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化脓隐秘杆菌溶血素蛋白诱导小鼠巨噬细胞凋亡的研究

2017-09-21 40页 doc 70KB 30阅读

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化脓隐秘杆菌溶血素蛋白诱导小鼠巨噬细胞凋亡的研究化脓隐秘杆菌溶血素蛋白诱导小鼠巨噬细胞凋亡的研究 化脓隐秘杆菌溶血素蛋白诱导小鼠巨噬细胞凋亡的研 究 :. : . /: : :: : :: ’,一。:?竺圳删 ????皇量?璺曼舅?舅曼皇??曩?????????????????量量墨皇皇 量??置????????一 目 录 躏要?.英文摘要前言..?. .化脓隐秘杆菌感染的概况.化脓隐秘杆菌病原学概述...? .化脓隐秘杆菌的主要毒力因子 一/四 ..溶血素 ..神经氨酸酶??. ..胶原结合蛋白 ..菌毛合成蛋白? ..其他毒力因子?....
化脓隐秘杆菌溶血素蛋白诱导小鼠巨噬细胞凋亡的研究
化脓隐秘杆菌溶血素蛋白诱导小鼠巨噬细胞凋亡的研究 化脓隐秘杆菌溶血素蛋白诱导小鼠巨噬细胞凋亡的研 究 :. : . /: : :: : :: ’,一。:?竺圳删 ????皇量?璺曼舅?舅曼皇??曩?????????????????量量墨皇皇 量??置????????一 目 录 躏要?.英文摘要前言..?. .化脓隐秘杆菌感染的概况.化脓隐秘杆菌病原学概述...? .化脓隐秘杆菌的主要毒力因子 一/四 ..溶血素 ..神经氨酸酶??. ..胶原结合蛋白 ..菌毛合成蛋白? ..其他毒力因子?. .胆固醇依赖性的溶细胞素 ..??....?; .. 与...? .巨噬细胞 ..巨噬细胞与免疫。 ..巨噬细胞的生物学功能? ..巨噬细胞源性的细胞因子? ..细胞凋亡及其途径? ..细胞凋亡的检测方法.. .研究的目的和意义 材料与方法? .材料??。 ..试验动物、细胞? ..菌种与质粒??...??。 ..引物设计与合成.. ..主要试剂及抗体...??.... ..主要溶液的配制...??..... ..主要仪器...??...??.. .化脓隐秘杆菌溶血素基因的克隆与达. .. 的克隆与表达?...??。 ..兔抗.多克隆抗体的制备与反应性分析...??。 ..表达蛋白的溶血活性及其多抗的抗溶血活性?.. ..溶血素诱导小鼠巨噬细胞.凋亡的检测东北农业大学农学硕士学位论文 ..溶血素诱导小鼠巨噬细胞.分泌细胞因子检测. 结果与分析?。 .化脓隐秘杆菌溶血素基因的克隆与表达. .. 基因的克隆 ..重组表达载体的构建。??。 ..溶血素蛋白的原核表达??. ..重组溶血素蛋白的 鉴定??。 ..溶血素蛋白的纯化?.. .兔抗多克隆抗体的制备与反应性分析 .. 分析??. ..琼脂双扩散试验分析。 ..兔抗.蛋白多克隆抗体效价测定? .溶血试验?. ..重组蛋白的溶血试验 ..多抗中和.的抗溶血活性? .溶血素诱导小鼠巨噬细胞.凋亡的影响.. .对小鼠巨噬细胞损伤的形态观察。 .. .蛋白抑制凡州“.细胞生长.. 分析..流式细胞仪检测.细胞凋亡率.. 的活性检测? ..细胞因子检测结果? 讨论.溶血素蛋白的原核表达?。 .溶血素蛋白试验剂量的选择.溶血素与炎症反应?. .溶血素与细胞凋亡? .溶血素、炎症反应、细胞凋亡与感染免疫??. 结论【谢.: 参考文献? 攻读硕士期间发表的论文 ??.?.”。?...。.??。??” . . ..?。??. ....?... .. ... .. .,? ..?矗?.。 .. .?。.... .. .. .?。??. ..??.?..??.? ..??. .?。?.??.? .??.。?..?.??..?..。? ..??.?。?.?...??..??. .. ..?..??。?。 ..?。.. ..??.。..?” ..?..。?.?..??.??。??.?. . ...?.?.?.” .. ...?.?..。。.?.?..??。?。?。?。“.??”?. .. .?.... 东北农业大学农学硕士学位论文? .. 懿??...??. ...?. .. ..?. .. ...??...??...?,?. ..??..?.. .. .??...??....?.. . .?. ..?. .....??.??.??. ..??. ..??.??..。??.??.??. . .?.. . ..??.... .、、..... 圈蛐摹??.. . ?学位论文独创声明与使用授权 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果,也不包含未获得?? .洼垫遗直基丝孟薹挂别直明的:奎拦亘窒?或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 ?一摊。哟勃吼脚?日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解 密后适用本授权书 学位论文作者签名 日期:沏缉‖月厂日 导师 签名 日期:如马年月日摘 要 摘要 化脓隐秘杆菌 是革兰氏阳性短棒状杆菌,是牛、羊和猪等重要经 济动物的条件性致病菌,常寄生于上呼吸道和消化道的黏膜处,可引起多种器官和黏膜的化脓性 感染,给养殖业造成较大的经济损失。是化脓隐秘杆菌分泌的一种外毒素,是化脓 隐秘杆菌的一种重要毒力因子,具有溶细胞等生物学活性。