不同fimA型牙龈卟啉单胞菌破坏上皮细胞间连接能力的初步研究 精灵

不同fimA型牙龈卟啉单胞菌破坏上皮细胞间连接能力的初步研究 精灵 不同 fimA 型牙龈卟啉单胞菌破坏上皮细胞 间连接能力的初步研究 苗棣1高雳1 赵蕾2邓辉1吴亚菲2 5 1. 四川大学口腔疾病研究国家重点实验室成都 610041 2. 四 川大学华西口腔医学院牙周科成都 610041 摘要目的 研究不同 fimA 型牙龈卟啉 单胞菌Porphyromonas gingivalis P.gingivalis破坏 上皮细胞间连接能力探讨 fimA 基因型与致病力差异之间的关系。方法 应用不同 fimA 型 P.gingivalis 菌株刺激后 P.gingivalis ATCC 33277 ?型 WCSP115 ?型 WCSP1. 5 ? 10 型 W83 ? 型 3501?型4702Ib 型分别与口腔上皮细胞系 KB 细胞在条 件下共同孵育于 孵育后 0.5h、1h 和 3 h收集细胞蛋白应用 Westen-blot 检测 N-钙粘素 N-cadherin 和β-连环素β-Catenin的动态表达。结果 与对照组比较各 fimA 型 P.gingivalis 对 KB 细胞 N-cadherin 和β-Catenin 蛋白的表达均有明显的降解作用其中? fimA 型 组 N-cadherin 和β-Catenin 蛋白的表达量低于其它 fimA 型组。结论 P.gingivalis 可 15 破坏上皮细胞间连接成分破坏上皮细胞的完整性而?型 fimA 型 P.gingivalis 较其它各型 水解上皮细胞间连接蛋白的能力强于其它 fimA 型。 N-cadherin 和β-Catenin 蛋白且各 fimA 型 P.gingivalis 可降解 KB 细胞 P.gingivalis 的促进作用有所差异。提示: fimA 基因型的不 同可能是 P.gingivalis 的致病力差异的基因基础。 关键词牙周病学牙龈卟啉单胞菌fimA 分型KB 细胞钙 粘素连环素 20 中图分类号R781.4 Proteolysis of cellular adherence junction components by Porphyromonas gingivalis with distinct fimA genotypes on epithelial WU Yafei2 1. State key cells 25 MIAO Di1 GAO Li1 ZHAO Lei2 DENG Hui1 laborotary of oral diseaseSichuan University Chengdu 610041 2. Department of periodontics West China College of StomatologySichuan University Chengdu 610041 Abstract: Purpose To evaluate representative P.gingivalis stains with different fimA genotypes and 30 focus on their effects on the proteolysis of cellular adherence junction components in epithelial cellsKB cells. Methods KB cells were challenged by P.gingivalis stains for different time periods and cell extracts were collected. Proteolysis of cellular adherence junction components N-cadherin and β-Catenin were assayed by western-blots. Results Degradation of N-cadherin and β-Catenin could be detected after incubation of KB cells with different fimA genotypes of P.gingivalis while the stain with 35 type ? fimA genotype had the most potent effect. Conclusion The infection of P.gingivalis interfered with cell-cell adhesion in oral epithelial cells. Thus P.gingivalis could penetrate through epithelial cells and impair the integrity of epithelium. P.gingivalis with type ? had the most efficient ability to degrade the adherence junction components of epithelial cells.n Key words: PeriodontologyPorphyromonas gingivalis fimA genotypesKB cellscadherin catenin. 