异常黑胆质成熟剂对异常黑胆质载体动物模型下丘脑-垂体-肾上腺轴的调节作用研究_3022

异常黑胆质成熟剂对异常黑胆质载体动物模型下丘脑-垂体-肾上腺轴的调节作用研究_3022 异常黑胆质成熟剂对异常黑胆质载体动物模型下丘脑-垂体-肾上腺轴的调节作用研究 【摘要】 目的阐明异常黑胆质成熟剂对异常黑胆质载体动物模型丘脑 -垂体-肾上腺轴(HPAA)功能的调节。方法根据维吾尔医学理论采用多因 素复制小鼠异常黑胆质载体动物模型，并用异常黑胆质成熟剂不同剂量 （8.58,17.16,34.32 g/kg）， 14 d全程干预给药,此后用ELISA法检测血清ACTH和CORT含量；采用高效液相-荧光检测分析法分析了异常 黑胆质载体动物模型小鼠血清和脑去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、3，4二羟基本乙酸（DOPAC）等单胺类神经递质含量。 结果异常黑胆质成熟剂不同剂量可以降低异常黑胆质载体动物模型血清 NE含量（P<0.01），增加血清DA、5-HT和DOPAC含量（P<0.01），同时发现异常黑胆质成熟剂能降低异常黑胆质载体动物模型脑组织中NE含量（P<0.01），异常黑胆质成熟剂大剂量能增加DA含量（P<0.05），小剂量和大剂量能增加DOPAC含量（P<0.01）。结论提示异常黑胆质成熟剂可能通过参与神经内分泌系统的内在调节，改善异常 黑胆质载体动物模型的丘脑-垂体-肾上腺轴(HPAA)功能的紊乱。 【关键词】 异常黑胆质成熟剂 载体模型 丘脑-垂体-肾上腺轴 调节 Abstract：ObjectiveTo study the regulative effect of Abnormal Savda Munziq (ASMq) on Hypothalamic-Pituitary-Adrenocortical axis dysfunction on Abnormal Savda carrier animal models. MethodsMulti-complicated induction methods were adopted to prepare the Abnormal Savda carrier animal models. Animals were administered with ASMq at 8.58,17.16,34.32 g/kg b. w. respectively for fourteen days in order to block the procedure of Abnormal Savda development. The concentrations of andreno corticotropic hormone (ACTH), cortisol (CORT) in serum were measured by ELISA method. HPLC-fluorescence detection methods were applied to measure the concentrations of NE, DA, 5-HT and DOPAC. ResultsAll doses of ASMq used in our experiment significantly decreased the concentration of serum NE (P<0.05) and increased the concentrations of serum DA, 5-HT and DOPAC (P<0.05). Additionally, NE in brain tissue was inhibited (P<0.01) while the DA (P<0.05) and DOPAC (P<0.01) were enhanced by the administration of ASMq. ConclusionThe ASMq has regulative effects on Hypothalamic-Pituitary-Adrenocortical axis（HPAA）in the Abnormal Savda carrier animal model. Key words：Abnormal Savda Munziq; Carrier animal model; HPAA; Regulation 近年来对异常黑胆质病证的研究表明，异常黑胆质常引起肿瘤、糖 尿病、高血压病和哮喘等复杂性疾病。