克仑特罗ELISA操作手册

克仑特罗ELISA操作手册 克仑特罗 (Clenbuterol)ELISA试剂盒快速检测方法 一、概要 克仑特罗(Clenbuterol)属于β-兴奋剂，近年来被非法添加到饲料中以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物生长，因其添加剂量是治疗剂量的5-10倍，以至于在动物体内残留量高而给消费者带来危害。本试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代药物残留检测产品，与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点，操作时间仅需50分钟，能最大限度地减少操作误差和工作强度。 二、试验原理 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的克仑特罗和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗克仑特罗抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物克仑特罗的含量成负相关，与曲线比较再乘以其对应的稀释倍数即可得出样品中克仑特罗的残留量。 三、适用范围 可定性、定量检测动物组织(肌肉、肝脏等)、尿液、饲料、牛奶等样品中克仑特罗的残留量。 四、使用单位需自备的设备及试剂 1 设备:微孔板酶标仪450nm/630nm;旋转蒸发仪/氮气吹干装置;均质器;振荡器;涡旋仪;离心机;天平:感量0.01g;刻度移液管: 10ml;洗耳球;容量瓶:100ml、1L;玻璃试管:10ml;聚苯乙烯离心管:2ml、10ml、50ml ;微量移液器:单道 20,l,200,l、100,l,1000,l;多道 250,l;RIDA C18柱; 2 试剂:甲醇(分析纯)(组织样本专用);氢氧化钠(分析纯);正己烷(分析纯);浓盐酸(分析纯);磷酸二氢钾(分析纯)(组织样本专用);Tris Base(组织样本专用);氯化钠(分析纯);去离子水; 五、提供的与试剂 第 1 页 共 8 页 1、96孔酶标板×1块 (包被有偶联抗原) 2、标准液×6瓶:(1ml/瓶):0ppb，0.1ppb，0.3ppb，0.9ppb，2.7ppb，8.1ppb 3、高浓度标准品:(1ml/瓶): 100ppb 4、酶标二抗 7ml …………………… 红色帽 5 抗体工作液 10ml …………………… 绿色帽 6、底物液 A 液 7ml …………………… 白色帽 7、底物液 B 液 7ml …………………… 红色帽 8、终 止 液 7ml …………………… 黄色帽 9、20×浓缩洗涤液 40ml………………………透明帽 六、溶液的配制 配液1: 50mM 盐酸溶液(低脂肪的肉、肝样本专用);量取4.17ml浓盐酸加入去离子水中定容至1L。 配液2: pH3.0 50mM磷酸二氢钾缓冲液(过柱方法专用);称取3.40g磷酸二氢钾加500ml去离子水溶解混匀 (用磷酸或氢氧化钠调节pH值至3.0)。 配液3: pH3.0 500mM磷酸二氢钾缓冲液(低脂肪的肉、肝样本专用);称取34.02g磷酸二氢钾加500ml去离子水溶解混匀 (用磷酸或氢氧化钠调节pH值至3.0)。 配液4: pH8.5 50mM Tris-Base缓冲液(高脂肪的肉、肝样本专用);称取3.03g Tris-Base加500ml去离子水溶解混匀 (用盐酸调pH至8.5)。 配液5: 1M 盐酸溶液(饲料样本专用);量取8.3ml浓盐酸加入去离子水中定容至100ml。 配液6: 1M 氢氧化钠溶液(低脂肪的肉、肝和饲料样本专用);称取4.0g 氢氧化钠加100ml去离子水混匀溶解混匀。 配液7: 0.1M 盐酸溶液(组织不过柱方法专用); 量取0.83ml浓盐酸加入去离子水中混匀定容至100ml。 配液8: 4%氯化钠溶液;称取4.0g氯化钠加去离子水溶解定容至100ml。 配液9: 4%NaCl- 0.1M HCl-甲醇混合液;量取70ml 4%氯化钠溶液、20ml 0.1M 盐酸溶液和10ml甲醇混合均匀。 配液10: 洗涤工作液;用去离子水将20×浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释(1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在 第 2 页 共 8 页 4?环境可保存一个月。 七、样本前处理步骤 (一)、样本处理前须知 处理任何样本时，都必须注意: 1、实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。 2、实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免 污染干扰实验结果。 3、使用方法(a)提取的组织样本提取液可于4?存放3天; 使用方法(b)提取的组织样本不加氢氧化钠样本放置4小时以上，回收 率下降10%;加氢氧化钠不能保存，必须立即用于检测。 4、处理好的饲料样本不可保存，必须立即用于检测。 5、盐酸均质后的样本在2-8?稳定3天。 6、用磷酸二氢钾缓冲液提取后的样本(RIDA C18柱纯化之前)在2-8?稳定 2天，使用前离心。 7、用RIDA C18柱纯化所获得的甲醇洗脱物可以冷冻保存2个月，在2-8?