生物工艺学大三复习资料

生物工艺学大三复习资料 第一章 一般生物反应过程可分为四个部分: ,、发酵原料的预处理: 发酵原料是很丰富的，如薯类、谷类等，但许多工业微生物都不能直接利用这些发酵原料，通常需要将它们进行粉碎、蒸煮、水解成葡萄糖以供给微生物利用。还可以利用废糖蜜、工农业的下脚料。 ,、发酵过程的准备: 发酵前必须进行种子制备与无菌消毒。无菌消毒是种子制备与发酵的必要条件，一般在发酵前将发酵原料装入发酵罐中，通入98千帕的蒸汽高温灭菌，冷却后，在无菌条件下接入菌种。在发酵过程中要绝对保证无杂菌的污染，即没有目标微生物以外的微生物存在，这是发酵成功与否的关键，对于好氧性发酵，还需要通入无菌空气。 ,、生物反应器及反应条件的选择 由于使用的微生物不同，其代谢规律不一样，因而有厌氧发酵和好氧发酵两种方法。厌氧发酵亦称静置发酵，如酒精(alcohol)、啤酒(beer)、丙酮(acetone)丁醇(butanol)及乳酸(lactic acid)等均为厌氧发酵产品，其发酵设备不需供氧，所以设备和工艺都较好氧发酵简单。好氧发酵，顾名思义，就是微生物发酵过程中需要消耗大量的氧气，以供代谢需要。味精、赤霉素、土霉素等的生产都属此类。 ,、产品的分离与纯化(下游技术) 分离与纯化是从发酵液中制取符合质量指标的制品。 首先，将发酵液进行过滤、离心以除去固体杂质，然后采用吸附法、溶煤萃取法、离子交换法、沉淀法或蒸馏法等，对发酵液中的产品进行进一步的提炼，以得到符合要求的目标产品。 生物反应过程的特点: 1. 原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量有机和无机氮源。 2. 生物反应过程是以生命体的自动调节方式进行的，多个反应象一个反应一样，在单一设备中进行。 3. 能容易进行复杂的高分子化合物的生产，如酶、光学活性体。 4. 生产过程通常在常温下进行，操作温和，不考虑防爆问题，可能使一种设备有多种用途。 5. 能够高度选择性的进行复杂化合物在特定部位的反应，如氧化、还原、官能团的导入等。 6. 生产产品的生物体本身也是产物，富含维生素、蛋白质、酶等;除特殊情况外，培养液一般不会对人和动物造成危害。 7. 生产过程中需要注意防止杂菌以及噬菌体的污染。 时期中的小细节 青霉素的发现及其开发 1928年，英国，细菌学家弗莱明发现了点青霉产生的青霉素。链霉素是第一个能有效治疗结核病的药物 。链霉素 初级代谢产物和次级代谢产物的异同 第二章 微生物工业对菌种的要求 (1)原料廉价,生长迅速,目的产物产量高。 (2)易控制培养条件，发酵周期较短。 (3)抗杂菌和噬菌体的能力强。 (4)不易变异和退化，不产生任何有害物质和毒素。 目的微生物富集的一些基本方法 1、富集的目的:让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。 2、富集的三种:?定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。 ?当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑。 ?不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能通过随机分离的办法。 菌种选育的目的: 防止菌种退化 解决生产实际问题 提高生产能力 提高产品质量 开发新产品 自然选育:在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程。 自然突变:是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。 自然突变的两个原因:多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。 诱变育种的基本原理 理论基础:基因突变 突变:是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。 诱变育种:用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选。 诱变剂:能够提高生物体突变频率的物质。 诱变育种中应注意的问题 选择好出发菌株 复合诱变因素的使用 剂量选择 变异菌种的筛选 高产菌株的获得需要筛选条件的配合 紫外线:诱变的最有效波长是260nm左右(253~265)，处理菌的悬浮液，功率15W，距离30cm左右。 诱变机制:形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性，造成菌体变异甚至死亡 亚硝基胍(NTG):诱发营养缺陷型突变，诱发率可达到12%~80%，故有超诱变剂之称。 噬菌体的防治 正确判断，发酵中产生的异常现象 普及有关噬菌体的知识，使相关人员能够识别噬菌斑。 选育抗噬菌体的菌种 消灭噬菌体 收集和保存噬菌体 营养缺陷型:由于基因的突变，它失去了合成某种物质的能力，在基本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加 一定种类的有机物质后才能生长。 原生质体融合:把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹的球状 体(称原生质体)。两亲本的原生质体在高渗条件下使之混合，由聚乙二醇(PEG)作为助融剂，使它们相互凝集，发生细胞 融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。 