包裹NR2B重组质粒免疫脂质体的制备及其特征分析

包裹NR2B重组质粒免疫脂质体的制备及其特征分析 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 包裹NR2B重组质粒免疫脂质体的制备 及其特征分析 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 作者,施勇, 吴庆婷, 朱海艳, 李厚达 【摘要】 目的: 制备包裹pcDNA3.1NR2B重组质粒的免疫脂质体。: 采用逆相蒸发法, 制备含pcDNA3.1NR2B质粒的脂质体, 并与小鼠抗大鼠转铁蛋白受体的单克隆抗体,mAb OX26,相连, 形成免疫脂质体, 并对其形态结构、 粒径、 包封率及偶联抗体的分布进行初步检测研究。结果: 所获得的免疫脂质体近球形、 平均粒径低于100 nm、 包封率达30.4%、 偶联抗体呈均匀分布。结论: 成功地制备了免疫脂质体, 为应用于体内试验奠定了基础。 【关键词】 NR2B 免疫脂质体 特征 脂质体是由一层或多层同心的脂质双分子膜包封而成的球状体, 可以延长包裹物的作用时间、 降低毒性, 具有一定的靶向性[1, 2]。免疫脂质体则是一种表面结合有抗体或抗体片段等物质的脂质体, 具有主动靶向的功能[3, 4], 为抗肿瘤和基因治疗提供了新的思路[5]。本研究中采用逆相蒸发法将真核表达质粒pcDNA3.1NR2B有效地 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 包封在脂质体中, 形成纳米级颗粒, 并且与小鼠抗大鼠转铁蛋白受体的单克隆抗体,mAb OX26,相连, 形成免疫脂质体, 并对其形态结构、 粒径、 包封率、 及偶联抗体的分布和数目进行了初步检测。 1 材料和方法 1.1 材料 pcDNA3.1NR2B重组质粒由本室保存; POPC(1palmitoyl2oleoylsnglycerol3phosphocholine)、 Distearoyl phosphatidylethanolamine (DSPE)PEG2000、 DSPEPEG2000maleimide购自Avanti公司; DDAB(didodecyldimethylammonium bromide)购自Fluka公司; 薄膜挤出器购自Avestin公司; 旋转蒸发仪购自巩义予华公司; Sepharose CL4B为Pharmacia公司产品; 限制性内切酶购自Fermentas公司; 质粒小量提取试剂盒购自VGENE公司; DNaseI和exonuclease III购自TaKaRa公司; 质粒大量提取试剂由孙怀昌教授馈赠; 其他试剂为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 重组质粒pcDNA3.1NR2B的扩增制备 用质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA, 经BamH I酶切鉴定。将菌种大量培养, 大量提取质粒DNA。经10 g/L琼脂糖电泳检测其纯度, 并用紫外分光光度计测定其A260/A280值, 根据A260/A280比值估算其纯度, 根据公式DNA浓度=A260×50 mg/L×稀释倍数, 计算其质量浓度。 1.2.2 免疫脂质体的合成及抗体的偶联 采用逆相蒸发法将POPC、 DDAB、 DSPEPEG2000及 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 DSPEPEG2000maleimide按一定比例溶解于氯仿中, 用旋转蒸发仪蒸发除去有机溶剂, 置水浴超声波仪处理5 min, 加入一定量质粒DNA在42?水浴和干冰中反复冻融, 并连续几次通过100 nm薄膜挤出器, 未包裹入脂质体的质粒用DNaseI和exonuclease III 37?作用1 h, EDTA终止反应, 琼脂糖CL4B柱分离包裹质粒DNA的脂质体和被核酸酶降解的DNA, 琼脂糖凝胶电泳检测。mAb OX26经修饰巯基化后与包裹质粒DNA的脂质体室温下轻摇连接过夜, 再次用琼脂糖CL4B柱分离未连接的抗体和免疫脂质体。 1.2.3 脂质体的形态结构和粒径观察 取适量脂质体用3 g/L磷钨酸负染, 再滴至专用铜网上, 自然风干, 用透射电子显微镜观察脂质体的形态结构和大小。 1.2.4 免疫脂质体的特征分析 将收集到的未连接的抗体和免疫脂质体分别包被板子, 以HRP标记的羊抗小鼠IgG为一抗做直接ELISA实验, 以确定免疫脂质体是否已连接上抗体; 用5 g/L SDS破坏免疫脂质体的膜表面结构, 对其释放内部包裹的物质进行琼脂糖凝胶电泳观察; 同时将免疫脂质体与10 nm胶体金标记的抗小鼠IgG在0.018 mol/L TrisCL,pH,8,, 3 g/L BSA, 170 mL/L甘油缓冲液中孵育1 h, 直接在透射电子显微镜下观察, 通过与mAb OX26特异性结合的抗小鼠IgG上胶体金的显色, 间接确定免疫脂质体上连接的抗体数目和分布。 2 结果 2.1 质粒DNA的提取 小量提取的pcDNA3.1NR2B质粒经 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 酶切电泳鉴定其相对分子质量(Mr)约为9800 bp, 与预计相符。大量提取的质粒DNA经电泳和紫外分光光度计测定, 其质量浓度约1.2 g/L, A260/A280比值约为1.89, 表明提取的质粒DNA纯度较高。 