【doc】骺板软骨细胞复合生物凝胶体外培养生成软骨组织的实验研究

【doc】骺板软骨细胞复合生物凝胶体外培养生成软骨组织的实验研究 骺板软骨细胞复合生物凝胶体外培养生成 软骨组织的实验研究 第24卷第5期 2002年5月 第三军医大学 ACTAAC'U)EMIAEMEJ)lCDJAEMIUTARBTERTIAE Vol24.No5 May.2OO2559 文章编号:1000—54O4(20O2)05.055%04 骺板软骨细胞复合生物凝胶体外培养生成软骨组织的实验研究 周强,李起鸿,扬柳,戴刚(第三军医大学附属西南医院骨科,重庆400038) 提要:目的观察将骺板软骨细胞接种于自制的生物凝胶经体外培养生成软骨组织的生物学特点,初步评价这一凝胶基质 作为软骨组织构建的生物学性能将第一代骺板软骨细胞接种于生物凝胶进行体外培养,行大体,倒置显微镜以及组 织学,I型和?型胶原免疫组化光镜观察.结果骺板软骨细胞一生物凝胶复台物,在体外培养过程中不能维持其初始外形,培养 1周直径可收缩为初始的45%,但能保持种子细胞的稳定均相分布.经体外培养2周后由外周向中心逐渐形成软骨组织,面为由 13层梭形细胞组成的膜样结构,内部细胞主要为圆形细胞,有细胞外基质相隔,形成软骨细胞陷窝:基质中富含软骨特异性基质 成分?型胶原和蛋白聚糖,而I型脏碌免疫组化逐渐转为弱阳性,位于表面膜结构.结论这一生物凝胶具有良好的细胞相容性, 适合软骨细胞在其中生成成熟的工程化软骨,但难以维持其初始外形. 关键词:骺板;组织工程;组织再生;软骨;软骨细胞 中圈法分类号:R318嗍;R32271文献标识码:A Cartilageregenerationfromepiphysealchondrocytesculturedinbiologicalgel/nv/fro ZHOU(ng,LI(3-lHY.~NGLiu,DMGang(np'【0廿甲,lj,Soudawe~},Third? rMedicalUniversity0啪4嘲,0岫) Abs眦:od}旧Toobservethebiologicalcharacteristicsofthecregenerated丘l加】 epiphy~alehondroeytesimPl舯倒intoaself- madebiolagicalgelduringmcultivation,ande'~duatethebialogicalpmperiy0fthe蚪趟 thenmwLxmaterialofcaftilaget~ssueengarIeeIlg ^,IeIh.dsThefirstpassagechoralro%vteswPrff]mrvestedandimplantedintothegelforcultureinvitro.TheclIa.lgesofcI10I.dr0c蚪comidexin TT.0rpI】ol. 舒,thes)~lesesofcollagentypeliandI,andaggreealawereim'e~otedgrosslyandmthinvertedudca',~copeandimnnmochemical methodsIqosultsThech(盯 1dr0cygelcomlplcxcontractedto45%0fitsgirlal~lurneandlostitspl4maiy出 apeinthefirstweekofcultivation. butmaintainedtheevenand[itliformdistributionofcellsThecomplexgraduallychangedp}唧tOcenterandfinallybecame血日?m after2weeksofcultivationAtthislime,thecomplexWSScoveredOnsurfacewithamembrane-likeslmctm~oomistiz~of1—3l&ersofflpJlldle oens,andinside.roundcellswereseparatedbyextracellvlarmatrixwiththeformationofehondrocytielnctm~.Thecomplexshwd蝴gpve staingofcollagen坼 