DNA重组技术 DNA重组技术的基本过程 基本过程:是将一个含目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，并转入一受体细胞，使之扩增，表达的操作过程。 包括6个 (1)含目的基因DNA片段的准备方面 (2)载体 作为质粒的载体应符合以下要求: 在宿主细胞中能自主复制，即载体本身就是一个单独的复制子，相对分子量小; 有明显而方便的筛选标记，如抗性、黑色素基因等; 在基本复制区外具有较多的单一限制性内切酶的酶切位点; 最好在抗性基因或其他标记基因上有一个多克隆位点，以便利用插入失活的功能筛选重组子; 在宿主中能以多拷贝形式存在; 有利于被插入的外源基因表达，最好含有一个强启动子; 能在宿主中稳定的遗传; (3)含目的基因的DNA片段与载体相连接 (4)将重组分子送入受体细胞 (5)筛选出带有重组DNA分子的转化细胞 菌种保藏的意义 是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。 目的:?存活，不丢失，不污染; ?防止优良性状丧失; ?随时为生产、科研提供优良菌种。 菌种保藏原理: 菌种保藏主要是根据菌种的生理特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过 保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于休眠状态，抑制其繁殖力。 (1)斜面冰箱保藏法 短期、过渡的保藏方法。培养后放入4?冰箱保存。保存期为3~6个月。 缺点:容易发生遗传变异;连续传代可使一些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂菌。 (2)沙土保藏法 适合产孢子或芽胞的微生物。处理后放冰箱保存。保存期为一年左右。 原理:微生物生长需要水分，干燥法是使菌处于干燥条件下停止生长及处于休眠状态，达到较长期保藏的目的。 (3)菌丝速冻法 不产孢子或芽胞的微生物。-20?保藏。 (4)石蜡油封存法 向斜面上倒灭菌等石蜡油。保存期一年。保藏温度-4,4?。 原理:液体石蜡使菌处于生长和代谢停止状态，还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。 (5)真空冷冻干燥法 适用各种微生物，存活时间长、效果好保存期5年以上。需加入冻干保护剂。 优点:还具有体积小、不易污染、便于运输等优点，是一种用得最为广泛的菌种保藏方法。 (6)液氮超低温保藏法 保存温度-196 ?，长期保存。需加入冻干保护剂。 第三章 酶活性的调节:是指在酶分子水平上的一种代谢调节，它是通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率，包括酶活性 的激活和抑制两个方面。 酶活性调节的类型:包括酶活性的激活和抑制两个方面。 酶活性的激活:(简答)系指在分解代谢途径中，后面的反应可被较前面的中间产物所促进。 酶活性的抑制:(简答)主要是反馈抑制，它主要表现在某代谢途径的末端产物(即终产物)过量时，这个产物可反过来直 接抑制该途径中第一个酶的活性，促使整个反应过程减慢或停止，从而避免了末端产物的过多累积。 反馈抑制的类型 (1)直线式代谢途径中的反馈抑制 (2)分支代谢途径中的反馈抑制 a 同功酶调节 b 协同反馈抑制: c 合作反馈抑制 d 累积反馈抑制 e 顺序反馈抑制: 酶活性调节的机制: (1)共价修饰 定义:是指蛋白质分子中的一个或多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或解开，使其活性可以改变。 • 分类:可逆共价修饰 • 不可逆共价修饰(酶原激活) (2)变(别)构控制 效应物结合在酶的某一位点会影响另一配基对第二个位点的结合。这种可逆的相互作用机制称为变构活化或变构抑制。 效应物促进或抑制酶的反应速率，影响酶对基质的亲和力。 酶合成的调节 定义:通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制，这是一种在基因水平上的代谢调节。 凡能促进酶生物合成的现象，称为诱导。 能阻碍酶生物合成的现象，则称为阻遏。 酶的合成调节与酶的活性调节相比较 缺点:调节酶的合成是一类较间接而缓慢的调节方式。 优点:通过阻止酶的过量合成，有利于节约生物合成的原料和能量。 二者联系:在正常代谢途径中，酶活性调节和酶合成调节两者是同时存在且密切配合、协调进行的。 酶合成调节的类型:酶划分成组成酶和诱导酶两类。 酶的诱导合成类型: 同时诱导:即当诱导物加入后，微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成，它主要存在于短的代谢途径中。 顺序诱导:即先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。 (2)阻遏的类型(填空) 阻遏的类型主要有末端代谢产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。 次级代谢产物及特征 抗生素、色素、毒素、激素 特征:(1)不参与微生物的生长和繁殖。 (2)它的生产大多数是基于菌种的特异性来完成的。 (3)次级代谢产物发酵经历两个阶段，即营养增殖期和生产期。接种一定时间后细胞停止生长，进入到恒定期才开始活跃地合成抗生素，称为生产期。 (4)一般都同时产生结构上相类似的多种组分。 (5)生产能力受微量金属离子(Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Ni2+等)和磷酸盐等无机离子的影响。 (6)在多数情况下，增加前体是有效的。 (7)次级代谢酶的特异性不一定比初级代谢酶高。因此，如果供给与底物结构类似的物质，则可以得到与天然物不同的次级代谢产物。 (8)次级代谢产物的生物合成最少也要有一部分参与与质粒有关的代谢途径。 (9)培养温度过高或菌种移植次数过多，会使抗生素的生产能力下降。其原因可能是参与抗生素合成的菌种的质粒脱落之故。 (10)次级代谢在其一个系列当中与一个酶相对应的底物和产物也可以成为其他酶的底物。 第四章 培养基:广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。 发酵培养基的作用:满足菌体的生长，促进产物的形成 发酵培养基的要求:? 培养基能够满足产物最经济的合成。? 发酵后所形成的副产物尽可能的少。? 培养基的原料应因地制宜，价格低廉;且性能稳定，资源丰富,便于采购运输,适合大规模储藏，能保证生产上的 供应? 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等 培养基按其组成物质的纯度、状态、用途分类 按纯度 1 合成培养基 : 原料其化学成分明确、稳定。 适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律 缺点:培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产。 2 天然培养基: 采用天然原料(天然的动、植物产品) 优点:原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉; 适于工业化生产; 缺点:成分复杂，不易重复，原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性。 3 半合成培养基:既含有天然成分又含有纯化学试剂的培养基。 按状态分类 固体培养基 :适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产。 半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%,0.8% ,主要用于微生物的鉴定。 液体培养基:80%,90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。 按用途(从发酵生产应用考虑) 1.孢子培养基 spore media 要求:使菌体迅速生长，产生较多的优质孢子，不易引起菌种发生变异 (variation)。 基本配置要求: ?基质浓度(有机氮)要低些，否则影响孢子的形成。 ?无机盐要适量，否则影响孢子的数量和质量。 ?培养基的pH值和湿度 生产上常用孢子培养基: 麸皮、大米、小米培养基;由葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制的琼脂斜面培养基。 大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因它们含氮少、疏松、表面积大，是较好的孢子培养基。水分控制在21,,25,。 2 种子培养基 inoculum media: 种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮，成为活力强的‘种子’。 一般种子培养基常包括有机氮源和无机氮源。 最后一级的种子培养基的成分最好接近发酵培养基。 3 发酵培养基 production media 发酵培养基是供菌体生长、繁殖和合成产物之用。 要求:既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体迅速合成所需产物。 配制要求:其组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还需有合成产物所需的特定元素、前体和促进剂等 所以选择合适的无机氮源有两层意义: 满足菌体生长 稳定和调节发酵过程中的pH 有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响。 无机氮源(inorganic nitrogen source) 种类:氨水(ammonia)、铵盐(ammonium)和硝酸盐(nitrate) 特点:微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如: 无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用(代谢)后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺。 若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。 正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。 生长因子 growth factors:凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质。 例如:氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等。 