但是溶血素在化脓隐秘杆菌感染宿主 的过程中的毒力机制,目前尚不十分清楚。 本研究克隆了编码化脓隐秘杆菌溶血素蛋白的基因,进行原核表达,检测表达蛋白 的溶血活性,发现表达的重组蛋白具有明显的溶血活性,并利用重组蛋白制备了多克隆抗 体,所制备的多抗能够有效的阻断溶血素的溶血活性。 将重组蛋白作用小鼠腹膜巨噬细胞.,光学显微镜与电子显微镜观察表明重组 能够诱导.细胞发生明显的细胞凋亡现象,如凋亡小体的出现、核固缩、染色 质聚 集等: 检测结果显示,染色体在琼脂糖凝胶电泳后出现典型的“梯形”条带; 法检测细胞凋亡率,流式细胞仪分析结果显示:. ./溶血素处理.细胞 小时后细胞凋亡率达到.%;法检测对.细胞的增殖抑制作用,结果显 示:一定浓度下溶血素蛋白对小鼠.有明显的增殖抑制作用,呈剂量和时间依赖性;试 活性均比对照组升高:并检测重组蛋白对 剂盒检测 的活性,发现勰 .细胞分泌.、.、、.、.等细胞因子的影响,结果显示:. 细胞负载溶血素后盯吨、、、细胞因子分泌量有不同程度的提高。这表明溶血素 蛋白能够诱导巨噬细胞发生凋亡,并产生一系列细胞因子。 综上所述,本研究原核表达了化脓隐秘杆菌溶血素蛋白,鉴定其生物学功能并将其作用于小 鼠巨噬细胞.,研究溶血素诱导小鼠巨噬细胞凋亡,为溶血素的毒力机制和化脓隐秘杆 菌致病机制研究提供了基础与依据。 关键词化脓隐秘杆菌;溶血素:细胞凋亡:., , , . ,,,, 锄 . , . .,,...,. . ..,.. ?./ , ,, .:”” ?. /? ..% . .,/. ?. 虾?%? ,,,, . . . .. .. : ;;;. 东北农业大学农学硕士学位论文 : : :. 前言 ?.‘一?, 日 舌 .化脓隐秘杆菌感染的概况 化脓隐秘杆菌 现已从隐秘杆菌属中划分出来,归为 .,目前尚未确定其新的中文译名,本研究中称为化脓隐秘杆菌。作为条 件性致病菌,常常寄生于上呼吸道、消化道的黏膜处,其感染的源头多为内源性的。化脓隐秘杆 菌引起动物多种器官、黏膜的化脓性感染。像肺炎、子宫内膜炎、肝脏脓肿、乳房炎、关节炎、 骨髓炎等,严重时,常因脓毒败血症引起死亡。化脓隐秘杆菌可以引起羚羊、骆驼、猪、狗、猫、 象、瞪羚、非洲大羚、鹦鹉、马、鹿、驯鹿、火鸡等多种动物感染。有报道人也可感染此菌川。 化脓隐秘杆菌是牛呼吸道疾病综合征 ,重要的细 菌性病原之一嘲。当细菌性病原体和病毒性病原体相互作用时会加重病情,导致严重的纤维素性 肺炎。呼吸道病毒感染肺部后细菌继发感染的机会明显增加。引起牛呼吸道疾病的病毒包括牛 呼吸道合胞体病毒 ,.牛疱疹病毒型 ,,牛副流感病毒 .,,牛病毒性腹泻病毒 型 ,以及牛冠状病毒 。。引起 的细菌病原体包括化脓隐秘杆菌,溶血性曼氏杆菌 , .,多杀性巴氏杆菌,.,昏睡嗜血杆菌 。脱.以及 海藻糖 ...牛支原体 巴氏杆菌】。牛呼吸道疾病综合征主要表现为纤维素性支气管肺炎和化脓性支气管肺炎,还 有的伴随有关节炎。肺炎主要发生在月龄的犊牛,主要是因为感染病原体或者应激因素引起, 比如气候的改变、断奶、运输和混群等相互左右引起的”。在加拿大的安大略省报道因为患 而死亡的病牛中.膨引起的相关疾病占%、占%、占%、占%、 占%、占%、膨占%、户占%、.占%、. 占%.这些病原是引发肺炎并导致死亡的最普遍原因,其中犊牛占死亡总数的%。化脓隐秘 杆菌给畜牧业造成了巨大的损失【?。 动物感染化脓隐秘杆菌后,初期体温一般不高,但精神萎靡,结膜充血,食欲减退或废绝。 感染后期咳嗽气喘,伴有腹式呼吸,有腹泻症状,在身体多部位出现圆形肿胀,肿胀直径的大小 约,多在腹部出现,有波动感,内为炎性渗出物埘.化脓隐秘杆菌感染肺部后,感染动物 出现呼吸困难,体温有升高现象,若转为慢性经过,体质逐渐无力、消瘦,最后 死亡。若是急性 经过的动物出现耳发绀、怕冷、少食或不食症状。病程.天不等,最后死亡。当感染乳房时. 乳房有结节状结实的肿块并伴有炎症。化脓隐秘杆菌引起关节炎时,患病动物表现为关节部位肿 大、变硬,之后则逐渐变软,形成脓疱,最后导致跛行或卧地不起【嘲. 化脓隐秘杆菌感染后出现诸多病理变化,肉眼观察看见病变组织脓肿,或有化脓性肉芽肿. 病变组织呈现干酪样坏死。在脾脏、肝脏、肾脏、肠和大脑有肉眼变化,表面可见出血灶.并相 东北农业大学农学硕士学位论文 互融合。脾脏病变时正常的脾组织被红细胞和坏死的细胞填满。肺脏中有充血现象,肺间质增宽, 呈灰白色条索状。淋巴结肠道、颌下、颈下、骨骼下等肿大,有结节,结节外有包膜,包膜 中有大量的组织细胞。肝脏呈土黄色,变性肿大。肾脏内看见间质性肾炎。心外膜有出血点。 .化脓隐秘杆菌病原学概述 化脓隐秘杆菌是革兰氏阳性,短棒状杆菌,无鞭毛、不运动,无芽孢,无荚膜的革兰氏阳性 斟加】。该菌在血平板上生长为圆形、光滑、表面突起、灰白色、针尖状菌落,细菌培养到后 菌落可长到直径,菌落周围形成典型的溶血。美蓝染色着色不均。其最适生长温度为?, ?可生长:在有氧和无氧条件下均可生长,%%的条件下生长良好【?。 化脓隐秘杆菌生化鉴定显示其在血清斜面上生长时菌落周围有液化坑;发酵乳糖、半乳糖、 麦芽糖、果糖、葡萄糖、木糖、甘油、糊精产酸:不发酵鼠李糖、阿拉伯糖、棉籽糖、海藻糖、 蔗糖、山梨醇、肌醇、卫矛醇、甘露醇、甘油;触酶阴性:吲哚与硝酸盐实验均为阴性;本菌抵 抗力不强,对一般的消毒剂敏感【倒。 .化脓隐秘杆菌的主要毒力因子 化脓隐秘杆菌产生几种毒力因子,这些毒力因子与细菌的粘附、寄生以及引起宿主的组织损 伤密切相关。这些毒力因子的研究为以后开发新的疫苗提供了材料。