1/andaggreealaintheITlfllIJC~8andlishtpositivemngofcollie.typeImadnlyinperipherale.Condusk~ Thebiol~cal耐 p0ssesse5sad"gce~ularcc~npafibilit3/.andisfitforchoralrocytesgrowinginittoregenerateerneeredc,butp咀- ryd1aDenotwell-maintained. Key删出:epiphsealplate;tissueengatreering;tissueregeneration;cartilage;clmndIDe 骺板缺损的修复首先必须阻止血管长人骺板缺损 区,这就要求工程化的骺板组织应具有较成熟的软骨组 织结构.通过种子细胞粘附于三维多孔支架的常用工 程化组织构建方法,得到的工程化组织短期体外培养仍 具有多孔性,不适合修复骺板缺损.我们自制的一种天 然生物凝胶液能与种子细胞均匀混合.在特定的条件下 可固化,经短期体外培养即可生成较成熟的工程化软 骨,能达到骺板组织工程的这一要求.本实验则着重观 察了将骺板软骨细胞接种于这一生物凝胶经体外培养 生成软骨组织的生物学特点,并对这一凝胶基质作为组 织构建材料的生物学性能进行了初步评价. 1材料和方法 1.1原代骺板软骨细胞的分离和培养 无菌条件下解剖分离3周幼兔四肢长骨,剔除软组织.切 基金项目}国家自然科学基盅资助重点项目t39830I?);全军"十五"医药卫 生科研基台资助重点项目(O1~07"2J 作者筒介:周强f1965一l,男,河北省乐亭县人.博士.主治医师.讲师.主要 从事组织工程及骨病方面的研究.电话:(023)68754000-73076 遁恬怍者:李起鸿,电话:(咂3啪544船 收稿日期:2f1024Y2-04i恬回日期:20024)4-19 取骺板.剪成约1—2舢碎块:系列酶消化后.经200目筛网 过滤,离心收集原代骺板软骨细胞,台盼蓝排除法细胞活性计 数:原代细胞以3×lO'/c的密度,30llll[含10%胎牛血清 (Hyclone)+584rL谷氨酰胺+01mmol/L非必需氨基酸 (Gibico)+0.4mmol/L脯氨酸+50:dL维生素C(si岫)]的 DMEM/Hams-F12培养液接种于175?}的培养瓶(ra~CLON公 司,德国),置于37?,5%G培养箱内.接种24h后首次换 液,以后隔天换液当细胞生长至约90%融合时,0.25%胰蛋 白酶/002%EIYI'A-Na~消化,离心收集第1代软骨细胞. 1.2骺板软骨细胞接种于生物凝胶及培养 将第1代骺软骨细胞按25×1/ml的密度加人配制好的 自制生物凝胶液(一种提取纯化的蛋白凝胶溶液),吹打混均. 固化塑形为直径12nm,厚3mill的细胞凝胶块.每孔一块置于 6孔培养板中(BD公司,美国),加人5Illl培养液(与细胞培养液 相同),置于37?,5%0孵箱内培养,5h后全量换液,以后隔 天换液4lll1.分别于培养1,2,3,4周各采集3个标本,测量大 小,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋= 1.3观测指标 1.3.1大体及倒置显微镜观察 1.32组织学光镜观察常规石蜡切片,部分切片行常规 HE染色,逐级酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,另一部分 切片行甲苯胺蓝液染色,滤纸吸水待干,二甲苯透明,中性树胶 第三军医大学第24卷 封片,光镜观察: 1.3.3I型和?型胶原免疫组化常规石蜡切片,一抗分 别选用鼠抗兔I型和不型胶原单克隆抗体(Onc'ogene),按免疫 组化试剂盒(中山公司)说明进行操作.DAB显色液(博士德公 司)显色,光镜观察,阳性为棕黄色. 2结果 2.1大体及倒置显微镜观察 固化的细胞一生物凝胶块,在加入培养液时会与培养板底 部脱离,常有少许菲薄的细胞一凝胶残留于板底,其中的细胞在 1—2h即可完成铺伸,迅速生长增殖细胞一凝胶块内,细胞 呈规则的圆形且透亮,分布均匀,见图1.24h后细胞一凝胶块 开始收缩.表面细胞变为梭形,中心部透光性明显降低,尚可见 细胞轮廓.72h细胞一凝胶块严重收缩,直径由原来的12rm收 缩为6,7mm,高由3rm变为约2皿:随后,收缩明显减缓,1 周时直径为5.4—6rr---.,为初始直径的45%,50%,见图2,高 度变化不明显,以后大小无明显变化,透光性更差,已难以辨认 细胞随着培养时间的延长细胞凝胶块的硬度明显增加.