淋巴细胞共刺激信号和凋亡信号异常与RA免疫效应亢进的研究

淋巴细胞共刺激信号和凋亡信号异常与RA免疫效应亢进的研究 淋巴细胞共刺激信号和凋亡信号异常与RA 免疫效应亢进的研究 中国免疫学杂志2005年第2l卷 淋巴细胞共刺激信号和凋亡信号异常与RA免疫效应亢进的研究? 王兰兰蔡蓓陈捷冯伟华(四川大学华西医院实验医学科临床免疫实验室,成都 610041) 中国图书分类号I92.12文献标识码A文章编号looo-484x(2oo5)12-0940-04 [摘要】目的:探究T淋巴细胞表面多种细胞信号分子所介导的细胞活化或凋亡信 号在RA患者免疫功能紊乱中的作 用.方法:采用流式细胞术RA患者外周血T细胞亚群及其表面共刺激分子 CD154(CD40L),CD30和凋亡受体CD95(Fas) 的表达.结果:RA患者外周血T细胞亚群偏移,CD4T细胞增加,CD8T细胞减少;共 刺激分子CD154在CD4和CD8T细 胞上的表达均上调,但CD30分子的表达均降低,并以CD4T细胞降低更为明显.同 时,凋亡受体CD95分子在T细胞亚群上 的表达均明显增加.结论:RA患者T淋巴细胞表面多种信号分子表达异常,共同导 致了RA患者免疫功能紊乱. [关键词】CD154/CD40L;CD30;CD95/Fas;类风湿性关节炎 Researchofabnormalcostimulatoryandapoptoticsignaltolymphocytesinpatients withrheumatoidarthritis WANGLan-Lan,Bei,CHEN,FENGWegHua.Dw~mnofClinicalImmunologicallaboratory,Departmentof lxtboratoryMedicine,HuaxiHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China [Abstract]Objective:ToexplorethefunctionsofdiversityofsignalmoleculesexpressedOilT cellsinducingactivationsofcellsandap- optosisincausingimbalancedimmunityofpatientswithRA.Methods:ToapplyfloweytometertodeterminetheexpressionofCD154(CIMOL), CD30andCD95(Fas)onTlymphocytes.Results:ImbalancedTsubsets,increasingCAMTc ellsanddecreasingCD8Tcellswerefoundin peripheralbloodofpatjentswithRA.ExpressionsofCD154onbothCD4TcellsandCD8Tcell sincreased,butthatofCD30,particularly CD4CD30'Tcellsdecrease.However,expressiomofCD95onTsubsetsmikinglyincreased. Conclusion:Abnormalexpressionsofdiverse simoleculesonTlymphocytesleadtotheimbalancedimmunefunctioninpatientswithrheum atoidarthritis. [Keywords]CD154/CIMOL;CD30;CD95/Fas;Rheumatoidarthritis(RA) 类风湿性关节炎(RA)以外周血中高滴度的类 风湿因子(RF)和多克隆性免疫球蛋白表达为特征, 提示B细胞免疫功能亢进,而B细胞的活化主要又 为T细胞信号依赖性.T,B细胞问共刺激分子对 CIM0.CD40L(CD154)和CD30.CD30L(CD153)作用在 它们的活化中都有着重要作用,凋亡受体CD95 ()则决定着T,B细胞在数量上的平衡.淋巴细 胞表面多种细胞信号分子共同作用,以多信号调节 方式活化或抑制细胞免疫活性效应.因此,为进一 步了解RA患者外周血T细胞在多种细胞信号效应 下的活性及其对RA免疫功能的影响,我们就RA患 者外周血T细胞上CD154(CD40L),CD30和CD95 ()分子的表达进行测定,现报道如下. 1材料与方法 1.1实验对象类风湿性关节炎患者共27例,均 ?