目前已经发现的毒力因子一 一溶血素,‘捌、胶原结合蛋白. ,孔、神经氨酸酶 ,和以及菌毛合成蛋白,、、 和等。 ..溶血素 年,等从野生型菌株中克隆得到了加基因,获得其全基因序列。加开放性 阅读框共.编码个氨基酸,分子量. 。基因位于.的基因岛上,其上 游是开放性阅读框架,下游为归、历基因。在化脓隐秘杆菌中其管家基因和 加, 被加基因岛分开.且基因岛的屺含量要明显低于周围管家基因的含量,这些都推测可 能与,基因岛的获得方式有关【卯. 溶血素是化脓隐秘杆菌主要的毒力因子之一,所有的化脓隐秘杆菌分离株均能产生 嵋,所以可以此基因建立化脓隐秘杆菌的、 等检测方法孺豫。属于胆固醇依赖性的溶细胞素家族 , , 成员,像肺炎链球菌的溶血素,、单增李斯特氏菌的 等都是家族成员。这类毒素通过在真核细胞上形成孔隙从而发挥其溶细胞活性. 能溶解包括红细胞、巨噬细胞在内的多种细胞,在血平板上形成特异的的.溶血疆.已报道 致多形核白细胞、鼠的腹膜巨噬细胞等细胞损伤的作用【 前 言 此外,蛋白的端有两段氨基酸序列与的活性密切相关,这两段序列的单抗可以 阻断的溶血活性【】。 ..神经氨酸酶 目前,在化脓隐秘杆菌中发现的了两种神经氨酸酶,即和,基因含有, 编码的蛋白大小,只存在于细胞壁中,且所有的菌种均可分离到基因。化脓隐 秘杆 菌的一株基因突变株.并未完全丧失神经氨酸酶活性,表明了在这一菌株中除了// 外,还存在另一种神经氨酸酶,从而分离鉴定出第二种神经氨酸酶的编码基因,即基因。 基因与基因不同,只存在于部分分离株中.%,基因含有,编码大 小.的蛋白。显示出一些与化脓隐秘杆菌的的相似性.%相同,.%的相似性 【州。 插入失活的或基因得到的突变株表现为神经氨酸酶活性减弱。在. 株内构建和双重突变株导致该突变菌株神经氨酸酶活性完丧失。和双突 变株粘附到细胞的能力与或单一突变株相比减少约%,这些数据表明,除了 和两种神经氨酸酶之外,没有其他的神经氨酸酶;化脓隐秘杆菌的神经氨酸酶 和对宿主上皮细胞的粘附起到非常重要的作用引。 许多细菌的神经氨酸酶是相似的,像粘性放线菌 、小单胞菌属 、脆弱拟杆菌等训。此外,蛋白含 有保守的具有催化特性的/基序,以及个副本框基序,这都与细菌 神经氨酸酶相关。位于化脓隐秘杆菌细胞壁末端,与革兰氏阳性细胞壁锚定基序? 相符合.而革兰氏阴性细菌神经氨酸酶通常是被分泌的,.神经氨酸酶和粘性放线 菌彳.神经氨酸酶也通过类似的机制锚定在细胞壁上。 神经氨酸酶可以分解宿主细胞的唾液酸作为碳源,其生物学作用主要是降低膜表面粘液的粘 滞性,增强细菌对宿主的粘附、定植作用.便于病原菌进入深层组织等。另一个有利的致病因素 是,神经氨酸酶的酸化作用增加了粘膜免疫球蛋白对细菌蛋白酶的易感性,从而损害宿主的 免疫应答?’。 ..胶原结合蛋白? ,是化脓隐秘杆菌中发现的第一个粘附素, 胶原结合蛋白? 基因有.编码.。序列分析显示在的端有一个配体结合区域即区 域,在其端有一个重复区域即区域,序列分析证实为典型的细胞表面粘附素家族的成 员,主要的作用是连接胶原蛋白,促进细菌对宿主的粘附,从而增强细菌的侵袭力,提高毒力捌. 是化脓隐秘杆菌胞外基质结合蛋白 . 的一种,这 上.这种被 种胞外基质结合蛋白主要作用是粘附到宿主的细胞外基质 病原菌作为粘附受体的主要包括胶原蛋白、纤维连接蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、弹 东北农业大学农学硕士学位论文 性蛋白等。在许多细菌病原菌中已证实被细菌微型表面成分识别粘附基质分 子 ,识别,从而达到粘附作 用。与金黄色葡萄球菌的胶原蛋白有部分相同,大部分相似。 等证明能促进化脓隐秘杆菌粘附于细胞 仅存在于部分菌株中。 株、细胞系。敲除了基因的突变体明显降低了其结合到上皮细胞系及成纤维细胞系的 能力【。在天然阴性分离株中发现的表达明显增强该菌株的粘附性。因此,这种能 力可以促进菌体结合宿主的胶原蛋白从而在组织中定居。 ..菌毛合成蛋白 有关化脓隐秘杆菌的菌毛结合蛋白的报道较少,对菌毛结合蛋白的研究不像大肠杆菌的那么 详尽。目前报道的有、、和,其中只有存在于所有的分离株中。 菌毛是丝状、蛋白性质的表面附加物,普遍存在于革兰氏阴性菌表面。有些革兰氏阳性菌像 化脓隐秘杆菌,棒杆菌属 .放线菌属 等菌体表面存在 菌毛。这些革兰氏阳性菌表面的菌毛结构特点与革兰氏阴性菌的菌毛相似,长.,宽 ..。 在化脓隐秘杆菌中已经鉴定了一个菌毛操纵子,此操纵子在遗传结构上与内氏放线菌 .型的株菌毛基因操纵子相似,由力蒯,和分 型菌毛亚单位有% 选酶基因组成。化脓隐秘杆菌/编码的蛋白。与. 的相同和%相似性,蛋白大小. ,蛋白含有一个信号肽,细胞壁分选区域。 在末端,.,与氨基酸相似性为%,是假定的. 型菌毛粘附 素,蛋白含有一个信号肽,细胞壁分选区域,纤维连接蛋白结合域和盒。编码一个 假定的分选酶,大小.,与. 氨基酸有%的相似性【孓。 化脓隐秘杆菌的菌毛认为与病原菌的粘附有关,在化脓隐秘杆菌中是否还存在其他的菌毛合 成蛋白以及各菌毛合成蛋白的具体机制尚不了解,仅知其在细菌粘附中起着非常重要的作用. ..其他毒力因子 化脓隐秘杆菌除了以上四类毒力因子外,还存在其他与其致病力相关的毒力因子。像能与纤 维蛋白原结合,促进其粘附作用的纤维蛋白原结合蛋白. ,还可以通过 多形核细胞促进吞噬作用。纤连蛋白结合蛋白. 同过与纤 连蛋白结合促进粘附作用。脱氧核糖核酸酶,通过分解宿主的核苷酸,为自身提供营养 ..蛋白酶分解宿主的蛋白质,从而利用氨基酸作为自身的营养物质,还可以分 解,这与宿主的防御反应有关。