稳 定2周。 8、用去离子水溶解干燥的残留物在2-8?稳定1周。 (二)、尿液 取20,l清亮尿样直接测定(如尿样浑浊必须通过过滤或3000g以上，15?离心10min直至清亮)，暂不使用的样本应冷冻保存。 (三)、组织带有低脂肪的肉、肝等组织 方法(a) 1、 称取5.0?0.05g粉碎的组织样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入25ml 50mM盐酸溶液(见配液1)混合，用振荡器振荡1.5h，以达到均质的目的; 2、称取6.0?0.05g均质物(相当1.0g组织样本)至50ml聚苯乙烯离心管中; 3、3000g以上，10-15?离心15min; 4、移取全部上清液(切记不要吸取到均质物)至另一个洁净的50ml聚苯乙烯离心管中，加300,l 1M氢氧化钠溶液(见配液6)，使用振荡器振荡15min; 第 3 页 共 8 页 5、加入4ml pH3.0 500mM磷酸二氢钾缓冲液(见配液3)，简单的混合后在4?保存，至少1.5h或过夜(非常重要); 6、3000g以上，10-15?离心15min，分离全部上清液(应该是清亮的，非常重要)，使其升至室温(20-25?);然后用RIDA C18柱纯化(见RIDA C18柱纯化步骤)。 方法(b) 1、称取2.0?0.05g均质样本至50ml聚苯乙烯离心管中; 2、加入6ml 4%NaCl,0.1M HCl-甲醇混合液(见配液9)，用振荡器振荡摇至 均匀; 3、静置10分钟，3000g以上离心5分钟; 3.1 肝脏样本:取1ml上清液加入20μl 1M 氢氧化钠溶液(见配液6) 混匀 (混匀以后测定pH值，大约为8); 3.2 肌肉样本:取1ml上清液加入30μl 1M氢氧化钠溶液(见配液6)混匀 (混匀以后测定pH值，大约为8); 4、取20,l用于分析。 (四)、高脂肪肉和组织 1、称取5.0?0.05 g粉碎的样本至50ml聚苯乙烯离心管中加入25ml pH8.5 50mM Tris-Base缓冲液(见配液4)混合，用振荡器振荡0.5h，以达到均质的目的; 2、加入15ml正己烷，用振荡器振荡5min以除去脂肪; 3、3000g以上，10-15?离心15min; 4、用移液器除去上层的正己烷相及中间薄薄的脂肪层;----再加入15ml正己烷，用振荡器振荡5min除去脂肪 5、向均质液中加入0.5ml浓盐酸振荡1h; 6、称取6.0g?0.05 g均质物(相当于1.0g组织样本)至10ml聚苯乙烯离心管中; 7、以下步骤从(带有低脂肪的肝、肉等组织)回收的第一个离心步骤开始进行处理; 8、再用RIDA C18 柱以下列方式纯化(要严格控制过柱时的流速) 8.1 用3ml甲醇洗涤柱子，流速为1滴/秒; 第 4 页 共 8 页 8.2 用2ml pH3.0 50mM磷酸二氢钾缓冲液(见配液2)洗涤柱子; 8.3 样本进柱(组织样本的全部上清液，15滴/分钟); 8.4 用2ml pH3.0 50mM磷酸二氢钾缓冲液(见配液2)洗涤柱子; 8.5 用正压去除残留的液体并且用空气或氮气吹2min，干燥柱子; 8.6 用1ml甲醇洗脱样本，流速为15滴/分钟; 8.7 于50,60?的弱空气或氮气流下完全蒸发溶剂; 8.8 用1ml去离子水溶解干燥的残留物; 8.9 取20,l用于分析。 (五)、饲料 1、用研钵研碎饲料样本，称取2.0?0.05g研碎的样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入2ml 1M 盐酸溶液(见配液5)，加入16ml去离子水用均质器进行均质; 2、用涡旋仪涡动3min，放振荡器上振荡15min; 3、3000g以上，离心20min，转移出全部上清液至10ml聚苯乙烯离心管中，并加入2ml 1M氢氧化钠溶液(见配液6)混合均匀，检查pH值是否在6.5-7.5之间;(用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH值); 4、3000g以上，离心20min，取100,l上清液至2ml干净的聚苯乙烯离心管中，加入900,l去离子水混合均匀; 5、取20,l用于分析。 (五)、牛奶 取100,l牛奶样本，加入400,l 4%氯化钠溶液(见配液8)，涡动混匀，取20,l用于分析。 八、检测步骤 (一)、测定前应须知: 1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温(20-25?)。 2、使用之后立即将所有试剂放回2-8?。 3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。 4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。 第 5 页 共 8 页 (二)、操作步骤: 1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20-25?)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8?。 3、洗涤工作液在使用前也需回温。 4、编号:将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并标准孔和样本孔所在的位置。 