40 基金项目国家自然科学基金资助项目 30471890高等学校博士学科点专项科研基金20070610066 作者简介苗棣1982-女博 士研究生主要研究方向牙周病的病因和发病机制 通信联系人吴亚菲1963-女教授博 士生导师主要研究方向牙周病的病因和发病机制. E-mail: yafeiwutom.com 0 引言 牙周炎是成人失牙的主要原因近年的研究表明其与诸多系统性疾病如心血管疾病、 早产低出生体重儿等关系密切1。牙龈上皮细胞Gingival epithelial cells GECs是抵御 口 腔中致病微生物侵入的第一道屏障钙粘素和连环素复合体是构成细胞间 adherence junction 45 的主要成份上皮细胞间存在多种连接结构其中粘合连接 adherence junction是其中重 要一种。钙粘素cadherin是一类重要的介导细胞粘附作 用的钙依赖性糖蛋白连环素 catenin是一组胞内糖蛋白通过与钙粘素形成复合体发 挥作用该复合体是构成细胞间 粘合连接的主要成份。 牙龈卟啉单胞菌 Porphyromonas gingivalis P.gingivalis是主要的牙周致病菌之一为 50 龈下菌斑红色复合体中的一员其众多毒力因子可造成对宿主细胞的破坏2。研究表明 P.gingivalis 可粘附和侵入上皮细胞3破坏上皮细胞屏障而进入上皮下组织造成进一步的 组织破坏和免疫应答。 近年来根据 P.gingivalis 菌毛的组成亚单位菌毛素编码的基因 fimA 核苷酸序列的差异 将 P.gingivalis 分为 6 型I?和 IbfimA 型。流行病学调查及动物实验结果显示P. gingivalis 55 菌毛 fimA 基因的差异与其致病性的差异密切相??8。然而其致病力差异的机理不甚清楚。 本文旨在研究不同 fimA 型牙龈卟啉单胞菌破坏上皮细胞间连接能力进一步揭示不同 fimA 型 P.gingivalis 的致病机理。 1 材料和方法 1.1 细菌培养 60 实验菌株为 P.gingivalis 国际标准株及本课题组前期临床分离得到的各 fimA 型 P.gingivalisATCC33277I 型115?型1.5?型2103?型3501? 型4702Ib 型。将复苏保存的各菌株置于 BHI-S 琼脂培养基上厌氧培养条件下80N2、 10H2、10CO237?培养 72 小时革兰氏染色后显微镜下观察确 实验细胞为口腔上皮定为纯培养后于 BHI 液体培养基中增菌。 65 1.2 细胞培养 细胞系 KB 细胞ATCCCCL117DMEM 高糖培养基补充 15 胎牛血清和 1青霉素/链霉素5 CO2 37?培养至细胞单层融合。 1.3 细菌与细胞相互作用 BHI 液体培养基中生长 P.gingivalis 各型菌株革兰氏染色显微镜观察确认纯培养。离 70 心收集PBS 漂洗两次重悬于无血清及抗生素的 DMEM 高糖培养基。KB 细胞 PBS 漂洗 ?条件下以 MOImultipolicity of infection200 加入 P.gingivalis 各型菌株5 CO2 37分别 孵育 30 分钟1 小时3 小时后PBS 漂洗三次刮取细胞备用。 1.4 提取细胞蛋白 采用南京凯基全蛋白提取试剂盒BCA 检测试剂盒Pierce测定蛋白浓度。 75 1.5 Western-blot 检测 等量蛋白含量样本置 10聚丙烯酰胺凝胶上样电泳蛋白转移于 PVDF 膜Millipore 含 5脱脂牛奶的 TBST 缓冲液封闭一小时含兔抗 β-cateninSanta Cruz稀释度 1200 封闭液 4?过夜含兔抗 N-Cadehrin Cell signaling Technology稀释度 11000封闭液 4 ?过夜TBST 漂洗辣根过氧化物酶偶联羊抗兔抗体Santa Cruz孵育一小时TBST 漂 80 洗显色液显色Thermo ScientificBioRad 凝胶成像及图像分析系统检测Quantity One 软件分析。甘油醛-3-磷酸脱氢酶glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH作 为内参蛋白。 2 结果 各 fimA 型 P.gingivalis 与 KB 细胞作用后 N-cadherin 变化情况如图一所示各 fimA 型 85 P.gingivalis 刺激细胞后 3 小时内均可观察到 N-cadherin 逐渐产生降解其中?型 P.gingivalis 作用后降解现象明显从作用 30 分钟后即可观察到。 图 1 不同 fimA 型 P.gingivalis 作用 KB 细胞细胞后 30 分钟、1 小时、3 小时后N-cadherin 变化情况 Fig.1 Proteolysis of N-cadherin of KB cells after treated by different fim A genotypes of P.gingivalis with 30 90 minutes 1 hour and 3 hours. 各 fimA 型 P.gingivalis 与 KB 细胞作用后 β-catenin 变化情况如图二所示β-catenin 变化 与 N-cadherin 相似?型 P.gingivalis 作用 30 分钟后即可明显观察到降解。 