急性呼吸道感染患儿人类博卡病毒检测与分析

急性呼吸道感染患儿人类博卡病毒检测与分析 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 急性呼吸道感染患儿人类博卡病毒检测 与分析 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 作者,伍严安 曾秀雅 周建林 付希 陈发林 陈发文 【摘要】 目的 探讨人类博卡病毒,HBoV,与儿童急性呼吸道感染(ARTI)的关系。 方法 RTPCR检测2006年11月-2008年4月连续2个冬春季儿科418例呼吸道感染鼻咽分泌物标本的HBoV。 结果 HBoV阳性率为5.0%(21/418)。阳性者年龄在4月,5岁。下呼吸道感染HBoV阳性率11.1%(17/153)显著高于上呼吸道感染的1.5%(4/265)(χ2=18.741,P0.001)。 结论 HBoV是本地区冬春季儿童呼吸道感染、尤其是下呼吸道感染的的重要病原之一。 【关键词】 呼吸道感染; 急性病; 聚合酶链反应; 细小病毒B19, 人; 细小病毒科感染, 福州 呼吸道感染是儿童高发病率和死亡率的主要原因之一。目前尚有1/3急性呼吸道感染,acute respiratory tract infections,ARTI,病因不明。2005年,Allander等从呼吸道感染的婴幼儿标本中分离到一种新的单链无胞膜DNA病毒,经基因序列发现其属于细小病毒科,将 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 其暂命名为人类博卡病毒,Human Bocavirus, HBoV,[1]。 为探讨HBoV与呼吸道感染的关系,以及了解HBoV在福州地区的流行情况,本研究对福州地区ARTI婴幼儿进行HBoV检测并做分析,现报告如下。 1 对象与方法 1.1 对象 1.1.1 研究对象 收集2006年11月-2007年5月及2007年11月-2008年4月连续2个冬春季节笔者医院儿科ARTI患儿咽拭子或鼻咽吸出物标本,共418例。其中门诊264例,住院154例,男性264例,女性154例,男女比例为1.71?1。年龄15 d,14岁,年龄中位数为2.2岁。2006年11月-2007年5月上呼吸道感染134例,下呼吸道感染89例。2007年11月-2008年4月上呼吸道感染131例,下呼吸道感染64例。下呼吸道感染的临床诊断包含支气管炎、支气管肺炎、毛细支气管炎、哮喘等。门诊患儿咽拭子采集时间在发病2 d,未使用任何抗病毒药物之前。住院患儿于入院当天或第2天采集。急性呼吸道感染的临床诊断标准参照文献[2]。 1.1.2 主要试剂及仪器 病毒核酸提取试剂盒[法国生物梅里埃公司,Biomerieux,],Ex Taq DNA聚合酶、dNTP,日本TaKaRa公司,,DNA Marker,北京天庚公司,。基因扩增仪(杭州博日公司)。 1.1.3 引物 根据文献[3]HBoV NP1基因引物,354 bp,,由大连宝生物公司合成。 P1,5’GACCTCTGTAAGTACTATTAC3’ DOC格式论文,方便您的复制修改删减 P2,5’CTCTGTGTTGACTGAATACAG3’ 1.2 方 法 1.2.1 病毒DNA提取 将采集的咽拭子洗涤入装有大约0.5 mL病毒保护液(含200 U/mL青霉素、200 U/mL链霉素、200 U/mL两性霉素B及0.125%BSA)的EP管中,鼻咽吸出物标本取1 mL加入含有约1 mL的病毒保护液EP管中,置漩涡振荡器上充分振荡混匀,反复冻溶2次后离心取上清液。按照病毒核酸提取试剂盒说明书操作。 1.2.2 PCR反应 10×Buffer,含Mg2，,2.5 μL,dNTPMix (2.5mmol/L) 2 μl,引物浓度为0.4 μmol,cDNA模板1 μL,ExTaq DNA聚合酶0.625 U,加双蒸水至终体积25 μL。PCR反应条件,95 ? 5 min?95 ? 30 s?56 ? 45 s?72 ? 45 s,扩增35个循环,72 ?延伸8 min。扩增产物以含0.5 μg/mL Goldview的1.5,琼脂糖凝胶电泳进行检测,紫外灯下观察结果。以生理盐水为阴性对照。以最初检测到并经测序证实的HBoV阳性标本为阳性对照。 1.2.3 DNA测序 PCR产物送大连宝生物公司测序。 1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计学处理,采用ChiSquare(X2),P0.05为差别有统计学意义。 2 结 果 2.1 PCR产物电泳结果 图1为PCR检测HBoV产物电泳结果,阳性产物于354 bp处可见清晰条带,与预期结果相符。 2.2 HBoV测序结果 对两个冬春季的HBoV 扩增产物各抽取3份 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 行DNA测序,结果显示6份扩增产物的核苷酸序列完全一致,与GeneBank中瑞典的HBoV原型株Stockholm 1,st1,DQ000495,与Stockholm 2,st2,DQ000496,一致性为99,,氨基酸同源性为100,。与北京的DQ353697,BJ3124,与DQ353699,BJ3846,序列一致性为100,。暂将其命名为FJ074115。HBoV扩增产物测序结果见图2。 M,100 bp DNA Marker, 1,HBoV阳性标本, 2,阴性对照. 2.3 系统进化树分析结果 系统进化树分析显示人类细小病毒B19自成一簇,HBoV成一簇。