5、加标准品/样本/酶标二抗/抗体工作液:加入标准品/样本20,l 到对应的微孔中，随即加入酶标二抗50,l/孔，再加入抗体工作液80,l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25?避光环境中反应30min。 6、洗板:小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液(见配液10)250,l/孔充分洗涤4,5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破)。 7、显色:加入底物液A液50,l/孔，再加底物液B液50,l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，置25?避光环境中反应20min(见注意事项8)。 8、测定:加入终止液50,l/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定) 九、结果判定 结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与克仑特罗的含量成负相关。 1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。 例如样本1的吸光度值为0.301，样本2的吸光度值为0.712，标准品吸光度值分别是: 0ppb为1.952;0.1ppb为1.420; 0.3ppb为0.980; 0.9ppb为0.464; 2.7ppb为0.256; 8.1ppb为0.152。则样本1的浓度范围是0.9ppb-2.7ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中克仑特罗残留的浓度范围;样本2的浓度范围是0.3ppb-0.9ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中克仑特罗残留的浓度范围。 2、定量分析 (1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%， 第 6 页 共 8 页 即 B 百分吸光率×100% (%), B0 B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值;B—0ppb标准溶液的平均吸光度 0 (2)标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率为纵坐标，以克仑特罗标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克仑特罗的实际浓度。 3 样本稀释倍数 尿液样品稀释倍数:1 方法a处理的组织样品稀释倍数:1 方法b处理的组织样品稀释倍数:4 饲料样品稀释倍数:100 牛奶样品稀释倍数:5 十、检测方法灵敏度、准确度、精密度 1 试剂盒灵敏度:0.1ppb 2 样本最低检测限: 尿液 ……………………………………………… 0.1ppb 组织 方法(a) ……………………………………… 0.1ppb 方法(b) ……………………………………… 0.4ppb 高脂肪组织…………………………………… 0.1ppb 饲料…………………………………………………10ppb 牛奶…………………………………………………0.5ppb 3 准确度: 尿液 …………………………………………… 90?15% 第 7 页 共 8 页 组织 …………………………………………… 70?10% 饲料 ………………………………………………95?15% 牛奶 ………………………………………………80?20% 4 精密度:试剂盒的变异系数均小于10%。 十一、注意事项 1、室温低于20?或试剂及样本没有回到室温(20-25?)会导致所有标准的OD值偏低。 2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。 3、每加一种试剂前需要将其摇匀。 4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。 5、不要使用过了有效期的试剂盒;也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低;不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。 6、储存条件:保存试剂盒于2-8?，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 7、试剂变质的迹象:发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A<0.5 )时，表示试剂可能变质。 450nm 8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色20min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到25min(或更长)，但不得超过30min。反之，则减短反应时间。 9、该试剂盒最佳反应温度为25?，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。 第 8 页 共 8 页