甘草酸二铵原料药-质量研究资料10

甘草酸二铵原料药-质量研究资料1010、质量研究工作的试验资料及文献资料一、样品本公司试制的甘草酸二铵原料药三批:批号为。批量分别为804g，799g，802g。二、含量限度按干燥品计算，含CHNO应为97.0%,103.0%。4268216三、性状本品为应白色结晶性粉末;无臭，味甜取本品三批检查，结果见表1。表1甘草酸二铵外观检查结果批号白色结晶性粉白色结晶性粉白色结晶性粉性状末;无臭，味甜末;无臭，味甜末;无臭，味甜本品三批均符合规定。溶解度:本品在水中易溶，在乙醇中极微溶解，在氯仿或乙醚中几乎不溶。依法检查(中国药典2000年版二部凡例)，检查结果见表2。表2甘草酸二铵溶解度检查结果溶剂样品量(g)溶解情况结论水在1ml中未全溶，在10ml中溶解溶解0.98176乙醇在10ml中未全溶，在100ml中溶解极微溶解0.01019氯仿在100ml中未全溶几乎不溶0.00917乙醚在100ml中未全溶几乎不溶0.01023本品三批均符合规定。四、鉴别1.取本品约0.5g，加稀盐酸4ml与水6ml，煮沸10分钟，放冷，滤过，滤液备用。取沉淀用水洗涤至中性，105?干燥1小时，加乙醇10ml1使溶解，取乙醇溶液1ml，加10%2，6-二叔丁基对苯甲酚乙醇溶液0.5ml和20%氢氧化钠溶液1ml，至水浴上加热30分钟，液面应出现紫红色悬浮物。本品三批均呈正反应。2.取鉴别(1)项下的滤液1ml，加间苯二酚10ml和盐酸5滴,煮沸1分钟，放冷，加苯3ml，振摇，苯层即显紫红色。本品三批均呈正反应。3.取含量测定项下的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录?A)测定，在252nm的波长处于最大吸收。本品三批均符合规定。4.取本品约50mg，加水5ml使溶解，显铵盐的鉴别反应(中国药典2000年版二部附录?)。本品三批均呈正反应。五、检查1.有关物质1.1方法照高效液相色谱法(中国药典2000年二部附录?D)测定色谱条件及系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以0.02mol/L磷酸溶液(用三乙胺调节pH值至6.5)-乙腈(75:25)为流动相;检测波长为252nm。理论板数按甘草酸二铵峰计算应不低于1500。甘草酸二铵峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。测定法取本品适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含0.2mg的溶液，作为供试品溶液;精密量取适量，加流动相制成每1ml中约含2μg的溶液，作为对照溶液。取对照溶液10μl注入液相色谱仪进行预试，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20%,25%;再取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍，供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，量取各杂质峰面积的总和不得大于对照溶液主峰面积的10倍(10%)。1.2.1检测波长的确定2取本品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含有甘草酸二铵40μg/ml的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录?A)，测定结果见附图9，同法测定中间体?(7β-氨基-3-[3-甲酰氨基-2-(2-甲酰氧基乙基)-1-吡唑鎓基]甲基-3-头孢烯-4-羧酸双三氟乙酸盐)、中间体?(7β-氨基-3-[3-氨基-2-(2-羟乙基)-1-吡唑鎓基]甲基-3-头孢烯-4-羧酸盐酸盐)、中间体?′(1-[(Z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-2-甲氧基亚氨基乙酰基]苯并三氮唑-3-氧化物)紫外最大吸收波长分别为258nm、255nm、257nm，见附图10,12，可见以上中间体在252nm的波长处均有较大吸收，故选择检测波长为252nm。1.2.2系统专属性试验取流动相20μl，依法测定，HPLC图谱见图13。