异常黑胆质病证与下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPAA)功能紊乱密切相关，HPAA功能紊乱可能是异常黑胆质 证的生成及导致复杂性疾病的物质基础。我们推测临床有效的异常黑胆 质成熟剂可能通过调节机体HPAA功能的紊乱达到防治异常黑胆质性病 证的发生发展之功效，HPAA可能是异常黑胆质成熟剂的作用靶点之 一。本研究应用异常黑胆质成熟剂不同剂量14 d全程干预异常黑胆质 载体动物模型，之后，观察实验动物神经内分泌多项指标，探讨异常黑 胆质成熟剂对HPAA功能紊乱的调节作用。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 RQH-350型人工气候箱，上海精宏实验设备有限公司；JXDT-1型小鼠跳台仪器； BS-110型电子天平，北京赛多科斯天平有限公司；低 温超速离心机，美国Beckman 公司；BioRad 550 酶标仪，美国BioRad公司产品；721分光光度计；低温冰箱。液相色谱操作条件： Aglient1100 I080 高压泵,FLD荧光检测器,色谱柱ZORBAX ODB C18 （4.6 mm×150 mm×5 mm）,流动相配比硫酸水：甲醇，流量1 ml/ min ,进样环体积20 μl ,工作电压 +121V ,柱温30?，检测波长360 nm。小鼠血清促肾上腺皮质激素（ACTH）ELISA 试剂盒，皮质酮(CORT) ELISA 试剂盒，美国R&D公司产品，按照试剂盒操作说明进行操作。去 甲肾上腺素(Norepincphrine,NE)、多巴胺(Dopamine,DA)、5-羟色胺(Seretonin,5-HT)，3，4二羟基本乙酸（3，4- Dihydroxyphcnylamine,DOPAC），3，4二羟基卞胺（DHBA），以上为SIGMA公司产品，其他试剂均为国产分析纯试剂。 1.2 药材和异常黑胆质成熟剂的制备处方中的药材购自于新疆维 吾尔自治区维吾尔医医院草药房，经新疆维吾尔自治区维吾尔医医院制 剂中心质检科严格鉴定，符合《中华人民共和国药典》和《中华人民共 和国卫生部药品维吾尔药分册》的规定。 成熟剂根据国家发明专利《能够使异常黑胆质型体液成熟和清除的 药物及其制备方法（专利号C082130082.8）》制备，用旋转蒸发仪浓 缩至膏稠状，然后在60?真空干燥，备用，每1g药粉含3.4 g生药。使用时根据试验需要用双蒸水配制使用。 1.3 实验动物ICR小鼠，清洁级，雄性，体重（20?2） g，新疆医科大学实验动物中心提供,许可证号：SCXK(新)2003-001。 1.4 动物分组及造模 1.4.1 异常黑胆质成熟剂对血清ACTH和CORT含量的影响选取55只ICR小鼠，按体重将小鼠完全随机分为5组，即正常对照组和载体动 物模型、载体动物模型小剂量给药组、载体动物模型中剂量给药组、载 体动物模型大剂量给药组。 1.4.2 异常黑胆质成熟剂对血清和脑组织单胺类神经递质含量的 影响选取55只ICR小鼠，按体重将小鼠完全随机分为5组，即正常对照组和载体动物模型、载体动物模型小剂量给药组、载体动物模型中剂 量给药组、载体动物模型大剂量给药组。 1.4.3 载体动物模型的建立正常对照组：在室温下 〔温度（25?3）?，相对湿度60～80%〕用普通饲料饲养，随机饮食水未受任何刺 激。 载体动物模型组：我们用人工气候箱，将模型组小鼠置于温度为 6?，相对湿度为25%～32.8%的环境饲养，11:00～21:00，干寒属性的饲料喂养，采用间断足底电击作为应激源（输出电压20～30V，不定时 改变电压，间隔0.2～0.5s，20 min/d，1次/d），产生慢性应激。 