来源:有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B族维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子 前体:前体是指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。 ExamplesG V 产物促进剂 product stimulator:产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。 促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。 有些促进剂本身是酶的诱导物; 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产， 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用; 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。 培养基成分选择的原则: 菌体的同化能力 碳源的选择:氮源的选择 代谢物的阻遏和诱导:应根据微生物的特性和培养的目的，注意快速利用的碳(氮)源和慢速合适的C、N比:一般工业发酵培养基的C、N比为100: (0.2~2.0) -- Many factors influence the optimal ratio pH的要求:除考虑营养需求，也要考虑其代谢后对培养体系pH缓冲的贡献，使pH 处于较适宜的状态. 利用的碳(氮)源的相互配合，发挥各自的优势，避其所短 第五章 灭菌:用物理或化学的方法杀灭或去除物料或设备中所有生命物质的过程。 消毒:是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如， 巴氏消毒法，是将物料加热至60?维持30min,以杀死不耐高温的微生物营养细胞。 灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。 消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。 几种常见的灭菌方法: 1)化学药剂灭菌 机理:某些化学药剂能与微生物细胞物质发生反应而具有杀菌作用。 常用药剂:甲醛、氯(或次氯酸钠)、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐(如新洁尔灭)等。 使用范围:器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌;不能用于培养基灭菌。 (2)辐射灭菌; 原理:利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。 常用:紫外线、X射线和γ射线。 使用范围:用于室内空气及器皿表面灭菌。 (3)干热灭菌 原理:利用高温对微生物氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。 常用方法:灼烧和电热箱加热，140,180? 1-2h。 使用范围:玻璃及金属用具及沙土管灭菌。 (4)湿热灭菌 原理:蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。 常用方法:水煮常压灭菌，100?，饱和蒸汽灭菌:一般121?，30min。 使用范围:培养基和发酵设备灭菌。 (5)过滤除菌 原理:利用微生物不能透过滤膜除菌。 方法: 0.01~0.45 m孔径滤膜。 使用范围:用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。 培养基的连续灭菌:将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行加热、保温和冷却而进行灭菌。 连续灭菌的流程与设备 (1)配料预热罐，将配制好的料液预热到60,70 ? ，以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声; (2)连消塔(加热器)，用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度(126,132?); (3)维持罐，使料液在灭菌温度下保持5,7min。因为连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的; (4)冷却管，使料液冷却到4050?后(冷水喷淋) ，输送到预先灭菌过的罐内。 (三)间歇灭菌与连续灭菌的比较 影响灭菌效果的因素 微生物种类:不同的微生物k值不同。 初始菌量:在保持N值不变的前提下，t 与初始菌量N0的对数成正比。 培养基成份:油脂、蛋白质增加微生物的耐热性。 传热与混合状况:影响受热均匀度。 培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。 蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。 pH:酸性pH下可加快微生物热死速率 看作业本 第六章 种子扩大培养的概念:种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过 扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子 种子扩培的目的:接种量的需要， 菌种的驯化，缩短发酵时间、保证生产水平 种子的要求:活力强，移种至发酵后能够迅速生长，迟缓期短。生理状况稳定，个体与群体。