FJ074115与瑞典原型株Stockholm 1,st1,DQ000495,、Stockholm 2,st2,DQ000496,,北京株DQ353697,BJ3124,、DQ353699,BJ3846,、BJ3064(DQ988934)亲缘关系相近,图3,。 NC000883,人类细小病毒B19,EF450717,香港,FJ074115:福建,DQ988934、DQ353697、DQ353699,北京,DQ296635,日本,DQ00495、DQ00496:瑞典的两株原型株. 图3 HBoV NP1基因部分DNA序列进化树分析 Fig 3 Phylogenetic tree analysis for HBoV based on the NP1 gene DNA sequence2.4 病毒检出结果及临床分析 418例中,检出HBoV阳性21例(5.0%)。其中第1个冬春季9例,9/223,4%,,第2个冬春季12例(12/195,6.2%)。21例阳性者中,男性15例,女性6例,男?女=2.5?1。阳性者年龄在4月,5岁。各年龄组阳性率从高到低依次为,,5月组6.3%(2/32,,5月,1岁组8.5%,6/71,, DOC格式论文,方便您的复制修改删减 ,1,2岁组6.6%,4/61,, ,2,3岁组6.3%,5/79,,,3,4岁组4.3%,3/69,,,4,5岁组2.4%,1/41,,,5岁组65例中均未检出阳性者。阳性者中年龄最小者4月,最大者5岁。HBoV阳性患者的主要临床现为,咳嗽17例,81.0%,,咽红17例,81.0%,,发热13例,61.9%,,流涕6例,28.8%,。 下呼吸道感染者HBoV检出率11.1%,17/153,,显著高于上呼吸道感染的1.5%(4/265)(χ2=18.741,P0.001)。下呼吸道感染患儿中,HBoV在以下各常见病的检出率为,支气管炎11.5%(3/26),支气管肺炎11.5%(11/96),毛细支气管炎10.5%(2/19),哮喘8.3%(1/12)。冬春季各月份HBoV检出率详见表1。表1 2006年11月-2008年4月冬春季各月份ARTI患儿鼻咽标本HBoV检出率 3 讨 论 本研究首次在本地区ARTI患者中检测到HBoV。实验中PCR产物经测序显示与GeneBank的HBoV代表株序列一致性达99,,100,,证明所检测到的病毒确为HBoV。 国外报道,HBoV在呼吸道感染儿童标本中检出率为1.5%,11.3% [2,48]。而在正常儿童的呼吸道标本中未检出HBoV[4]。国内的赵林清等报道北京地区2003年11月,2004年2月ARTI患儿标本中HBoV阳性检出率为4.1,[9]。本研究连续2个冬春季对福州市ARTI患儿进行检测,HBoV阳性率分别为4.0%与6.2%,平均5.0%,与美国的5.2%及北京的4.1%接近[4,9],同时也说明HBoV同样是本地区ARTI儿童重要的病毒病原之一。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 HBoV感染多见于,5岁的婴幼儿,高峰年龄在6月,2岁[39]。有作者认为在,5月的婴儿中很少检测到HboV,可能与母传抗体的保护作用有关[5,9],但亦有报道18 d的新生儿感染HBoV[8]。本研究中,所有HBoV阳性者均,5岁,其中5月的患儿1例,4月患儿2例。,4月的患儿中未检出HBoV。?5月的婴儿感染HboV也并不罕见,值得注意。 多个国家和地区的流行病学研究显示,HBoV主要在冬春季流行。Allander等在长达1年的研究中,检测了540例标本,17例阳性(3.1%),其中16例发生在2003年12月,2004年4月[1]。美国Kesebier等对,2岁儿童全年的研究显示1,3月和10,11月这两段时间是HBoV的发病高峰,而在5,8月未发现HBoV阳性的标本[4]。英国Manning等报道,在11月和12月HBoV阳性的标本较多[5]。德国Weissbrich等报道,HBoV感染全年可见,冬季为高峰季节[8]。本研究从2006年10月-2008年4月连续两个冬春季的检测显示,第1个冬春季的2006年12月-2007年4月检测到HBoV,1月份为高峰(10%),第2个冬春季的2007年10月-2008年2月检测到HBoV,10月份为高峰(10.5%)。这提示HBoV在同一地区不同年份冬春季流行时间及高峰月份可有不同。 本研究中21例HBoV感染者中有81.0%(17例)见于下呼吸道感染,并且在下呼吸道感染检出阳性率显著高于上呼吸道感染(P0.05),这与文献报道HBoV感染多见于下呼吸道感染一致[1,5,7]。本研究中,HBoV引起的支气管炎、支气管肺炎、毛细支气管炎等常见下呼吸道 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 感染疾病分别占相应疾病组的11.5%、11.5%与10.5%,提示HBoV是这些下呼吸道感染的常见病原。Allander等曾报道HBoV可能是导致儿童支气管哮喘发作的病原之一[10]。本研究也在1例支气管哮喘患儿中检出HBoV,提示临床分析支气管哮喘原因时应考虑到HBoV感染。 HBoV是一个新近发现的呼吸道病毒,临床重要性仍在进一步探讨中。本研究在我国东南沿海地区儿童ARTI呼吸道标本中检测到 HBoV,这对完整本地区儿童ARTI的病毒病原谱是很好的补充。建议临床儿科对常见呼吸道病原检查阴性的ARTI患儿给予常规检查HBoV,以利明确病原诊断,指导治疗。 【参考文献】 [1] Allander T, Tammi M T, Eriksson M, et al,Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples [J]. 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