本课题受国家自然科学基金(30470683)及四川省科技应用基础项 目基金(02SY029.126)资助 作者简介:王兰兰(1953年一),女,教授,硕士生导师,主要从事自身 免疫性疾病细胞免疫和体液免疫研究,E-mail:wa.g!JR7 @sohu.?o 为我院门诊和住院的确诊病人,符合1987年修改的 美国风湿病协会(ARA)类风湿性关节炎诊断, 无相关感染性疾病,不伴有其他自身免疫性疾病,据 临床症状体征和实验室指标(RF,CRP,血沉)诊断均 为活动期患者,其中男性8例,女性l9例,年龄26— 6l岁,病程时间为5l7年.健康对照组共28例, 均为健康志愿者,无相关免疫性疾病,肾脏疾病和近 期感染,其中男性l5例,女性l3例,年龄2l一45岁. 1.2标本的采集与处理抽取类风湿性关节炎患 者,健康正常者静脉血3ml,以肝素抗凝,标本于采集 后2小时内处理,.并以2mlFicoU淋巴细胞分 离液分离全血制备外周血的单个核细胞悬液备用. 1.3实验仪器EPICSXL型流式细胞仪,EPICS IMMUNOLOGYWORKSTATION溶血仪(BECKMAN COULTER公司,美国). 1.4主要试剂CD3.PECY5,CD4.FTI?,CD8.Fn?, CD8.PE,CD30.PE,CD154.PE,CD95.PE鼠抗人单克隆 抗体(Immunotech公司,法国);IgG1.FITC,IgG1.PE. CY5,I1.PE鼠抗人的同型对照单克隆抗体(Immu. notech公司,法国). 王兰兰等淋巴细胞共刺激信号和凋亡信号异常与RA免疫效应亢进的研究第l2 期 1.5检测方法 1.5.1标本的标记采用荧光标记单克隆抗体10 与肝素抗凝全血或制备的淋巴细胞悬液50l进行 30分钟双标或三标反应,溶血仪上溶血,并以PBS 液洗涤1次后,加入1mlPBS液重新制成细胞悬液 待测. 1.5.2建立每一测定方案设定时要进行同 型对照,颜色补偿的重新调定,以确定仪器适当的电 压与增益. 1.5.3流式细胞仪质控每次测定前以Flowcheck 调整仪器的光路和流路,使每一指标的半峰高变异 (HPCV)均小于2%. 1.6统计分析采用SPSSl1.0软件进行统计学处 理,结果以?s表示,样本间年龄和性别的构成分 析采用检验,样本间比较采用成组t检验. 2结果 2.1健康对照组与RA患者组间年龄,性别构成比 分析两组间进行不同年龄段(<30岁,3o一4o岁,? 40岁)构成比分析显示无统计学意义(P=0.787);性 别构成比分析也无统计学意义(P=0.072),说明健康 对照组与RA组间在年龄和性别构成上具有很好的 可比性,见表1. 2.2类风湿性关节炎患者T细胞亚群的表达分析 27例类风湿性关节炎患者外周血CD4T细胞, CD4/CD8比值较健康对照组明显增加,而CD3T细 胞和CD8T细胞较健康对照组分别轻微增加和减 少,但无统计学意义,见表2. 2.3类风湿性关节炎患者T细胞上CD30和CD154 分子的表达类风湿性关节炎患者T细胞亚群上 CD154分子表达百分率均明显高于健康对照组,而 RA患者CD4T细胞上CD30分子表达明显低于健 康对照组(P=0.004),CD8T细胞上CD30表达虽 减少,但无统计学意义,见表3. 表1RA与健康对照组年龄性别构成比分析 Tab.1Analysisofthedifferencesofageandgenderbetween normalcontrolandRApatients Note:1)NosignificanceofagebetweennormalcontrolandRApatients,P> O.05;2)Nosignificanceofgenderbetweenntl~lalcontrolandRApa? tients.P>0.05;M.Male;F.Female. 表2类风湿性关节炎患者T细胞亚群的百分率表达(?) Tab.2ExpressionofTcellsubpapulationsinpatients,vitll rheumatoidarthrltls(x?) 表3类风湿性关节炎患者T细胞亚群上CD30和CD154分 子表达分析(%.x?) Tab.3AnalyzingCD30andCD154expressiononTcellsub? populationsinRApatients(%.?) 