还有其他的与其毒力相关的因子。能侵入上 皮细胞的能力,是病原菌隐蔽在小环境中,从而避开宿主的防御和抗微生物药物.在巨噬细胞内生存的能力 .形成生物膜 .生物膜保护细菌免受物理、化学和宿主细胞的作用,抵抗吞噬,对抗菌药物的耐药 前 言 性,以及在持续感染中起重要作用。有研究表明生物膜的形成也可能产生毒素。 .胆固醇依赖性的溶细胞素 .. 胆固醇依赖性的溶细胞素家族 ,,这类毒素通 , 过在真核细胞上形成孔隙从而发挥其溶细胞活性。像单增李斯特氏菌溶血素 ,产期荚膜梭菌溶血素,,肺炎链球菌溶血素,和 ,等都是此家族成员。有一个相当保守的三维结构,此 链球菌溶血素 结构中包含个折叠富集区域,其中仅有端区域连接在此氨基酸序列的主要区域内。区域 与寡聚化及膜插入有关,而区域识别宿主细胞膜,与胆固醇相互作用,并含有独特的十一肽 序列。该家族成员中十一肽序列可能与胆固醇作用相关。 目前胆固醇依赖性的溶细胞素家族成员中研究较多的是肺炎球菌溶血素、单增李斯特氏菌溶 血素蛋白等诱导细胞凋亡。..等研究发现肺炎球菌溶血素蛋白能诱导人单 核巨噬细胞分泌刺激人单核巨噬细胞产生吨、.。刺激小鼠巨噬细胞产生., 并且胆固醇不能阻断诱导鼠巨噬细胞产生,但是却能明显阻断的细胞毒作用【鲥,。 等研究作用于鼠巨噬细胞和脾细胞,通过反转录检测相关细胞 因子的分泌,结果表明巨噬细胞在刺激后能明显产生.、、,并且还证明 是由细胞分泌产生的啪。 等利用溶血单增李斯特氏菌和无溶血的增李斯特 氏菌突变株分别刺激哺乳动物吞噬细胞以检测相关细胞因子的含量以测定.、.、 .、等细胞因子的分泌情况。结果显示只有溶血株能够诱导细胞产生吨、.、。 无溶血的突变株只能诱导.的分泌。 作为家族中的一员,在溶细胞机制方面的研究较少。.已报道化脓隐秘杆菌 溶血素蛋白对牛多形核白细胞和袋鼠肾细胞具有细胞毒效应,并呈剂量依赖性关 系...研究结果显示重组溶血素蛋白.对小鼠巨噬细胞有细胞毒作用,并呈现 剂量依赖性关系们. .. 与 与其他氨基酸同源性只有 %%。的十一肽序列结构有自己的独特特点 见图..这都使成为该家族中最具有分歧的成员.不具有硫醇活性。且其溶血活 性对还原剂和硫醇阻断剂不敏感。 和人类特异性溶细胞素,中的半胱氨酸残基被丙氨酸替代。半胱 氨酸残基对于大多数的巯基活化有重要意义,但是对的保守序列进行定点突变,用半 胱氨酸代替丙氨酸。形成了一个不稳定的分子.结果显示.对巯基活性物质不敏感与 缺少半胱氨酸无直接关系,并且导致了分子低的溶血活性,所以十一肽序列的不同对 于它的溶细胞活性是必需的悼. 东北农业大学农学硕士学位论文 嚣蘸蓁 奉 掌 ?幸添燃 瓣露瓣 图卜 十一肽序列氨基酸同源性 .? 图中标注的的肽序列是化脓隐秘杆菌溶血素单增李斯特氏菌溶血素,产气荚膜梭菌溶血素,肺炎 球菌溶血素,链球菌溶血素,人类特有的,被标注的是与所特有的氨基酸 ,, ,,. ...巨噬细胞 ..巨噬细胞与免疫 固有免疫是生物在长期进化过程中逐渐形成的防御机制,是机体抵抗病原体入侵的第一道防 线。对入侵的病原体作出迅速应答,产生非特异性抗感染免疫作用,亦可参与对体内损伤衰老或 畸变细胞的清除,同时固有免疫在特异性免疫应答中也起重要作用。巨噬细胞是天然免疫的重要 组成部分,大部分病原菌能被巨噬细胞捕获、吞噬、溶解,小部分致病菌可以逃逸巨噬细胞的防 御。巨噬细胞在机体抵抗病原菌感染中起非常重要的作用。巨噬细胞作为专职的抗原提呈细胞, 在特异性免疫中也有重要作用。 ..巨噬细胞的生物学功能 巨噬细胞可以通过表面模式识别受体 ,识别结合、进而吞 噬杀伤病原体,是机体抗感染免疫的主要效应细胞。还可以通过分泌细胞因子和其他炎性介质, 发挥免疫调节作用和介导炎症反 应。在启动适应性免疫应答过程中也具有重要作用。 巨噬细胞的生物学功能主要包括:一、识别并清除病原体等抗原性物质。这种作用是通过表 面模式识别受体直接识别结合某些病原体的分子相关模型脚。也可通过其表面 受体和补体受体来结合抗体或补体结合的病原体等抗原异物。二、参与和促 进炎症反应。巨噬细胞表面具有单核一巨噬细胞细胞因子受体,与感染部位组织细胞产生的细胞 因子结合,而被募集到感染部位并被活化,使其吞噬杀菌能力显著增强;于此同时。活化的巨噬 细胞又可以通过多种途径参与和促进炎症反应,像分泌促炎症因子、细胞因子和胞外酶等发挥作 前言 用。三、对肿瘤和病毒感染等靶细胞的杀伤作用。静止巨噬细胞本身杀肿瘤作用微弱,但被细菌 脂多糖或和.等细胞因子激活后,能有效的杀伤肿瘤和病毒感染的组织细胞。四、 加工提呈抗原,启动适应性免疫应答。作为专职抗原处理及提呈细胞,可将摄入的外源性抗原和 内源性抗原加工处理为具有免疫原性的小分子肽段,并以抗原肽. /类分子复合物的形式 表达于巨噬细胞表面,供/细胞识别。五、免疫调节作用。活化巨噬细胞可以通过分 泌多种细胞因子,参与免疫调节。 当巨噬细胞发生损伤时,固有免疫将严重受到影响,对病原微生物的吞噬、清除及对感染的 靶细胞的杀伤作用受到限制。同时,在特异性免疫中.巨噬细胞通过 /类分子 对抗原分 子的提呈作用会受到影响强】。 ..巨噬细胞源性的细胞因子 化脓隐秘杆菌感染过程中发生炎症反应,与炎症相关的细胞因子的表达发生变化,从而通过 细胞因子受体传递信号,进一步发挥作用。在溶血素诱导巨噬细胞发生凋亡的过程中产生的细胞 因子影响巨噬细胞的凋亡,它们有的促进凋亡,有的则保护细胞免于凋亡。研究感染过程中细胞 因子,有助于对病原菌感染以及细胞凋亡进一步认识。 肿瘤坏死因子 ,.