正常对照组与模型组同样从6:00～18:00提供光线。 1.5 动物给药实验第1天开始除正常组和载体动物模型外，其他 载体动物模型予异常黑胆质成熟剂药粉小剂量2.53 g/kg（生药量8.58 g/kg）,相当于临床用量的等效剂量；中剂量5.06 g/kg（生药量17.16 g/kg），相当于临床用量的等效剂量的2倍；大剂量10.12 g/kg（生药量34.32 g/kg），相当于临床用量的等效剂量的4倍。每天实验前1 h灌胃给药异常黑胆质成熟剂，给药14 d。 1.6 血清ACTH和CORT含量的测定各组小鼠在第14天末次给药1 h后上午10:00～12:00之间眼静脉采血，4? 离心分离血清，分离血 清放置在-80?保存待测。采用小鼠血清促肾上腺皮质激素（ACTH）ELISA 试剂盒，皮质酮(CORT) ELISA 试剂盒进行测定。 1.7 血清和脑组织中单胺类神经递质 1.7.1 血清样品的制备和检测各组小鼠在第14天末次给药1 h后上午10:00～12:00点之间眼静脉采血，4?,4 000 r/min, 离心15 min，离血清，取血清 ,加入等体积的0.1 mol/L（含内标物200 μg/ml）高氯酸,在冰浴中振摇混合1.5 min，再加上高氯酸1滴（原液），在冰浴中继续混合1.5 min。18 000 r/ min离心20 min ,取上清液置入Eppendorf 管中，置于液氮罐保存待测,测定时取管底超滤 液，按上述色谱条件分析分离血清放置在-80?保存待测。进样10 μl/次，进行检测。 1.7.2 脑组织样品的制备和检测各组小鼠在第14天末次给药1 h后上午10:00～12:00之间眼静脉采血后，在冰上迅速剥离大脑，称 重，放入组织匀浆器内，以每100 mg重量(湿重) 1 ml高氯酸的比例加入0.1 mol/L高氯酸（含内标物200 μg/ml），在冰浴中磨成组织 匀浆，4?，18 000 r/min 进行离心，取上清液置于Eppendorf 管中，在液氮罐保存待测。测定时取管底超滤液，按上述色谱条件分析分 离血清放置在-80?保存待测。进样10 μl/次，检测20 min。 1.8 统计学处理统计学处理全部用SPSS 11.5 软件统计包处理，以?s表示，组间差异采用方差分析，以P<0.05为显著性差异的标 准。 2 结果 2.1 异常黑胆质成熟剂对异常黑胆质载体动物模型组血清ACTH和CORT含量的变化在异常黑胆质载体动物模型制作过程中用异常黑胆质 成熟剂全程干预，不同剂量异常黑胆质成熟剂能明显降低小鼠血清 ACTH和CORT含量（P<0.05）。结果见表1及图1～2。表1 异常黑胆质成熟剂对异常黑胆质载体动物模型血清ACTH和CORT含量的影响（略） 2.2 异常黑胆质成熟剂对血清和脑组织单胺类神经递质含量的影 响异常黑胆质载体动物模型出现血清及脑组织单胺类神经递质含量的变 化。异常黑胆质载体动物模型血清中NE含量明显增加（P<0.05）,DA含量下降（P<0.01）、5-HT含量下降（P<0.01）和DOPAC（P<0.01）含量降低；脑组织中中NE含量明显升高（P<0.01）,DA含量下降（P<0.01）、DOPAC含量降低（P<0.01），5-HT含量未发生明显的改变 （P>0.05）。异常黑胆质成熟剂不同剂量可以降低异常黑胆质载体动物 模型血清NE含量，增加血清DA、5-HT和DOPAC含量（P<0.01），同时发现异常黑胆质成熟剂能降低异常黑胆质载体动物模型脑组织中NE含量（P<0.01），异常黑胆质成熟剂大剂量能增加DA含量（P<0.01），异常黑胆质成熟剂小剂量和大剂量能增加DOPAC含量（P<0.01）（结果见表2～3和图2～5）。表2 异常黑胆质成熟剂对异常黑胆质载体动 物模型血清单胺类神经递质及其代谢产物含量的影响（略）表3 异常黑胆质成熟剂对异常黑胆质载体动物模型脑组织单胺类神经递质及其代 谢产物含量的影响（略） 3 讨论 神经内分泌免疫网络是整体性维护机体稳态的重要物质体系。