菌体总量及浓度能满足大容量 发酵罐的要求。无杂菌污染。 保持稳定的生产能力。 种子制备的过程 实验室阶段:不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此 现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。 生产车间阶段:种子培养在种子罐里面进行，一般在归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。 种子罐级数的确定:一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。 谷氨酸:三级发酵 一级种子(摇瓶)?二级种子 (小罐)?发酵 青霉素:三级发酵 一级种子 (小罐)?二级种子(中罐)?发酵 发酵级数确定的依据 1(级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。 2(级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2,4级。 3(在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面。 接种量的概念: 移入种子的体积 接种量, ————————— 接种后培养液的体积 过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7,15%。但是一般认为大一点好 双种:两个种子罐接种到一个发酵罐中。 倒种:一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。 种龄:是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 种龄短:菌体太少;种龄长:易老化。 原则:对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。 种子的质量要求 量:要求达到一定的浓度。 质: 菌丝形态、培养液外观 (生长处于某个阶段、均匀等等)理化指标:C、N、P的含量，pH值，酶活等。 无污染(无杂菌) 影响种子质量的因素(填空) :原材料质量，培养条件 温度 湿度 通气量 斜面冷藏时间 第七章 发酵过程的种类——必考 一、分批发酵整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。 液体的流量等于零。 二、补料,分批发酵 三、半连续发酵 四、连续发酵 分批发酵 分批发酵是一种准封闭式系统，种子接种到培养基后除了气体流通外发酵液始终留在生物反应器内。 整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。 液体的流量等于零。 分批发酵的优缺点 优点:操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握。 缺点:生产周期短，产率低，不适于测定动力学数据。对基质浓度敏感的产物，或次级代谢物，抗生素，用分批发酵不合适。 补料(流加),分批发酵:在分批培养过程中补入新鲜的料液， 以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。 带放:是指放掉的发酵液和其他正常放罐的发酵液一起送去提炼工段。 代谢参数的分类(填空) 代谢参数按性质分可分三类: 物理参数:温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧(二氧化碳)浓度等。 化学参数:基质浓度(包括糖、氮、磷)、pH值、产物浓度、核酸量等。 生物参数:菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等。 从检测手段分可分为:直接参数、间接参数 直接参数:通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH值、残糖等。 间接参数:将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率等。 直接参数又可分为: 在线检测参数和离线检测参数。 主要发酵条件的影响及其控制(重点) 一、基质浓度 先进的培养基组成和细胞代谢物的分析技术加上统计优化策略和生化研究对于建立能充分支持高产、稳产和经济的发酵过程是关键的因素。注意:注意碳源、氮源和磷酸盐的浓度 二、灭菌情况 随灭菌温度的升高，时间的延长，对养分的破坏作用愈大，从而影响产物的合成，特别是葡萄糖，不宜同其他养分一起灭菌。 三、种子质量 1、接种菌龄: 是指种子罐中培养的菌体开始移种到下一级种子罐或发酵罐的培养时间。 太年轻或过老的种子对发酵不利。 2、接种量: 是指移种的种子液和培养液体积之比。 通常为5,,10,，抗生素有时可达20,,25,，甚至更大。 四、温度 1、温度对生长的影响 不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类:嗜冷菌适应于0,26?生长，嗜温菌适应于15,43?生长，嗜热菌适应于37,65?生长，嗜高温菌适应于65?以上生长 。 每种微生物对温度的要求可用最适温度、最高温度、最低温度来表征。 在最适温度下，微生物生长迅速; 超过最高温度微生物即受到抑制或死亡; 在最低温度范围内微生物尚能生长，但生长速度非常缓慢，世代时间无限延长。 在最低和最高温度之间，微生物的生长速率随温度升高而增加，超过最适温度后，随温度升高，生长速率下降，最后停止生长，引起死亡。 