95 图 2 不同 fimA 型 P.gingivalis 作用 KB 细胞细胞后 30 分钟、1 小时、3 小时后β-catenin 变化情况 Fig.2 Proteolysis of β-catenin of KB cells after treated by different fimA genotypes of P.gingivalis with 30 minutes 1 hour and 3 hours. 100 105 110 115 3 讨论 牙龈上皮细胞相互之间紧密结合、有序地附着于细胞外基质上形成紧密的粘膜屏障从 而阻止病原微生物的入侵。牙周致病菌如要要侵入深部结缔组织必须首先要 破坏宿主牙龈 上皮屏障。 研究发现 P.gingivalis 与牙龈上皮有着复杂的相互作用上皮细胞功能被 P.gingivalis 扰 乱能够迅速侵入上皮细胞34并在其内繁殖9进而造成上皮细胞形态功能的改变不仅 如此P.gingivalis 还可通过破坏上皮细胞间连接而破坏上皮屏障的完整性1011 为 P.gingivalis 侵入牙周深层组织躲避宿主防御体系提供便利。 钙粘素cadherins是一类重要的介导细胞粘附作用的钙依赖性糖蛋白。钙粘素超家族 分为六大类其中?型 cadherin 包括 E- N- P- R- H- EP-cadherin 等广泛存在于各类上皮 细胞中12主要介导同型细胞间的粘附反应并起细胞骨架的作用维持组织结构的完整 性和上皮极性。Chen 等研究13KB 细胞主要表达 N-cadherinP.gingivalis w83 的胞外蛋白 提取物可降解 KB 细胞表面 N-cadherin。连环素Catenin通过与钙粘素形成复合体发挥作 用。连环素是一组胞内糖蛋白包括 α-Catenin β-Cateninγ-Catenin 和 P120ctn α-Cat 通 过与 β-Ca 的 N-段结合与 E-Cad 连接。β-Cat 结合到 E-Cad 的胞浆尾段处于复合体的核心 位置可能是调节钙粘素功能的位点。γ-Cat 与 β-Cat 高度同源有时可在复合体中代替 β-Cat。 E-Cad 的胞浆尾段近膜区直接结合。 Katz 等10研究表明 P.gingivalis P120ctn 与 刺激上皮细胞后可观察到 E-cadherin 的降解。Hintermann 等11研究表明P.gingivalis 作用上皮细胞后可降解上皮细胞间连接成分如焦点粘附激酶 focal adhesion kinase、catenins 及粘附信号分子从而破坏上皮细胞间的完整性并且 120 125 130 135 140 不同菌株的破坏能力不同但并未解释造成不同菌株破坏能力不同的原因。 近年的研究发现 48 : P.gingivalis 菌毛 fimA 基因的遗传异质性可能影响细菌的致病 力。本课题组的前期研究证实 1415: ?fimA 基因型 P.gingivalis 促进牙龈成纤维细胞表达单 核细胞趋化蛋白- 1、白细胞介素-8 的能力最强。本研究采用不同 fimA 基因型 P.gingivalis 刺激上皮细胞系 KB 细胞通过观察不同 fimA 型 P.gingivalis 对上皮细胞 N-cadherin 和 β-Catenin 的破坏探讨了 fimA 基因型对 P.gingivalis 降解上皮细胞间连接的能力的影响为 研究 fimA 基因型与 P.gingivalis 致病性的关系提供新的实验依据。实验结果显示在经不 同 fimA 型 P.gingivalis 刺激 KB 细胞 3 小时内细胞间连接成分 N-cadherin 和 β-Catenin 均 发生降解而?型 P.gingivalis 作用更加明显。这一结果提示P.gingivalis 在与宿主牙周组 织作用过程中可通过降解上皮细胞间连接结构破坏上皮完整性从而为侵入深部牙周组 织造成深入破坏创造条件而?型 fimA 型 P.gingivalis 具有更强的破坏能力揭示不同 fimA 基因型 P.gingivalis 的致病能力存在差异可能的机制。这一结果也为本课题组的前期研究结 论 “?型 P.gingivalis 与我国慢性牙周炎发生发展显著相关”提供了一定的病因学理论基础。 众多研究显示?型 fimA 型 P.gingivalis 与牙周炎发展密切相关。Nakagawa 等16研究 显示?型 fimA 型 P.gingivalis 能够快速侵入上皮细胞降解细胞焦点粘附成分影响牙周组 织的创伤修复和组织再生。然而P.gingivalis 的毒力因子众多如牙龈素、脂多糖等等? 型 fimA 型 P.gingivalis 即可通过其牙龈素Arg-gingipain降解上皮细胞焦点粘附成分15。 Inaba 等17的研究发现不同的?型 fimA 型 P.gingivalis 菌株之间其毒力也有差异其它 原因如 P.gingivalis 的侵入能力及牙龈素活性等均可能是构成不同 P.gingivalis 菌株之间毒力 差异的基础。P.gingivalis 的 fimA 分型与其致病性的关系其具体机制尚需更深入的研究。 4 结论 牙龈卟啉单胞菌可破坏上皮细胞间连接成分破坏上皮细胞的完整性而?型 fimA 型 牙龈卟啉单胞菌较其它各型水解上皮细胞间连接蛋白的能力强于其它 fimA 型。 145 150 155 160 165 参考文献 References 1 Teng YT Taylor GW Scannapieco F et al. 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