表4类风湿性关节炎患者T细胞上凋亡受体C1)95分子的 表达(%.x?) Tab.4Fz~pressionof(3Y)5OI1TcellsabpapulationsinRApa? tients(%.x?) 2.4类风湿性关节炎患者T细胞上凋亡受体CD95 分子的表达类风湿性关节炎患者CD4T细胞和 CD8T细胞上CD95分子的表达均明显增加,但两 组问T细胞亚群CD95分子表达百分率比值比较显 示,患者组低于健康对照组,但无统计学意义,且两 组结果均显示CD95分子主要表达于CD4T细胞, 见表4. 3讨论 RA是以关节损伤为主的非器官特异性自身免 疫病,RA患者外周血中高滴度的免疫球蛋白提示合 成和分泌免疫球蛋白的B细胞功能亢进.而T细 胞在胸腺依赖性B细胞的活化中发挥着重要的调 节功能,该功能的强弱受细胞间多种信号传导分子 的调节.本研究对参与T淋巴细胞活化和介导B 细胞活化的共刺激分子CD30和CD154(CD40L)在 RA患者外周血中的表达进行分析,并对T细胞凋亡 分子Fas(CD95)的表达作了同步分析,以了解RA患 者T淋巴细胞表面的多种细胞信号分子在介导细胞 活化或凋亡中信号传导的功能. T细胞上共刺激分子CD154(CD40L)属肿瘤坏 死因子超家族(TNF.sF)成员,其仅表达于活化T细 胞表面;其受体CD40分子属肿瘤坏死因子受体超 家族(TNFR—SF)成员,可表达于多种细胞表面,如B 细胞,单核细胞和巨噬细胞等APC细胞,内皮细胞 和成纤维细胞等,两者相互作用可促进T,B细胞增 殖,活化及高亲和力抗体的合成和分泌等多种免疫 效应.CD30分子也属肿瘤坏死因子受体超家族 (TNFR—SF)成员,主要表达在活化的T,B,NK淋巴细 胞上,其配体CD30L(CD153)也表达在活化的T,B 淋巴细胞上.CD30分子与活化诱导配体CD30L (CD153)结合后,同样也参与T-B淋巴细胞间信号传 蛋 导,活化B细胞,促使B细胞产生大量的免疫球白.同时,CD30-CD30L途径可通过与下游细胞内信 号分子——肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)家 族成员结合发挥细胞活化或凋亡等多种效应功能: 一 方面通过活化转录因子NF-xB或AP-1以促进细 胞因子,趋化因子等基因转录;另一方面也通过下游 的TRAF分子经不同途径介导抗凋亡或凋亡作 用l1工J.已有的研究显示,RA患者的CD4T细胞平 衡偏移是以Th2细胞为主,其外周血Th2型细胞的 代表性细胞因子IL-10生成增加,Thl型细胞的代表 性细胞因子1I-2生成减少,CD4T细胞亚群以Th2 型细胞极化方式介导机体的免疫紊乱[3】,高表达的 IL-10一方面促进CD4Th2细胞功能,并参与诱导 B细胞增殖,活化为抗体分泌浆细胞和记忆性B细 胞,使RA患者体液免疫功能亢进,自身抗体合成增 加;另一方面其通过从mRNA水平抑制其他细胞因 子转录来调节微环境而发挥其抗炎效应】. 本文实验结果再次证实,RA患者CD4T细胞 及CD4/CD8T细胞比值均明显增加,CD4T细胞 过度增殖.表3结果显示,参与介导B细胞活化信 号的T细胞表面CD154分子在RA患者的CD4T 细胞和CD8T细胞上的表达均呈显着上调;但 CD30分子在CD4T细胞和CD8T细胞上表达均 降低,并以CD4T细胞上表达的降低更为明显 (P<0.001),提示过度活化的辅助性T细胞上高表 达的共刺激分子CD154(CD40L)与B细胞上CD40 分子相互作用在介导T-B淋巴细胞间信号传导和B 细胞异常免疫功能亢进中起重要作用.RA患者T 细胞上CD30分子的低表达提示,在参与淋巴细胞 中国免疫学杂志2005年第2l卷 活化和介导T-B淋巴细胞信号传导的复杂共刺激分 子对网络中,CD40一CD40L(CD154)分子对的效应作 用强于CD3o-CD30L(CD153).但有文献报道,CD30 分子更常以可溶性形式存在于外周血及关节液中, 而且因其功能亢进所致抗炎性细胞因子IL-10增加 可产生保护性抗炎作用】,提示RA患者T淋巴细 胞上CD30分子表达的降低是否因其脱落为可溶性 形式而参与机体抗炎性反应,值得我们进一步分析. 自身免疫性疾病T淋巴细胞凋亡信号的表达与 细胞凋亡也是目前关注的热点.T淋巴细胞凋亡主 要是通过Fas(CD95)一FasL途径的信号传导为主. CD95(Fas)分子属肿瘤坏死因子受体超家族(TNFR— SF),其表达于多种细胞,活化后表达上调.Fas/FasL 相互作用后可介导表达Fas分子的细胞发生凋亡. 表4结果显示,RA患者T细胞亚群上凋亡诱导分子 CD95表达均显着增加,提示RA患者T细胞对Fas 介导的凋亡敏感性增加,但RA患者T细胞最终是 否发生凋亡还与微环境中可溶性CD95分子,活化T 细胞表面CD95L及可溶性CD95L的表达和它们的 共同效应结果有关,本资料仅提示,RA患者T淋巴 细胞上多个细胞信号传导的共刺激分子均呈异常表 达,这些异常表达的信号通路导致的细胞效应结果 尚有许多问题待进一步探讨. 