1.2.2系统适用性试验取甘草酸二铵适量，依法测定，HPLC图谱见图14，按甘草酸二铵峰计算，理论板数为6317，甘草酸二铵峰与相邻杂质峰的分离度为2.21。1.2.3耐用性试验照有关物质检查方法，改变流动相组成及流速，进行耐用性试验，结果见表7(其中水相是:0.02mol/L磷酸溶液，用三乙胺调节pH值为6.5)，HPLC图谱见图15,19。表7甘草酸二铵有关物质检查耐用性试验结果流动相组成流速(ml/min)理论板数分离度水相乙腈75251.084902.3175250.981502.2675251.187782.4076241.082712.2274261.085062.06结果表明:本方法流动相组成及流速发生一定改变时，理论板数及3主成分峰与最近杂质峰的分离度均符合规定，说明本方法耐用性良好。1.2.4.破坏性试验1.2.4.1酸性破坏试验取本品约20mg，加0.1mol/L盐酸20ml，回流0.5小时，冷至室温，调节pH值为中性，依法测定，HPLC图谱见图20。由图可见，本品经酸性破坏后，甘草酸二铵峰与各主要分解产物峰均可分开，最小分离度为4.52。1.2.4.2碱性破坏试验取本品约20mg，加0.1mol/L氢氧化钠20ml，回流15分钟，冷至室温，调节pH值为中性，依法测定，HPLC图谱见图21。由图可见，甘草酸二铵峰与各主要分解产物峰均可分开，最小分离度为8.89。1.2.4.3氧化破坏试验取本品约20mg，加30%过氧化氢溶液20ml，回流15分钟，冷至室温，依法测定，HPLC图谱见图22。由图可见，本品经氧化破坏后，甘草酸二铵峰与各主要分解产物峰均可分开，最小分离度为2.61。1.2.4.4高温破坏试验取本品适量，置170?烘箱中烘烤2小时后，冷至室温，加流动相使溶解，依法测定，HPLC图谱见图23。由图可见，本品经热破坏后，甘草酸二铵峰与各主要分解产物峰均可分开，最小分离度为8.90。1.2.4.5光破坏试验取本品约20mg，置强光照下照射2天，加流动相使溶解，依法测定，HPLC图谱见图17。由图可见，甘草酸二铵峰与各杂质峰均可分开，与相邻杂质峰的最小分离度为2.0。1.2.5中间体及粗品的检测取本品合成过程中的中间体?、中间体?、中间体?′及甘草酸二4铵粗品，依法测定，HPLC图谱见图24,27。由图可见，中间体?、中间体?、中间体?′峰的保留时间与甘草酸二铵峰的保留时间不同，与甘草酸二铵峰可以分开。甘草酸二铵粗品中主峰与各个杂质峰均可实现基线分离，最小分离度为7.71。1.2.5检测限的测定精密称取甘草酸二铵对照品及中间体?、中间体?、中间体?′各适量，加流动相溶解并制成适宜浓度的溶液，作为供试品溶液，依法测定。同时测定检测器的基线噪音，取信噪比为3:1时的进样量作为检测限，HPLC图谱见图28,31。由图可得，甘草酸二铵、中间体?、中间体?、中间体?′的检测限分别为0.2ng、0.5ng、0.3ng、0.8ng。1.2.6检查结果取本品三批进行检查，结果见表8，HPLC图谱见图32,37。表8甘草酸二铵有关物质检查结果批号031225031226031227总杂质(%)2.酸度取本品0.1g，加水10ml使溶解，依法测定(中国药典2000年版二部附录?H)，pH应为4.0,5.0。表11甘草酸二铵酸度检查结果批号4.34.44.3酸度结果表明，本品三批均符合规定。3.溶液的澄清度与颜色取本品1.0g，加水10ml，加热使溶解后，溶液应澄清无色;如显色，与黄色3号标准比色液(中国药典2000年版二部附录?A)比较，不得5更深。表9甘草酸二铵溶液的澄清度与颜色检查结果批号溶液的澄清度符合规定符合规定符合规定溶液的颜色符合规定符合规定符合规定结果表明，本品三批均符合规定。4.干燥失重取本品，在80?减压干燥至恒重，减湿重量不得过5.0%(中国药典2000年版二部附录?I)表10甘草酸二铵干燥失重检查结果批号3.62.93.1干燥失重(%)结果表明，本品三批均小于5.0%。5.炽灼残渣取本品1.0g，依法检查(中国药典2000年版二部附录?N)，遗留残渣不得过0.2%。取本品三批进行检查，结果见表12。表12甘草酸二铵炽灼残渣检查结果批号炽灼残渣(%)0.060.080.07结果表明，本品三批均符合规定。6.重金属取炽灼残渣项下遗留的残渣，依法检查(中国药典2000年版二部附录?H第二法)，含重金属不得过百万分之十。