2.2 透射电镜观察脂质体的形态结构及粒径分布 由透射电镜照片可见, 制备的脂质体为粒径均匀的球状或近球状的小囊泡; 粒径分布范围从30 nm至150 nm, 平均粒径低于100 nm,图1,。 图1 脂质体的电镜图,×100000,,略, 2.3 脂质体琼脂糖凝胶电泳分析 将相同质量的质粒, 经反复冻融的脂质体, 通过100 nm薄膜挤出器的脂质体以及经核酸酶消化的脂质体同时置于5 g/L琼脂糖凝胶中电泳, 紫外灯下观察。经过DNaseI和exonucleaseIII处理, 未包裹入的DNA已被分解, 而脂质体能够抵抗核酸酶的降解。 同时通过Gel pro analyzer 4.0 software软件比较凝胶图中DNA的条带亮度, 可以较为准确地算出总DNA量和未包裹入脂质体的DNA量,图2,, 根据包封率=,,总DNA量,未包裹入脂质体的DNA量,/总DNA量×,100%, 可得pcDNA3.1NR2B质粒的包封率大约为30.4%。 图2 脂质体的琼脂糖凝胶电泳,略, M: DL 15000 marker; 1: pcDNA3.1NR2B质粒; 2: 反复冻融后的脂质体; 3: 核酸酶消化后的脂质体. 2.4 琼脂糖CL4B柱的分离效果 由于脂质体比质粒大得多, DOC格式论文,方便您的复制修改删减 免疫脂质体又比抗体大, 所以可以通过凝胶过滤色谱将二者分离。将脂质体和免疫脂质体分别缓慢加入经平衡液处理过Sepharose CL4B柱(18 cm×20 cm), 流速0.15 mL/min, 前者收集到2个峰: ?峰较高, ?峰较矮, 与脂质体和被核酸酶降解后的质粒DNA分离结果相符合,图3,。后者也收集到2个峰: ?峰较高, ?峰较矮, 与免疫脂质体和未连接抗体分离结果相符合,图4,。 图3 脂质体的Sepharose CL4B柱分离图,略, 图4 免疫脂质体的Sepharose CL4B柱分离图,略, 2.5 免疫脂质体的鉴定及特征分析 将收集到的?峰和?峰加入5 g/L SDS, 混匀静置, 同时以未加入SDS的?峰和?峰收集液为对照, 置于5 g/L琼脂糖凝胶电泳中, 紫外灯下观察。SDS是一种去垢剂, 能够破坏脂质体的膜表面结构, 从而释放内部包裹的物质。从图5中可以知道?峰收集液为均一的免疫脂质体, 释放的质粒DNA也有一明亮的条带, 而?峰无内容物释放。由于SDS使质粒DNA带上了过多的负电荷, 故泳动速度较快,图5,。 图5 ?峰和?峰的琼脂糖凝胶电泳,略, M: DL 15000 Marker; 1: ?峰; 2: 加入SDS后的?峰内容物; 3: ?峰; 4: 加入SDS后的?峰内容物. 将收集到的?峰和?峰各分为2组倍比稀释包被板子, 做直接ELISA实验, 3峰和4峰都呈阳性反应, 从而说明收集到的3峰已连接上抗体, 4峰为未连上的抗体。通过上述几个实验证明了收集的? DOC格式论文,方便您的复制修改删减 峰溶液既包裹了质粒DNA, 表面又带有抗体, 是免疫脂质体; 4峰为未连接的抗体。 将免疫脂质体与直径10 nm胶体金标记的抗小鼠IgG反应后进行透射电镜观察, 免疫脂质体上的抗体能和抗小鼠IgG特异性结合, 胶体金呈均匀分布, 大约有6-12个胶体金包围着一个脂质体, 间接说明所偶联抗体也均匀分布在脂质体周围,图6,。 图6 免疫脂质体与10 nm胶体金标记抗鼠IgG透射电镜图,×250000,,略, 3 讨论 脂质体可以用来将多种物质(药物、 核酸等)转入到多种类型的细胞中, 也可作用在体内, 但缺少主动靶向性, 免疫脂质体通过所联抗体与受体分子的特异性, 专一地与靶细胞表面的互补分子相互作用, 使脂质体在靶区释放其包裹物质, 是一种更为先进的载体传递系统。 免疫脂质体经过了数代发展, 第1代是抗体直接与脂质体的脂膜相连, 但由于巨噬细胞的吞噬很快被血液清除, 第2代在脂质体的表面引入了聚乙二醇,PEG,, 延长了在血液中的时间, 但PEG的链太长, 影响了抗体与靶细胞的结合。为解决上述问题, 选择在PEG的末端偶联上抗体[6], 这也是本实验中所制备的第3代免疫脂 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 质体。N甲基D天冬氨酸(NMDA)受体是一种配体门控型离子通道, NR2B是其主要调节亚单位[7], 由1456个氨基酸序列组成, Mr为170000,180000, 其主要分布在突触后膜, 参与多种神经递质的作用。它被认为是神经元突触可塑性及大脑皮质和海马神经元长时增强效的主要调控者, 在学习、 记忆、 人类多种神经疾病等方面均有重要作用。 本研究中, 我们采用逆相蒸发法将国外脂质体原料POPC、 DDAB、 DSPEPEG2000、 DSPEPEG2000maleimide与NR2B的真核表达质粒有效地包封在脂质体中, 形成纳米级颗粒并且与小鼠抗大鼠转铁蛋白受体的mAb OX26相连, 形成免疫脂质体。已有文献报道注射包载β半乳糖激酶的OX26免疫脂质体后, 半乳糖激酶在大鼠脑内有较高的表达[8], 这些为进一步大量制备免疫脂质体, 并且应用于有关NR2B脑部基因治疗奠定了实验基础。 【参考文献】 [1] Edwards KA, Baeumner AJ. Analysis of liposomes[J]. 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