-specific nuclear protein 神经元特异性核蛋白 和NF-H neurofilament- 200 神经微丝-200 8 12周后移植小鼠的脑中约0.2 0.3 的神经元来源于移植的骨髓并且骨髓来 源的神经元和周围正常神经元一样对周