取本品三批进行检查，结果见表13。6表13甘草酸二铵重金属检查结果批号重金属(ppm)<10<10<10结果表明，本品三批均符合规定。7.硫酸盐取本品0.5g，加稀盐酸5ml与水10ml，加热10分钟，放冷滤过，残渣用少量水洗涤二次，合并洗涤液和滤液，用氨试液中和，滤液如显色，加过氧化氢试液1ml，水浴加热10分钟，滤过，滤液用少量水洗涤二次，合并洗液和滤液，至50ml纳氏比色管中，依法检查(中国药典2000年版二部附录?B)，如发生浑浊，与标准硫酸钾溶液1.0ml制成的对比液比较，不得更浓(0.02%)。表13甘草酸二铵重金属检查结果批号硫酸盐<0.02%<0.02%<0.02%结果表明，本品三批均符合规定。8.砷盐取无水碳酸钠1g，铺于坩埚底部与四周，再取本品1.0g，置无水碳酸钠上，用少量水湿润，干燥后，先用小火灼烧使炭化，再在500,600?炽灼使完全灰化，放冷，小心滴加稀盐酸5ml，使残渣溶解，蒸干，加水5ml溶解，加盐酸5ml与水18ml，依法检查(中国药典2000年版二附录?J第一法)，应符合规定(0.0002%)。7表13甘草酸二铵砷盐检查结果批号砷盐符合规定符合规定符合规定9.细菌内毒素9.1方法:中国药典2000年版二部附录?E。9.2供试品细菌内毒素限值(L)的确定临床剂量为每次30ml，用10%葡萄糖注射液250ml稀释后。静脉滴注M=30/(1.5×50)=0.40ml/kg/hr，则L=K/M=5/0.40=12.5EU/ml。9.3干扰试验9.3.1试验材料9.3.1.1鲎试剂LotNo0310210λ=0.125EU/ml规格:0.1ml/支湛江安度斯生物有限公司生产LotNo031018λ=0.125EU/ml规格:0.1ml/支湛江海洋生物制品厂9.3.1.2细菌内毒素工作标准品LotNo0310010效价:10EU/支湛江安度斯生物有限公司生产9..3.1.3细菌内毒素检查用水LotNo20031031规格:5ml/支湛江安度斯生物有限公司生产9.3.1.4其他玻璃实验用具均在250?灭菌2小时后使用。9.3.2实验条件:水浴温度(37?1)?保温时间(60?2)min。9.3.3鲎试剂灵敏度复核试验按照中国药典2000年版二部附录?E细菌内毒素检查法，对所用鲎8试剂的灵敏度进行复核，结果见表14。表14鲎试剂灵敏度复核试验结果内毒素浓度(EU/ml)TAL批号标示灵敏度(λ)λc0.250.1250.06250.03125NC0310180.125EU/ml++++++++++++------0.125EU/ml03102100.125EU/ml++++++++++++------0.125EU/ml从试验结果可以看出，我们所选用的鲎试剂灵敏度均符合规定。9.4干扰预试验甘草酸二铵最小有效稀释浓度(缩写MVC)按公式MVC=λ/L，λ为鲎试剂标示灵敏度，L为甘草酸二铵的细菌内毒素限值，目前市售鲎试剂灵敏度λ最低在0.03EU/ml，则甘草酸二铵的最低有效稀释浓度为0.012mg/ml，将甘草酸二铵用内毒素检查用水分别稀释最终浓度为:10、2、0.5、0.1、0.012mg/ml，将此系列溶液记为NPC，同时在上述试验液中加入标准细菌内毒素溶液，使每一浓度试验液中均含有2λ浓度的细菌内毒素，记此系列溶液为PPC，取标示灵敏度为0.125EU/ml的不同厂家的鲎试剂，分别与上述NPC和PPC进行反应，每一浓度重复2管，并设阳性和阴性对照。其中NPC出现阳性或PPC出现阴性则表示有干扰影响，结果见表15、表16。表15甘草酸二铵干扰预试验(安度斯)20.50.1干扰浓度100.012NCNPC------------反应结果PPC----++++++++表16甘草酸二铵干扰预试验(海洋生物)20.50.1干扰浓度100.012NCNPC------------反应结果PPC----++++++++由以上预干扰试验结果可以初步了解:甘草酸二铵对内毒素与鲎试9剂反应存在干扰，当甘草酸二铵浓度在0.5mg/ml以下可排除干扰作用，且不同厂家的鲎试剂反应结果完全一致。9.5正式干扰试验为了最终确认是否存在抑制因素的影响，特进行如下正式干扰试验。取甘草酸二铵用细菌内毒素检查用水进行稀释，使其最终干扰试验浓度为0.5mg/ml，按中国药典2000年版二部附录中的细菌内毒素供试品干扰试验进行，结果见表17、表18。