但仍 比天然软骨差得多,具有弹性,表面非常润滑. 2.2组织学观察 培养1周,细胞一生物凝胶块已具有了初步的组织结构 表面为1,3层的梭形细胞,类似一层膜组织.内部细胞主要 为圆形细胞,有细胞外基质相隔,部分已初步形成了的软骨细 胞陷窝,见图3.甲苯胺蓝染色呈明显的红色异染反应,中心的 细胞生长较差,细胞外基质松散,异染反应弱或无.培养2周, 工程化组织的外周部已形成了软骨组织结构,异染反应强,中 心部软骨组织结构发育不佳,但异染反应已很明显.培养3,4 周,整个工程化组织逐渐发育成初步的软骨组织结构,对甲苯 胺蓝染色呈较明显的软骨异染反应,见图4. 2.3I型和?型胶原的免疫组化 ?型胶原的免疫组化显示,各时相点工程化组织均为明显 阳性.1周时稍弱,24周阳性均较强,见图5.I型胶原的免 疫组化显示,1周有较为明显的免疫阳性着色,外周较强,2周 时明显减弱,3周后主要位于表面的膜样细胞层.见图6. 围1凝胶中细胞分布均匀(x100) rig1H0In雌*D瞄嗷^buofI删dmDdl?in恤(×100) 围2右为1周的细胞.凝胶块,左为无细胞凝胶块图奈曲I咖 Fig20帅由,口}Ic~llplexculturedfor1眺(R蛐t)mid窖d唧rwith椰Ice.II(【)(baritldicar~1锄) 围3细胞凝胶块培养1周表面为1—3层的梭形细胞(),形成的软骨陷寓(一)(HE×200) rig3Conlpl~culturedfor1w咄vdlla1—3hrs0fdkcells衄卯血?and向lT懂Iof曲小—IDh哪_(HE×200) 图44周工程化组织形成软骨组织结构,甲苯胺蓝异染反应强(×lOO) ?4aegenet-~carriagelissueby恤mTsho~ngla0_岫?c1ot~luklinebllleatthe蛐(×100) 第5期周强,等骺板软骨细胞复合生物凝胶体外培养生成软骨组织的实验研究561 3讨论 图5细胞凝胶块培养2周时I型肢原的免疫组化染色呈强阳性(S-P~4帅) Fig5nilli嗥0f?IIintheperilflaeralmelnbr~-ie0f唧忡atthe2111week(s-p×4oo) 图6细胞凝胶块培养3周时表面膜结构I型胶原的免疫组化染色呈阳性(S-P× 200) Fig6~fivem吨0fIagmtypeIintheperipheralm1hof.0mplatthe3『d(s-P×200) 一 些凝胶类材料具有以液态方式存在且在特定条 件下固化的特点,能维持细胞在其中呈稳定的三维均 相分布,并允许种子细胞在其中增殖分化,形成相应的 组织结构.这些特点为组织工程的研究和应用带来的 便利是三维高孔隙生物材料难以取代的.天然的凝胶 材料种类很多,常用于组织工程研究的主要有琼脂糖, 海藻酸盐,纤维蛋白,胶原等,人工合成的有聚氧乙烯/ 聚氧丙烯共聚物,聚氧乙烯水凝胶,聚(N一异丙烯酰 胺)凝胶,高分子透明质酸聚丙烯延胡羧酸盐等. Benya等"首先将软骨细胞置于琼脂糖凝胶中培 养发现软骨细胞的高分化表型不仅能够得以维持,并 可使已去分化的软骨细胞再分化为特异的软骨表型. Yasui等应用胶原凝胶作为三维培养系统进行软骨 细胞的培养,发现细胞在其中增殖分化,合成软骨特异 性基质大分子Bosaventure等将去分化的人关节软 骨细胞包埋于海藻酸盐凝胶珠中进行培养.可以再表 达软骨特异性的?型胶原和蛋白多糖,细胞周围形成 含有胶原的细胞外基质,但与琼脂糖凝胶相比,形成细 胞克隆的能力较弱Perka等将软骨细胞包埋于纤 维蛋白与海藻酸盐混合珠中,当形成稳定的细胞外基 质结构后再祛除海藻酸盐,制成稳定的移植物.另外, 种子细胞可与凝胶类材料混台直接注射于机体局部修 复缺损的组织. 本实验的结果表明,骺板软骨细胞与自制生物凝 胶能够充分均匀馄合,并固化成一定的外形,能维持细 胞在凝胶中形成稳定的三维均相分布.在这一细胞一 凝胶复合体的制备过程,能够很好地保持细胞的生物 活性,对细胞无损伤,凝胶块浸泡于培养液中不发生熔 融或崩解.培养1周,即可形成初步的组织结构,最外 层是由1—3层细胞构成的膜样结构.邻近膜结构的细 胞开始形成软骨细胞陷窝.