本文结果显示,RA患者外周血T细胞亚群明显 偏移,CD4T细胞增加,共刺激分子CD30和CD154 在T细胞亚群上表达异常,提示T细胞免疫功能紊 乱,其对B细胞可能产生过度的活化辅助效应,而 致高滴度IgC,I,IgA型免疫球蛋白生成.另一方 面,我们推测:T细胞表面虽有CD95分子的高表达, 但由于T细胞表面CD154分子高表达,CD30低表达 或其他共刺激分子提供更强的活化增殖信号,可能 导致CD4T细胞最终增加.综上分析,我们认为共 刺激分子的异常表达可通过调节细胞自身微环境变 化和细胞间相互作用强度,而致RA患者体内炎症 细胞因子分泌异常,炎症细胞,自身免疫性细胞过度 增殖活化,自身抗原过度暴露,自身抗体过度生成, 最终造成患者多关节及全身慢性炎症免疫反应. 4参考文献 lHorleR,AizawaS,?gajMd?1.AnoveldomainintheCD30cyto- plasmictailmediatesNV-hpp~activation[J].InternationalImmtmolo- ,1998;10(2):203-210. 2ArchRH,GedrichRW,.n10l1?)80rICB.Transloeation0fTRAFproteins ~aalatesapoptotlethreshold0fcells[J].Biochemical&Bi嘶BicalRe- se,aldlC,onmmnieatiom,20130;272(3):936-945. 3王兰兰,李立新,刘瑾d.类风湿性关节炎患者T细胞亚群 王兰兰等淋巴细胞共刺激信号和凋亡信号异常与RA免疫效应亢进的研究第12 期 失衡与炎性粘附分子的关系[J].中国免疫学杂志,2002;18(5): 378-380. 4ContiP,KeIT幔iD,KandereKeta1.IL-10,aninflammatorflinhibi— torycytokine,butnotalways[j].ImmunologyLetters,2003;86(2): 123.129. 5MocellinS,PanelliMC,WangEd.,I1ledualroleofIL-10[J]. 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[收稿2004-05.14修回2004-07.26] (编辑曲莉) 2006年《中国免疫学杂志》第九届学术研讨会拟于安徽九华山召开 为了推动我国免疫学的发展,促进我国免疫学各学科间的学术交流,增强对广大作 者,读者需求的了解, 由《中国免疫学杂志》编辑部主办的第九届学术论文研讨会,拟于2006年下半年在安徽九华山召开. 1.主题:基础,临床免疫方面诊断,治疗,预防以及新技术和新方法. 2.内容:论文为未在国内外学术会议及正式出版物发表的近期研究成果.征文范围包括:分子与细胞 免疫学,肿瘤免疫学,中医中药与免疫,生殖与遗传免疫,神经内分泌,临床免疫(诊断和治疗),免疫学新技术 与新方法,红细胞免疫,兽医免疫及与免疫相关的各分支学科,综述及教学园地也可. 3.投稿格式要求:详见2005年出版的《中国免疫学杂志》.投稿须附300字左右的中文结构式摘要(目 的,方法,结果,结论).' 4.征文截止时间:2oo6年8月30日. 5.经专家评审后,被录取者将发具体通知,会议期间将从大会交流的论文中评选出优秀论文,在本刊 '学术会议优秀论文选登'栏目中刊出,其余会议交流的论文将发表在《中国免疫学杂志~2006年专刊上.参 会代表将颁发继续教育学分卡(I类5分). 6.投稿请寄:吉林省长春市建政路971号《中国免疫学杂志》编辑中,邮编:130061,E.mail:zhmizazh@si— na.com.并在论文右上角标明"会议征文"字样,同时寄审稿费3O元(注明会议审稿费). ? 消息? 《中国免疫学杂志》将再增页码 为了适应免疫学科发展的需要,加快信息传递速度,增加杂志刊载量,应广大作者的强烈要求,2006年 《中国免疫学杂志》将从缩短刊发周期,降低稿件积压人手,在原来多次调整页码 的基础上,再次增加l6页, 即月刊,每期96页,欢迎从事免疫学各分支学科及其它相关研究的工作者踊跃投稿,本刊接受网上来稿,编 辑部E—mail:zhmizazh@sina.com,zhmizazh@126.como 《中国免疫学杂志》编辑部