表17甘草酸二铵干扰试验(安度斯)内毒素浓度(EU/ml)样品批号0.250.1250.06250.03125NCEtEs030109++++++++----------0.125EU/ml030115++++++++----------0.125EU/ml030121++++++++----------0.125EU/ml水溶液++++++++----------0.125EU/ml表18甘草酸二铵干扰试验(海洋生物)内毒素浓度(EU/ml)样品批号0.250.1250.06250.03125NCEtEs030109++++++++----------0.125EU/ml030115++++++++----------0.125EU/ml030121++++++++----------0.125EU/ml水溶液++++++++----------0.125EU/ml正式干扰试验结果可以再次确认:甘草酸二铵用鲎试剂检测在稀释浓度0.5mg/ml时无干扰因素的影响。取样品三批进行测定，结果均符合规定。四、含量测定(一)分光光度法1.方法照分光光度法(中国药典2000年版二部附录?A)测定。10测定法取本品，精密称定加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含40μg的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录?A)测定，在252nm的波长处测定吸收度。另取经105?干燥至恒重的烟酰胺对照品，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含20μg的溶液，在261nm的波长处测定吸收度，乘以1.898。即得甘草酸二铵含量。2.方法学研究2.1精密度试验取烟酰胺对照品适量，精密称定，用水溶解并稀释制成1ml中约含烟酰胺20μg的溶液，依法测定，重复6次，结果见表21。表21含量测定精密度试验结果浓度吸光度A?SDRSD(%)10.49620.49230.5040.495?0.012.0240.48950.49760.490结果表明，本方法的精密度良好。2.2溶液的稳定性考察取上述供试品溶液，于不同时间取样，依法测定，结果见表22。表22溶液稳定性试验结果RSD(%)时间(小时)吸光度A?SD00.48820.4920.493?0.0142.030.49860.50280.487由表可见，供试品溶液的稳定性符合测定要求。112.3线性范围的测定精密称取烟酰胺对照品适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含烟酰胺0.4mg的溶液，精密量取4.0、4.5、5.0、5.5、6.0ml，分别置于100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录?A)，记录吸光度，绘制工作曲线，结果见表23，工作曲线见图68。表23含量测定方法线性范围测定结果序号浓度(μg/ml)吸光度A10.39516.0320.44618.0430.49420.0440.54622.0450.59824.05以浓度C(μg/ml)对峰面积,进行线性回归，得回归方程为:,,0.0252,-0.0102r,0.9999结果表明:烟酰胺的浓度在16,24μg/ml范围内，线性关系良好。说明本方法线性范围符合测定要求。2.4回收试验取甘草酸二铵约32mg、40mg、48mg，精密称定，用水溶解并稀释制成每1ml中约含0.32mg、0.40mg、0.48mg的溶液，精密量取各溶液10ml分别置于100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，依法测定，计算回收率，结果见表19。12表19注射用头孢尼西钠含量测定方法的回收试验结果比例加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)?SDXRSD(%)32.8832.5599.0031.4231.3699.7899.51?0.4280,0.4232.3732.1099.1632.6932.70100.0133.2532.7798.5641.3240.8998.9641.4641.1999.3599.52?0.430.43100,40.6540.4499.4840.9540.8199.6741.3641.41100.1348.9848.7899.6148.2248.34100.250.4699.60?0.46120,48.6748.4199.4648.5448.0498.9747.7547.5999.68结果表明，甘草酸二铵浓度在32,40μg/ml范围内，回收率好，可作为本品的含量测定方法。