师是一种多细胞来源,具有杀伤肿瘤细胞的细胞 因子,其中单核.巨噬细胞是其主要分泌来源。.口的抗肿瘤、介导炎症反应等研究的比较详尽 了,它是重要的介导炎症的细胞因子。随着对吨研究的不断深入,发现除了以上活性外,其 对细胞具有诱导凋亡的作用,当机体处于炎症病毒、细菌、寄生虫感染或创伤等病理状态时, 诱导细胞发生凋亡的作用对于清除受损细胞、维持机体内环境平衡起着重要作用。 诱导凋亡的过程可以分为三个阶段,即起始、效应、降解阶段。起始阶段:诱导细胞 凋亡的生物学作用主要通过传递的。吨与结合引起三聚化,通过 受体相关死亡结构域与舔的死亡效应结构域相关蛋白连接,继而与弱笛 天冬氨酸特异性半胱氨酸的连接,从而使部私形成二聚体而自身活化,激活下游的级联 反应最终导致凋亡发生。效应阶段:此阶段涉及到几种重要的蛋白,如.,细胞色素 等,当接受凋亡信号后,引起线粒体的通透性改变从而活化细胞凋亡的级联反应。降解阶段: 各种水解酶和特异性蛋白酶笛船和核酸酶被活化,细胞出现典型的特征。研究表明.诱 导细胞凋亡的途径有三种,过程复杂卵。 自细胞介素,是一大类非均一的调节细胞生长、分化、介导信号传递的多 肽类.白细胞介素..主要是由单核.巨噬细胞产生,包括.和.两种类型,其对 免疫细胞激活,产生细胞毒效应,刺激造血,神经内分泌,通过直接毒性效应、激活免疫细胞以 及诱生抗肿瘤淋巴因子等发挥其抗肿瘤效应。研究认为,凋亡的启动是因为激活了同源性 转化酶蛋白酶家族。 除了以上几种与细胞凋亡及炎症反应密切相关的细胞因子外,还有其他的一些细胞因子与其 也有关系,像、.、.、.及神经生长因子 ,等,都 凋亡过程有一定关系哪. 东北农业大学农学硕士学位论文 ..细胞凋亡及其途径 细胞凋亡是一种在相关基因调控下的细胞程序性死亡,由基因的激活、表达及调 控而作用的,是细胞的基本特征之一,具有典型的形态学特征。细胞凋亡现象广泛,它在机体的 胚胎发育、组织修复、内环境稳定方面起着十分重要的作用。当机体受到细菌等病原体刺激时, 凋亡就成为宿主对病原菌产生先天性免疫反应的表现之一,机体就会发出特定的信号使正常细胞 以特定的途径发生凋亡。当病原体对机体的刺激达到一定强度,正常细胞凋亡过度,就会对机体 造成伤害。凋亡存在于机体的各种细胞中,与许多疾病的发生都相关,因此具有重要意义。 细胞凋亡的途径目前大致分为死亡受体途径外源性途径和线粒体途径内源性途径, 其中线粒体途径中包括内质网途径。死亡受体信号发生途径由细胞外死亡信号激活,死亡信号由 细胞外死亡配体与膜上相应的死亡受体结合而传递入细胞内部,细胞内部的天冬氨酸特异的半胱 氨酸蛋白酶..、.、.等分子被募集激活,从而产生下游一连串生物学效应,最后 、、执行凋亡。其中死亡受体是一类跨膜蛋白,属于肿瘤坏死因子受体.家 族,典型的代表像、、/卵。 线粒体途径引起细胞凋亡主要是线粒体上游信号分子作用于线粒体膜,.蛋白家族活化 形成蛋白通道,线粒体孔 ,开放,凋亡活性物质如细胞 色素、等释放引起下游家族蛋白的活化并作用于相应底物因子细胞凋亡。最后 由、执行凋亡。在线粒体凋亡途径中关键分子和结构有.家族成员;线粒体膜通道, 这些通道的开放与关闭可以引起膜内外离子浓度的变化,促进凋亡物质的释放、凋亡发生;促凋 亡物质,像细胞色素、、凋亡诱导因子、失衡等。不管是哪种途径发生凋亡,都依 赖于的执行。 ..细胞凋亡的检测方法 可以从形态学、生物化学、免疫学和分子生物学等方面检测细胞凋亡.具体的检测方法有细 胞凋亡形态学检测、流式细胞分析、降解分析、凋亡细胞膜改变分析、细胞凋亡相关蛋白分 析、细胞凋亡酶学分析和其他检测方法等【?。 细胞凋亡过程中最明显的证据就是光学显微镜和电子显微镜下观察到的一系列形态学变化。 电镜下观察可发现,胞浆浓缩,核糖体、线粒体聚集,细胞体积缩小,结构更加 致密。核内染色 质逐渐聚成新月状附着于核膜周边,细胞核固缩成均一的致密物,进而断裂成大小不一的片段。 胞膜出芽、脱落变为凋亡小体。 细胞凋亡过程中最具特征性的改变是、依赖性的核酸内切酶被激活,选择性的降解 染色体核小体间的,形成大小不一的片段或多聚体组成的寡核苷酸片段。 . 经溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳呈现“梯状”条带 这些检测方法中,流式细胞术可以通过荧光激发分选细胞,对凋亡进行定量分析. 前言 .研究的目的和意义 化脓隐秘杆菌溶血素蛋白在感染过程中发挥着重要的作用,本研究以溶血素蛋白作用于巨噬 细胞来研究其在感染过程中对宿主细胞的毒力效应机制,从而为溶血素的溶细胞机制、化脓隐秘 杆菌的致病机制以及菌株的毒力因子与宿主反应之间的关系研究提供了基础与依据。 东北农业大学农学硕士学位论文 材料与方法 .材料 ..试验动物、细胞 月龄新西兰大白兔只,购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心; .. 小鼠巨噬细胞.由东北农业大学动物医学学院免疫学与生物制品学教研室冻存以 下简称本实验室。 ..菌种与质粒 化脓隐秘杆菌为本实验室分离并保存;购自全式金北京生物科技有限公司;大 肠杆菌 、感受态细胞为本实验室制备并保存。 ..引物设计与合成 根据文献报道的化脓隐秘杆菌的基因及其上下游序列为参考,采用.软件设计 条引物,以扩增编码成熟蛋白的核酸序列,由北京华大基因公司合成,标注为相应的酶切 位点.见表.。 表引物序列 .引物名称 引物序列 酶切位点 鱼鱼坠 竺? 堡鱼鱼叁兰旦三圣兰垒鱼鱼兰迎:匹鱼垒堡垒鱼堡竺竺 丝型 ..