免疫组化和甲苯胺蓝染色 显示细胞已经开始合成和分泌软骨特异性的大分子即 ?型胶原和蛋白聚糖.随着培养时间的延长,软骨组 织的形成由外周到中心逐渐成熟,细胞外基质中?型 胶原和蛋白聚糖的阳性反应逐渐增强.相反,I型胶 原在培养1周时呈明显的阳性,随培养时间延长反应 很快减弱,最后仅在表面膜样细胞层尚有弱的阳性反 应这些结果说明以细胞和生物凝胶构建的工程化软 骨组织在体外培养过程中,经历了一个细胞外基质合 成,分泌和改建逐渐形成成熟软骨组织的过程. 采用缓慢搅拌或(和)旋转式微重力培养系统,将 种子细胞接种于三维支架高孔隙材料,需培养12周组 织生长才能基本充填支架的孔隙,生成较成熟的软骨 组织,组织学结果与本实验2,4周的相似.通过 离心管内细胞聚集培养,虽然可以在2,4周获得较成 熟的骺板软骨,但其外形固定为圆盘状,生成组织的大 小极有限,一般直径不超过4,5llflnl'.".而本实验 构建的工程化软骨在形状和大小上具有一定的可控 性. 在实验中,我们还观察到细胞凝胶块在培养的前 3日,因其中活细胞的作用会产生明显的收缩,部分地 丧失了其初始外形.同时大大增加了工程化组织的密 度,降低了其物质交换的能力,这可能是中心部细胞的 组织形成能力低的原因之一正是由于这一缺陷,用 这一方法构建的工程化软骨难以获得完全符合临床特 异性外形要求的组织工程软骨.因此,虽然这一凝胶 材料具有良好的细胞相容性并适合软骨细胞在其中生 成软骨组织,但是这一组织构建技术在维持工程化软 骨组织的外形和大小等方面还有待于进一步改进. 参考文献 llBen~aPD,aTDDediffemnfiatedd恤reexp~lhediff~一 ~lfiatednn~tutedinagaroseJJ_Ceil,1982t30 (1):215—224. 2JYasuiN,O柚嘲S,Ohchit,Prinmr~eulof器~lhed— dedinco])ageng,J]ExpCellBid,1982,50{2):92—100 .3JB~*entureJ,Kad}10mN,Cohen-So1.a]L,ela/R砖sBi帆0fc耐— l-specificbydedJfferentiatedhtm~narticularehondroc~eadmred inslgi,mt~beads[JJ.ExpCellR,1994,212(1):97—104 l4JPerkaC,ArnoldU,spitzerRS,eluse.ffd~inb曲dBfor5sue 第24卷第5期 56220年5月 第三军医大学AcrAACADE加【AEMEDICAEMILITARISIErm.24.?.5 Mav.20吆 ??rIgandsubsequentlalt~splantalia[J].TissueEng.2001.7(3): 359—361 5]M~kalevmkiS,HycA.c珊laT.a/Differenceincarfii~fora~edin? tramuscularly0fJi帆IstL,facedefectsbym?ratch0rI牌isolat? ed.fromtheIc山aepiphyseale.ar61~.m.lJJCell"fransp]am. 1993,2(6)467—473 【6jM?PX,LangerR?1一如盯andmec~aiealfune6~ofic~g-tenn "?necattily[J]JBiomedMaterRe.1999,44(2):217—221 [7]I~hainI,V日k-Novakc~4eG,Y肌BJ,da/M衄哪Ji丑n-d-? p~ldedinlhepresenceoffibrobhastrwthfactor2mtunlalntheabilityto diffea~cttialeandthree<liraemlonalc~ilaglnoustissueExp Cell,1999.253(2):681—688 [8:FreedLE.HoUande~AP.M~iJn1.da/a柏n山哩?8inaedl-ply- met-bi0删0r州_J1ceu陆,1998,240(1):58—65. 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[10;周强.李起鸿,戴刚,等经离心管培养骺软骨异体鐾复兔骺板部 分损伤的初步观察[明.