微生物受高温的伤害比低温的伤害大。 即超过最高温度，微生物很快死亡;杀菌的原理。 低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的原理。 微生物的生长速率dx/dt可用下式的数学模型表示: dx/dt,μx,αx 其中，μ为比生长速率; α为比死亡速率。 2、影响发酵温度的因素 发酵过程中释放出来的净热量称为发酵热。 Q,Q，Q,Q,Q,Q显发酵生物搅拌蒸发辐射 3、最适温度的选择 不同的菌体，不同的培养条件，不同的酶反应，不同的生长阶段，最适温度应是不同的。 而且菌体生长的最适温度不一定等于产物合成的最适温度。不同的菌体，不同的培养条件，不同的酶反应，不同的生长阶段， 最适温度应是不同的。 而且菌体生长的最适温度不一定等于产物合成的最适温度， 4.最适温度的选择 (1)、根据菌种及生长阶段选择 (2)、根据培养条件选择 (3)、根据菌生长情况 (4)、还应参考其他发酵条件 5、pH值的影响 pH值是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。 发酵过程中pH值是不断变化的，通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否。 1、发酵过程pH变化的原因 1，基质代谢:糖代谢(补料)氮代谢 ，生理酸碱性物质。 2、产物形成:某些产物本身呈酸性或碱性 3、菌体自溶:pH值上升,发酵后期,pH值上升。 2、pH值对发酵的影响 (1)pH值影响酶的活性。 (2)pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因 此影响新陈代谢的进行。 (3)pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。 (4)pH值影响代谢方向 pH值不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。 3、最佳pH的确定 配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况 4、pH值的控制 (重点) (1)调节好基础料的pH值 (2)在基础料中加入维持pH值的物质 (3)通过补料调节pH 值 (4)当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH值。 (5) 不同调pH方法的影响 (6)发酵的不同阶段采取不同的pH值同调pH方法的影响 六、溶氧的影响 溶氧(DO)是需氧微生物所必需的。 对数生长期即使溶氧达到100,，可能在几分钟内消耗掉。使溶氧成为限制因素。 从溶氧变化的情况可以了解氧的供需规律及其对生长和产物合成的影响。 三种表示溶氧浓度的单位: 氧分压或张力，以大气压或毫米汞柱表示。 绝对浓度，以 mgO2/L 纯水或ppm表示。 空气饱和度百分数。 临界氧(CCr ):是指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。 呼吸熵: 摄氧率: 泡沫的缺点: 1、降低生产能力:在发酵罐中，为了容纳泡沫，防止溢出而降低装量; 2、引起原料浪费:如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地，气泡会引起原料流失，造成浪费。 3、影响菌的呼吸 4、引起染菌 影响泡沫稳定性的因素 引起危害，需要消除的，只是稳定的泡沫。泡沫的稳定性受液体、气体许多性质的影响。 1、泡径大小 大泡易于破灭;气泡小上升速度慢，给表面活性剂的吸附提供充足的时间，增加了稳定性。 2、溶液所含助泡剂的类型和浓度 (1)降低表面张力 降低表面张力会降低相邻气泡间的压差。 (2)增加泡沫弹性 (3)助泡剂浓度 溶液中助泡剂浓度增加，气液界面上的吸附量就增加，液膜弹性随之增加，泡沫稳定性增高。 3、起泡液的粘度 粘稠的液膜，有助于吸收外力的冲击，起到缓冲的作用，使泡沫能持久一些。液体粘度对泡沫稳定性的影响比表面张力的影 响还要大。 4、其它 温度，pH值(影响助泡剂的溶解度和表层的吸附状态)，表面电荷(离子型表面活性剂)。 三、泡沫的控制 1、机械消沫 定义:机械消沫是借机械引力起剧烈振动或压力变化起消沫作用。 优点:不需引进外界物质，从而减少染菌机会，节省原材料和不会增加下游工段的负担。 缺点:不能从根本上消除泡沫成因。 2、消泡剂消沫 常用的消泡剂:天然油脂类，聚醚类，高级醇类，硅树枝类。 其消泡作用取决于它在发酵液中的扩散能力(机械分散，分散剂) 消泡剂使用的: 不能用量过大; 细密地扩散到泡沫效果好; 加入土温(tween)-80具有增效作用; 多种消泡剂并用。 染菌:发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖。 染菌的防止 1、防止种子带菌 沙土管及摇瓶，无菌操作，子瓶、母瓶，无菌室和摇床间。 2、防止设备渗漏 化学腐蚀、电化学腐蚀，物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不良。 3、防止培养基灭菌不彻底 培养基灭菌方法——高压蒸汽灭菌 分批灭菌:121?，30min。 连续灭菌:罐温125,130?，30,45min。 4、防止空气引起的染菌 空气过滤除菌设备流程。 5、发酵染菌后的 染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道，找染菌的原因，染菌严重时，车间环境要用石灰消毒。