淋巴细胞分离过程中去除红细胞和血小板的方法

淋巴细胞分离过程中去除红细胞和血小板的方法 为获得高纯度淋巴细胞，必须进一步清除 PBMC 悬液中其他血细胞。 凄饣鞫(一)去除红细胞:一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或 0.83氯化铵处理法。低渗裂解法是加 1ml 蒸馏水于沉淀的 PBMC 中，不超过 1min，红细胞即快速裂解，立即加入等量的 1.8氯化钠溶液恢复为等渗状态，经洗涤即可去除红细胞。氯化铵处理法是在沉淀的 PBMC 中加入 1ml 0.83氯化铵溶液，轻轻振摇 2min，即可裂解红细胞，经洗涤即可去除红细胞。 凄饣鞫 红细胞裂解液的制备:碳酸氢钾(KHCO3 )1.0g;氯化氨(NH4 Cl)8.3g;EDTA-Na2 0.037g，加双蒸水至 1000ml，即工作液。 凄饣鞫(二)去除血小板:通过离心洗涤，即可去除 PBMC 中绝大部分混杂的血小板。若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除 PBMC中混杂的血小板。将 PBMC 悬液洗涤 23 次后，常可去除绝大部分混杂的血小板。某些疾病状态下，外周血中血小板数量增多，常需通过胎牛血清(FCS)梯 因度离心才能去除过多的血小板， FCS 可让单个核细胞通过而阻止血小板通过。凄饣鞫Place 3 ml FCS in a 15-ml centrifuge tube and carefully overlay with PBMC.Centrifuge 15 min in a GH-3.7 rotor at 800 rpm 200 g 18? to 20?. Discardsupernatant which contains platelets. Resuspend pellet in HBSS/FCS at 2-5×107 cellsper 1 to 2 ml. Fetal calf serum FCS heat-inactivated 1 hr 56? 凄饣鞫(三)去除单核细胞和粒细胞: 凄饣鞫单核细胞的去除:?粘附去除法:单核细胞能粘附在塑料或玻璃的面，而淋巴细胞则不能，由此可将单核细胞从 PBMC 悬液中分离出来。?L-亮氨酸甲酯去除法:单核细胞内富含溶酶体酶，而 L-亮氨酸甲酯能被单核细胞摄入后聚集于溶酶体中，在溶酶体的作用下转化为 L-亮氨酸-L-亮氨酸甲酯，此物对细胞有毒性作用，由此可溶解并去除单核细胞。此外本法还可清除 NK 细胞及细胞毒性 T细胞，而 B 细胞及绝大多数 T 细胞因缺少溶酶体酶，因而不受影响。这种方法只适用于分离新鲜细胞，冻存细胞因代谢 L-亮氨酸甲酯的能力很弱而不易分离。?羰基铁吞噬离心法:单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞比重增大，再经 Ficoll-Hypaque 密度梯度离心，则单核细胞将沉于管底而被去除。实验时可先将抗凝血与一定量的羰基铁粉混合，在 37?下搅拌 15min，亦可将已分离的 PBMC 悬液与羰基铁粉混合，然后再进行离心分离。此外，用针对单核细胞表面特殊标志的特异性抗体，通过间接免疫吸附法或免疫磁性微珠法亦可去除 PBMC 悬液中的单核细胞，且可对单核细胞进行回收利用。 凄饣鞫1. 黏附法:单核细胞和多形核白细胞具有黏附能力，通过 PBMC 与玻璃或塑料平皿的黏附作用，非黏附细胞即为淋巴细胞。同理，可应用玻璃纤维或葡聚糖凝胶 Sephadex G-10 柱清除黏附细胞，洗脱液中主要是淋巴细胞。优点:简便易行，对细胞损伤少。缺点:B 细胞也有黏附能力，用此法分离时将有所损失。 凄饣鞫 (1)经聚蔗糖-2. 羰基铁粉吞噬法:使单核细胞吞噬羰基铁粉后细胞密度增大: (2)泛影葡胺密度梯度离心使单核细胞沉积于管底而被去除; 用磁铁将细胞吸至管底，上层液中欧诺个即含较纯的淋巴细胞。 凄饣鞫 ( L-亮氨酸甲酯)具有亲溶酶体性3. 苯丙氨酸甲酯法:苯丙氨酸甲酯(PME)或质，能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸，导致溶酶体因渗透压改变而破裂，所释放的酶类物质可致细胞溶解。该法可溶解含溶酶体的细胞(如单核细胞、粒 。B细胞和纤维母细胞等) 细胞和多数 T 细胞因缺乏溶酶体酶，故不受影响。 凄饣鞫凄饣鞫梅儒驴鸡焯泪宦瀑濞趵佻译觇汕煳讳嫌痘忻厉洚乍梯褡虏巫置掬督碛函淙浦眍汛炸縻婺继钊涕褪涠闯奎鐾糅捶僳瑛缒 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