3.测定结果取本品三批依法测定，见结果见表24。表24甘草酸二铵含量测定结果批号030109030115030121含量(%)(二)高效液相色谱法1.方法照高效液相色谱法(中国药典2000年二部附录?D)测定色谱条件及系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以0.02mol/L磷酸溶液(用三乙胺调节pH值至6.5)-乙腈(75:25)为流动相;检测波长为252nm。理论板数按甘草酸二铵峰计算应不低于1500。甘草酸二铵峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。测定法取本品适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制成每1ml13中约含0.2mg的溶液，作为供试品溶液;精密量取适量，加流动相制成每1ml中约含2μg的溶液，作为对照溶液。取对照溶液10μl注入液相色谱仪进行预试，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20%,25%;再取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍，供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，量取各杂质峰面积的总和不得大于对照溶液主峰面积的10倍(10%)。2.方法学研究2.1精密度试验取甘草酸二铵对照品适量，精密称定，用水溶解并稀释制成1ml中约含甘草酸二铵0.2mg的溶液，依法测定，重复6次，结果见表21。表21含量测定精密度试验结果浓度峰面积A?SDRSD(%)123456结果表明，本方法的精密度良好。2.2溶液的稳定性考察取上述供试品溶液，于不同时间取样，依法测定，结果见表22，HPLC图谱见图58,62。表22溶液稳定性试验结果RSD(%)时间(小时)峰面积A?SD0241468由表可见，供试品溶液的稳定性符合测定要求。2.3线性范围的测定精密称取烟酰胺对照品适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含甘草酸二铵0.4mg的溶液，精密量取4.0、4.5、5.0、5.5、6.0ml，分别置于10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积，绘制工作曲线，结果见表23，HPLC图谱见图63,67，工作曲线见图68。表23含量测定方法线性范围测定结果序号浓度(μg/ml)吸光度A12345以浓度C(μg/ml)对峰面积,进行线性回归，得回归方程为:,,41.722,+9.8782r,0.9999结果表明:甘草酸二铵的浓度在0.16,0.24mg/ml范围内，线性关系良好。说明本方法线性范围符合测定要求。2.4回收试验取甘草酸二铵约32mg、40mg、48mg，精密称定，用水溶解并稀释制成每1ml中约含0.32mg、0.40mg、0.48mg的溶液，精密量取各溶液5ml分别置于100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，依法测定，计算回收率，结果见表19。15表19注射用头孢尼西钠含量测定方法的回收试验结果比例加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)?SDXRSD(%)80,100,120,结果表明，甘草酸二铵浓度在0.16,0.24mg/ml范围内，回收率好，可作为本品的含量测定方法。3.测定结果取本品三批依法测定，见结果见表24。表24甘草酸二铵含量测定结果批号030109030115030121含量(%)从试验结果可知，HPLC法与分光光度法测定本品含量结果基本一致，考虑到HPLC法操作较分光光度法精确，因此我们确定HPLC法作为本品的含量测定方法。五、参考文献16