主要试剂及抗体 ...分子生物学试剂 限制性内切酶、试剂等购自宝生物工程大连有限公司; 连接酶购自 公司;辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠 购自大 购自中杉金桥公司;鼠抗化脓隐秘杆菌血清由本实验室制备并保存; 连宝生物工程有限公司: 购自公司:细菌的基因组提取试剂盒购 自百泰克生物技术有限公司;多功能纯化回收试剂盒、高纯度质粒小量制备 试剂盒购白天 根生物技术有限公司:椰 为公司产品. 材料与方法 ????~暑?一 ...生化试剂 ,二甲基乙?噻唑基,二苯基四氮唑溴化 物、胰蛋白胨、酵母提取物购自公司;丙烯酰胺、。.亚甲基双丙烯酰胺、四 甲基乙二胺、过硫酸铵、二硫苏糖醇、甘氨酸、购自于生物科技公司; 和弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂购自于公司;氯化钠、氯仿、异 丙醇、乙醇、异戊醇、、、磷酸二氢钠、饱和酚等均为天津市永大化学试剂有 限公司 产品;/凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司:.柱式快速细 胞凋亡 检测试剂盒 检测试剂盒购自生工生物工程上海股份有限公司; 购自碧云天生物技术研究所。.、.;小鼠细胞因子检测试剂盒购自北京欣博 盛公司;.、 .、.检测试剂盒购自试剂公司进口分装试剂盒。 ...培养细胞用试剂 培养基、胎牛血清购自于 公司;双抗青霉素、链霉素为哈尔滨制药 六厂产品;胰酶是产品,购自哈尔滨无限峰科技有限公司。 ..主要溶液的配制 ./的.. , .,? ., , .. 调值至.: :.%: 碳酸盐缓冲液.,./: ., ., ,调值 至.: 液体培养基:胰蛋白胨.酵母提取物, 三蒸水定容至,。 蒸汽高压灭菌后待用; 固体培养基:配制好的液体培养基中,按比例每加.琼脂粉,高压灭菌后待培 养基温度降至。左右时,加入相应浓度的抗生素混匀即可; 马丁肉汤培养基:呈取马丁肉汤培养基粉末,加入蒸馏水溶解,分装到所需容 器中, ,蒸汽高压灭菌后待用; 细菌培养血平板:在马丁肉汤液体培养基中添加.%的琼脂粉,高压灭菌后待 温度降到 时,加入%预先室温平衡的无菌脱纤绵羊血,轻轻摇匀后,倾倒入平板中冷却 备用; 包被液:. ,. ,溶于去离子水中,调节值为.; 显色液液:的溶于的,避光保存; 显色液液:过氧化氢尿素/,避光保存; 显色液液:.柠檬酸,.?溶于去离子水中,调节 值为.,保存; 终止液 溶液;浓硫酸.,加至: ?甘氨酸电泳缓冲液:州 .,甘氨酸, .,溶于去离子水中,定东北农业大学农学硕士学位论文 容至,使用时用去离子水稀释到倍: 蛋白酶:蛋白酶溶于中,分装,?备用; 双抗:青霉素万单位,链霉素万单位,溶于灭菌去离子水中,过 滤除菌后分装,.?保存备用; ..主要仪器 琼脂糖水平电泳仪:公司,型 电泳仪:美国.型;公司,.型 双垂直蛋白电泳仪:北京六一,型 半干式碳板转印仪:北京六一,型 微型离心机:美国,型;其林贝尔,.型 台式离心机:德国型 ?离心机:法国,型 型 仪:德国显微镜:,型:奥特光学,.倒置生物显微镜 酶标仪:美国,.型 高压灭菌锅:产品,.型 恒温摇床:中国哈尔滨东明医疗器械,.型 . 二氧化碳细胞培养箱:; 数显电热培养箱:上海博讯实业有限公司,.型 恒温金属浴:杭州博日科技有限公司,型;美国,.型 电热恒温水槽:上海一恒科技有限公司,.型 超净工作台:美国, 型凝胶分析仪:型 超微量紫外厂可见光分光光度计:美国, 超声波破碎仪: 美国 东北农业大学农学硕士学位论文 .化脓隐秘杆菌溶血素基因的克隆与表达 .. 的克隆与表达 ...化脓隐秘杆菌的体外培养 将冻存的化脓隐秘杆菌划线于血平板上,?,%培养箱中培养过夜,挑取有溶 血的 单个菌落于马丁肉汤中?, /,摇床培养至细菌对数生长期。 ...细菌基因组的提取 取对数期化脓隐秘杆菌培养液适量,参照细菌基因组提取试剂盒离心柱型说 明书提 取化脓隐秘杆菌的基因组。 ...加基因的扩增 用引物、?扩增不带有信号肽序列的基因,反应体系如下; .此 、. 皿 此此 细菌基因组 .皿 酶 .此 灭菌 .皿 总体系 此 ? 反应参数为:预变性 ,? ,? ,个循环;?终末 延伸 恒定电压 。取此产物与适量上样缓冲液混匀后加入%的琼脂糖凝胶孔中, 电泳约 ,观察结果。扩增产物用片段纯化试剂盒纯化。 ...重组表达质粒的构建 用.、 分别酶切回收的扩增片段及原核表达载体,反应 体系如下; 纯化的产物 劬 皿 & 儿 灭菌 皿 总体系 此 东北农业大学农学硕学位论文 此 .此.皿 灭菌 止 总体系 皿 用片段纯化试剂盒纯化、回收相应的酶切产物,酶切后的原核表达载体 连接 产物先经%的琼脂糖凝胶电泳后再用片段纯化试剂盒纯化,用 酶?连接过夜,链接体系为: 纯化回收的酶切后产物 止 纯化回收的酶切片 .止 段 连接酶 .乩 × 止 总体系 止 连接产物转化. 感受态细胞,具体步骤为: .?中取出感受态细胞。 将连接产物加入其中,用移液器轻轻混匀,置于冰上。 ?水浴热激.,然后置于冰上。 。 加入 肛,混匀后摇床, /培养 涂布的平板上,平板置于?恒温培养箱,过夜培养。 挑菌培养与提取质粒 随机挑取单菌落数个,分别接种于含卡那霉素 /的液体培养基中,摇床 /培养过夜,依照质粒小量制备试剂盒说明书进行质粒提取。 重组质粒的酶切鉴定 酶切鉴定重组质粒,反应体系如下: 重组质粒 此 / .止 × 止 止 总体系 此 ?水浴 .