虽然 现代医学首先提出神经内分泌免疫网络学说，但没能发现调节该网络的 有效手段，而有关研究已经证实中药却能对这一网络起到良好的良性调 节作用，逐步显示出对神经内分泌免疫网络调控的优势和具有很大的研 究应用潜力。按照中药天然药散单理论，实际上是一个多靶系统、进入 体内以后通过多层次、多环节、多途径、多靶点地作用于人体的各个部 位，从而调节失去平衡的机体，使机体恢复健康。在临床实践中已证明 癌症、糖尿病、高血压病、支气管哮喘等复杂性疾病在NEI网络上存在着功能异常和组织病理学的改变。医学实验证明外源性因素可以使NEI网络紊乱，各系统相关指标发生异常，使用相应药物调节后各项指标得 到明显改善［2～5］。 维吾尔医学认为异常黑胆质是可使机体多系统受刺激、多系统受 累，从而导致复杂性疾病的异常体液。从神经内分泌学和维吾尔医学的角度分析可知，导致异常黑胆质证的情志、环境等各种因素是引起下丘 脑-垂体-肾上腺轴（HPAA）功能紊乱的应激原，是引起神经、内分泌、 免疫等多个系统功能障碍或者由这三大系统组成的网络的紊乱的不良刺 激，主要引起下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPAA）功能亢进［6］。而异常黑胆质成熟剂通过多成分、多途径、多靶点的作用机制而发挥生物学效 应。 异常黑胆质成熟剂是由破布木果、药枣、牛舌草、蜜蜂花、熏衣 草、铁线蕨等组成，性温热，具有成熟异常黑胆质体液、利尿、消炎解 毒等功效。根据维吾尔医学“异病同治”观点，异常黑胆质病证的治疗 中首先使用异常黑胆质成熟剂，使异常黑胆质“成熟和堆积”，然后使 用异常黑胆质清除剂，使“成熟和堆积”了的异常黑胆质体液排出体 外，使气质复原、体液平衡，为本证的治疗奠定基础［7，8］。 本研究发现用异常黑胆质成熟剂全程干预异常黑胆质载体动物模 型，实验动物血清ACTH和CORT水平正常或趋于正常。不同剂量的异常 黑胆质成熟剂可以降低异常黑胆质载体动物模型血清NE含量（P<0.01），增加血清DA,5-HT和DOPAC含量（P<0.01），同时发现不同剂量的异常黑胆质成熟剂能降低异常黑胆质载体动物模型脑组织中 NE含量（P<0.01），异常黑胆质成熟剂大剂量能增加DA含量（P<0.05），小剂量和大剂量能增加DOPAC含量（P<0.01）。结果表明，异常黑胆质成熟剂对HPAA功能紊乱有内在的调节作用，说明该复 方具有调节机体自稳机能失调之功效，而HPAA可能是异常黑胆质成熟剂作用靶点之一。以药测理可知，异常黑胆质与HPAA功能紊乱联系密切，而且HPAA功能紊乱可能是使异常黑胆质生成和导致复杂性疾病的 根本所在。 【参考文献】 ［1］努尔买买提，哈木拉提?吾甫尔.异常黑胆质成熟剂和清除剂对小鼠神经内分泌免疫网络的调节作用.维吾尔医学及其他传统医学的研究与应用［M］.乌鲁木齐：新疆人民卫生出版社,2003：1112. ［2］蔡定芳，沈自尹.中西医结合神经内分泌免疫网络研究的思考 ［J］.中国中西医结合杂志，1997，7（17）：443. ［3］黄吉春，刘光益.中药对神经内分泌免疫网络的调控研究现状 和前景［J］.四川解剖学杂志，2003，11（3）：25. ［4］张汝学，周金黄，贾正平，等.糖尿病发病机制与神经内分泌免疫调节网络［J］.中药药学刊,2003,21(6)：916. ［5］王欣.从神经-内分泌-免疫网络调节中药复方效应机制［J］. 中医药学刊，2003，21（12）:2055. ［6］Mizoguchik K,Yuzurihara M,Ishige, et al.Chronic stress regulates glucocorticoid negetive feedback response in rats ［J］.Pshychoneuroendocrinolgy,2001.26(5):443. ［7］穆哈穆德.艾克拜尔.艾尔扎尼.米扎尼提普（波斯文）：拉合尔伊斯兰出版社，1344：85. ［8］斯依提.穆哈穆德.候赛音.麦合孜尼艾地维亚（草药宝库） （波斯文）：印度吉维力可西瓦出版社，1988：251. 声明：版权归原作者所有，如果侵犯了你的版权，请第一时间和我联 系，我将立刻做出处理！！！