第三军医大学.?01,23(10):1139—1142 [11]周强,李起鸿,戴刚,等.高数量骺板软骨细胞聚集培养生成 软骨组织的观察[.第三军医大学,2OO2,(5):556—558 (编辑王红) 大量不保留灌肠术肛管插入深度的探讨 文章编号:100oI5404'2002)05掰6如l Studyofinsertdepthofenematubein~gh-capadtynonretentionenema 屈轶,乔瑞霞(第三军医大学:附属西南医院骨科;系护理学教研室,重庆40oo38) 肛管插人结肠的深度,灌肠液量及灌肠液保留时间对灌肠 效果有直接影响.按文献[1]的要求,大量不保留灌肠时,肛管 插人的深度为7—10一,灌肠液量为5O0—1000ml.但在临床实 际操作时,按此.常难以达到清洁肠道的目的.为了更好地 实现清洁肠道,强化灌肠术的科学性,本研究结合骨科常见病 人,如脊椎骨折,截瘫,骨病术后及术前的肠道准备,对大量不保 留灌肠术肛管插人的深度,灌肠液量和保留时间进行了探讨. 1对象与方法 对象:选择骨科常见病患者印侧,随机分为2组.实验组 3o例,男19例,女ll例,平均年龄39岁.对照组30例,男l6 例,女14例,平均年龄43. 器具:灌肠器具一套,肛管为上海精化医用橡胶厂生产的 橡胶肛管(长30era). 方法:按文献[1]大量不保留灌肠法要求进行操作,灌肠液 为生理盐水1000,温度40?,筒内液面高于肛门卯啪. 2结果 本试验观察结果见表1对照组患者肛管插人深度较实验 组浅,所以,肠道灌人液体量少,灌人液体在肠道中保留时间亦 短,显然,灌肠效果差: 裹1两组患者肛管插入霖度,灌入液量,保留时间 3讨论 印例灌肠病例中,实验组与对照组患者均按文献[1]灌肠术 操作要求进行.从表1中可以看出,两组患者肛管插人深度 人液量,灌人液体保留时间明显不同,见表1.用SPSS100软件 包进行数据处理.结果:肛管插人深度两组,:36.475.P: 作者筒介:屈轶(I蛐【一】湖北省襄樊市^.护士.电话(位3】6弱I55 收藕日期:2呻I.12-10;修回日期:2002434~4 0.000;灌人液量两组'=27.834,P=0.?,保留时间两组 =158920,P=0.000. 对照组肛管插人浅,由于灌肠液对肛管和直肠的刺激,使 肠蠕动活跃,其结果,一是使灌人液体量少(只有80—100m1), 二是灌肠液在肠道中保留时间短(2—3nfin内灌肠液即沿肛门 溢出).根据太肠的解剖.肛管长约4cnl,直肠全长lO一14cm; 所以,肛管插人7,12锄根本无法达到清洁肠道和解除便秘的 作用,即使是反复多次的灌肠也不能达到目的. 试验组肛管插人深(18—22cm),灌人液量多(500—1000 ),灌人液保留时间长(5—10roin),灌肠效果好.这是因为正 常人的直肠腔内通常并无粪便,只是当肠蠕动将粪便推人直肠 时,刺激直肠感受器发出冲动,经盆腔神经和腹下神经传至脊 髓腰骶段的初级排便中枢,井上传到大脑皮层,才引起便意和 排便反射.对于骨科患者,由于长期卧床,肠蠕动减慢.加之患 者有意识地制止排便,使直肠渐渐失去对粪便压力刺激敏感 性,粪便在大肠内停留过久,水分吸收过多而干燥,此时灌肠 时,肛管插人深度必须长于直肠的最长长度,才能使灌人的大 量液体从上向下"冲击",将粪便排出体外,如果插人7,l0啪, 肛管头端正好处于干结的粪便处,不但灌人的液体少,而且保 留的时间也短;当进行肠道手术或检查时,插人7一lO砌,肛管 头端正好处于无粪便的直肠中,通过空虚的直肠向存有粪便的 结肠中灌人液体,既灌人的液量少.保留的时间又短,所以,则 难达到清洁肠道和排除便秘的目的. 本研究结合临床上骨科常见病患者实施大量不保留灌肠术 实践,对灌肠术肛管插人深度进行了研究,根据肛管,直肠解剖 特点,结合骨科病人太量不保留灌肠术的目的,认为肛管插人深 度以l8,22cm为宜,此深度一方面可使灌肠液保留时间适当延 长,可促使干结粪便软化,另一方面可使大量灌肠液产生"冲击 压力",使粪便排出,从而较好的达到太量不保留灌肠的目的. 关键词:灌肠液保留时间;插人肛管深度;灌肠液量;不保 留灌肠 中图法分类号:R452文献标识码:B 参考文献: 1]陈维英,主编基础护理学[M 社.I9983 第3版.南京:江苏科学技术出版 (缟辑冷怀明)