%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。鉴定正确后送北京华大测序,测序正确的 重组质粒命名为. 材料与方法 ...重组蛋白的诱导表达 重组质粒.的转化 菌液接种于培养基中,,/培养过夜。 按照试剂盒中质粒小量制备说明书步骤进行质粒提取。 取.重组质粒转化. 俐感受态细胞,步骤同前。 随机挑取个转化子接种至培养基含卡那霉素/中,?振荡培养。 重组蛋白的诱导表达 按%剂量接种阳性菌至的中,,/培养.。 至达..,加入终浓度/诱导表达。 收集菌体并超声破碎,离心后分别取上清和沉淀进行.,确定目的蛋白的表达 情况。 ....重组蛋白的 鉴定 . 取此重组蛋白样品加入等体积的.上样缓冲液,混合均匀后水浴煮沸. 离心,取灿进行%.分析。 鉴定 纯化后的重组蛋白.经.后,转印到硝酸纤维素膜上。 %脱脂乳封闭过夜。 用洗三次,/次,小鼠抗化脓隐秘杆菌血清:,孵育。 用洗三次,次,洗涤后加入心标记的山羊抗鼠:,孵育 。 用洗三次,次,洗涤后用氯?奈酚,.显色. 甲醇%双氧水. ....重组蛋白的纯化 参照前面的方法对重组蛋白进行大量诱导表达,采用. 纯化重组蛋 白,按照说明书进行可溶蛋白的纯化。 ..兔抗多克隆抗体的制备与反应性分析 ...兔抗化脓隐秘杆菌溶血素的多克隆抗体的制备 新西兰白兔,免疫前采血,用做兔阴性血清。纯化后的.蛋白与弗氏完全佐剂: 乳化,按 /,皮下多点注射新西兰白兔。周后.与弗氏不完全佐剂: /乳化后按 /只,皮下多点注射新西兰白兔。二免后天心脏采血,分离血 清,.保存。 东北农业大学农学硕士学位论文 ...免抗.蛋白多克隆抗体的反应性分析 分析兔抗.蛋白的多克隆抗体的反应性 化脓隐秘杆菌天然蛋白的获取:将化脓隐秘杆菌在马丁肉汤中正常培养过 夜, /,离心收集培养上清,缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液。沉淀过夜,/,获得 沉淀蛋白,沉淀蛋白用悬起,并用 透析。 取此浓缩蛋白样与等体积的上样缓冲液混匀后取灶进行.,电泳结束后 转印至硝酸纤维素膜上,。 %脱脂乳?封闭过夜。 用洗三次,次,制备的多克隆抗体:稀释作为一抗,?孵育。 用洗三次,/次,洗涤后加入标记的山羊抗兔:为二抗,? 孵育。 用洗三次,/次,洗涤后用.氯..奈酚.,.显色. .甲醇 %双氧水显色。 双向免疫琼脂扩散试验检测兔抗.蛋白的多克隆抗体的反应性 制作%琼脂糖平板 称取琼脂糖.,加入生理盐水,微波炉中加热融化,倾倒入洁净灭菌的平皿中。 待 琼脂糖凝固后,用打孔器在琼脂平板上打出梅花状孔,孔径,孔距。 双向免疫琼脂扩散试验 在中心孔中加入上述饱和硫酸铵浓缩的化脓隐秘杆菌培养上清,周围孔分别 加入不同稀释倍 数的兔抗.血清、、、、、倍稀释,以及对照孔。将平皿放入湿盒内, 于?温箱内放置后观察结果。 ...兔抗.蛋白多克隆抗体效价测定 采用间接方法测定.多克隆抗体的效价。用唱/纯化透析后的 蛋白斗孔,包被酶标板,孵育过夜。用.%的脱脂乳封闭,每孔?,?孵育, 洗三次备用。以制备的多克隆抗体倍比稀释后作为一抗,以免疫前兔血清做 为阴性对照, 帆,孵育。洗三次后每孔加入以标记的山羊抗兔为二抗 :,孵育,洗三次。进行显色,?恒温孵育左右,待出现明 显颜色变化时浓硫酸终止显色,测定在处的的吸光值. ..表达蛋白的溶血活性及其多抗的抗溶血活性 ...重组蛋白的溶血活性 取新鲜的绵羊血制成%的红细胞悬液,每孔加入止至血凝反应板中。 然后每孔加入止不同浓度的反应孔中蛋白终浓度分别为.、.、 .、.、.、.、、、/. 材料与方法 ?曼量量昌詈?量?墨???量量???曼量置曼曼舅曼曼皇曼曼曼皇量罾 暑鼍曼曼曼曼量鼍量曼曼曼鼍鼍量?置目曼曼量曼笪蔓量量曼曼蔓曼皇曼曼曼 曼皇一 每孔再加此。另设对照即/,与空白对照即 ./,? . ?温箱孵育。观察不同浓度的.的溶血情况。 ...多抗抗.的溶血活性 每孔加入? 此,使反应孔中蛋白终浓度为./。 每孔分别加入皿不同稀释倍数的多抗、、、、、、、、、、、 ?,设/无溶血对照孔,/完全溶血对照孔,兔免 疫前血清作为阴性对照。 ?作用,每孔加入此红细胞悬液。 温箱孵育。观察不同稀释倍数的多克隆抗体的抗溶血活性。 ..溶血素诱导小鼠巨噬细胞.凋亡的检测 ... .对小鼠巨噬细胞损伤的形态观察 普通光学显微镜观察:用含%胎牛血清的含/青霉素、/ 链霉素培养基培养.细胞,调整细胞状态至生长良好时,取对数生长期的. 细胞,.%的胰酶消化后,血球板计数配成细胞密度为×/的细胞悬液,取细胞 悬液../ 孔接种于孔细胞培养板中,置?,%细胞培养箱中培养让细胞贴壁牢固后,弃 去 未贴壁的细胞,再用洗次后,向细胞孔中加入表达纯化的.蛋白,使终浓度为 ./,同时设有的培养液%胎牛血清对照孔。置、%恒温箱孵育、 ,倒置显微镜观察细胞形态变化。 透射电子显微镜观察: 同上培养细胞,血球板计数配成细胞密度为×/的细胞悬液后,./孔接种于 孔细胞培养板,,%培养箱中贴壁培养,弃去未贴壁细胞。用洗次后,向 细胞孔中加入表达纯化的蛋白,使终浓度为.陷/,同时设有的培养液% 胎牛血清对照孔。置?、%恒温箱孵育. 前固定:弃尽培养板中上清,加入洗两遍,.%的胰酶消化后收集细胞,?. /,/次,洗两遍细胞,得到的细胞沉淀用.%戊二醛重悬后固定过夜。, /,离心弃去固定剂,用.洗两次,每次. , 后固定:%锇酸固定液固定 /,离心弃去锇酸,用. 洗两次,每次。 琼脂预包埋:琼脂加热后,包埋细胞沉淀样品,待其凝固。 脱水:在?下,用梯度乙醇%、%、%、%脱水,每次,其中% 乙醇脱水两次无水乙醇与%丙酮:/脱水,%丙酮室温。 侵透:纯丙酮与包埋液:/室温混匀器上作用纯丙酮与包埋液:/ 室温混匀器上作用;纯丙酮与包埋液:/室温混匀器上作用过夜。 东北农业大学农学硕士学位论文 包埋:细胞团块放于胶囊孔,取滴包埋剂加入胶囊模块中,放入烘箱中,使 之固化为硬块。 修块与切片:将包买块固定在超薄切片机上,切厚约 的半薄切片,用苏木精.伊红 染色:镜下观察细胞图像,确定进行超薄切片的部位;清洗干燥目铜网,制备好支持膜,固 定包埋块,切取?厚的超薄切片,保存在干燥器中待染色。 染色:用醋酸铀一枸橼酸铅双染色法对切片进行染色,切片染色后晾干待观察。 ... 增殖抑制试验 取对数生长期的.细胞,.%的胰酶消化后,血球板计数配成细胞密度为/ 的细胞悬液,取细胞悬浮液/孔接种于孔培养板,置,%培养箱中常规培养 ,弃去未贴壁细胞。用洗次后,向细胞孔中加入不同浓度的表达纯化的.蛋白 终浓度分别为./、./、/、/另设加入等量培养液的阴性对照组, 每个实验组做个复孔。置、%恒温箱培养、、、、、后加入/ 溶液,置、%恒温箱继续孵育,缓慢吸弃孔内的培养上清液。每孔再加 入斗的,振荡使结晶溶解。然后用酶标仪测定不同蛋白浓度,不同作用时间下细胞的 吸光度。实验重复次,计算溶血素蛋白对.细胞的生长增殖的影响。计 算按公式:细胞增殖抑制率%.药物/对照×%。 ...凋亡细胞的 生化分析 取对数生长期的.细胞,.%的胰酶消化后.血球板计数配成细胞密度为 /的细胞悬液,取细胞悬浮液按./接种于孔培养板,常规培养,然后弃去 未贴壁细胞。洗次后,向细胞板孔中加入表达纯化的不同浓度.蛋白终浓度分 别 为/、.上/、./、./、./、/、/置、% 恒温箱培养,弃掉培养上清,收集细胞,按照 检测试剂盒说明书操作,获得的 样品加入适量上样缓冲液混匀后,进行%的琼脂糖凝胶电泳/,,在紫外扫胶仪 下 观察结果。 同上培养.细胞于孔细胞培养板中,向细胞板孔中加入表达纯化的 蛋白,使其终浓度为.位,置、%恒温箱培养、、、、、、 。按照 检测试剂盒说明书操作,获得的样品加入适量上样缓冲液混匀后,迸行 %的琼脂糖凝胶电泳,,在紫外扫胶仪下观察结果。 ... /双标法检测细胞凋亡百分率 同上培养.细胞于孔细胞培养板中,向细胞孔中加入表达纯化的蛋白终 浓度为./另设加入等量培养液的阴性对照组,置、%恒温箱培养后收集 各细胞。参照 /凋亡检测试剂盒操作说明书进行,用流式细胞仪检测结果. ... 活性检测 同上培养.细胞于孔细胞培养板中,向细胞孔中加入表达纯化的.蛋白, 材料与方法 使其终浓度为../,置‘,%培养箱中常规培养培养、、,按照 活性试剂盒检测的操作说明,进行处理样品,用酶标仪检测处的吸光度值。通过标准曲 含量。 线计算负载溶血素蛋白实验组和对照组的 ..溶血素诱导小鼠巨噬细胞 .分泌细胞因子检测 取对数生长期的.细胞,.%的胰酶消化后,血球板计数配成细胞密度为 ×/的细胞悬液,取细胞悬浮液旺厅接种于孔培养板,置?,%培养箱中 常规培养,弃去未贴壁细胞。用洗次后,向细胞板孔中加入表达纯化的不同浓度. 蛋白终浓度分别为/、./、./、/置?、%恒温箱培养、 、、,收集上清,?/离心以除去培养上清的颗粒物质,收集离心后的 上清后按照细胞因子检测试剂盒说明书进行检测。最后利用酶标仪读取,通过标准曲线 计算.细胞负载不同浓度.蛋白,在不同时间下的相关细胞因子的分泌量。 ;: 扩增目的基因 东北农业大学农学硕士学位论文 结果与分析 .化脓隐秘杆菌溶血素基因的克隆与表达 .. 基因的克隆 以化脓隐秘杆菌基因组为模板,利用特异性的引物、克隆基因,扩增产物经 琼脂糖凝胶电泳分析,结果显示获得了的片 段,大小与预期相符,结果见图 所示。 . ? :分子质量标准:扩增产物::阴性对照 : ;: 图. ...重组表达载体的构建 将片段连接到载体中。重组质粒的酶切和鉴定结果见图所示。 结果分析 】:分子质量标准;:扩增;:重组质粒..;: 酶切 ;:酶切??;: 酶切? ::: ;: ?;: 一::一 ;:图?重组质粒..的及酶切鉴定 .? 一一 ..溶血素蛋白的原核表达 将阳性的重组质粒 转化至感受态细胞,经 /诱导后,收集菌体进行.分析,结果显示在处有新的条带表达,大 小与预期相符;重组蛋白以可溶和包涵体的形式存在见图.。 .东北农业大学农学硕士学位论文 :分子质量标准::诱导前一/; :诱导后一/;:空载体对照/ : ;:??/ ;:? /;:/ 图. .分析.的表达 .?..重组溶血素蛋白的 鉴定 纯化后的重组蛋白.经.后,转印到硝酸纤维素膜上,以小鼠抗化脓隐秘杆 菌血清作为一抗,冲标记的山羊抗鼠作二抗,表达产物经 分析,结果显示在 处出现一特异的条带,其大小与预期相符,证实基因获得表达见图。 . ....:蛋白分子质量标准::纯化后.蛋白 : ;: 图. 鉴定.蛋白 ...溶血素蛋白的纯化 将诱导表达后的蛋白采用. 纯化重组蛋白,纯化后蛋白? 分析见图.。 .....:蛋白分子质量标准;:纯化后.蛋白 :。 叫 .图柱纯化重组蛋白后.分析 ..免抗多克隆抗体的制备与反应性分析 .. 分析 。。‘ 。‘鉴定结果显示所制备的兔抗?多克隆抗体与化脓隐秘杆菌天然蛋白 具有良好的反应活性图。 ......东北农业大学农学硕士学位论文 :蛋白分子质量标准:: 分析.的多抗的反
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