干细胞移植治疗心脏病的发展方向

18 ●院士论坛 ● 《中国医学前沿杂志（电子版）》2012年第4卷第12期 基金项目：国家自然科学基金项目（81000003，81100075）；高等学校博士学科点专项科研基金（20100071120072） 通讯作者：葛均波　Email：ge.junbo2@zs-hospital.sh.cn 干细胞移植治疗心脏病的发展方向 葛均波，黄浙勇（复旦大学附属中山医院　心内科　上海市心血管病研究所，上海　200032） 损伤心肌的细胞修复是心脏病学领域的一个 圣杯，细胞疗法理论上极有前途。早期动物实验 和临床前研究结果具有革命性、突破性，但临床 试验并未复制动物实验的辉煌战果；虽然每年干 细胞研究成果汗牛充栋，但研究伊始的基本问题 迄今仍未明了。困惑、置疑是新兴事物发生发展 的天生伴侣，也是干细胞研究进展的最好清醒剂 和兴奋剂。面对喜忧参半的现状，在此我们略论 一些突破性进展。今日之蓓蕾，孕育着明日之硕 果。 1　骨髓细胞临床试验新进展 骨髓细胞移植是目前干细胞治疗心脏病临床 试验的主流。2012年国际循证医学协作组完成迄 今为止最大规模的关于骨髓细胞治疗急性心肌梗 死（acute myocardial infarction，AMI）的荟萃分 析[1]，共纳入2004～2011年间17个国家33项随机临 床试验（1765例患者）。所有研究受试者接受经 皮冠状动脉介入治疗（PCI）和（或）溶栓治疗作 为心肌梗死的初步治疗。结果发现：①干细胞治 疗相关的不良事件无增加；②干细胞能改善左室 射血分数（LVEF 3～12个月，WMD 2.87%），减 少梗死面积并改善左室重构；③获益可长期持续 （LVEF 12～61个月，WMD 3.75%)；④心功能改 善与输注的细胞数量相关；⑤细胞治疗并不能改 善AMI后死亡率以及致残率（再次心肌梗死、再 次住院、支架再狭窄和靶血管血运重建）。 由此可见，虽然骨髓细胞治疗可带来心功 能益处，但心功能获益并未转变为临床硬终点事 件的获益，而且不同试验结果存在较大变异。因 此，需要对细胞产品、细胞剂量、移植方法、移 植时机和患者选择等各个移植链条环节进行标准 化和优化，这不仅有利于提升骨髓细胞治疗的疗 效，对其他各种新兴细胞类型的移植策略优化亦 具有普遍指导价值。目前尚有30多个成体干细胞 治疗心脏病的注册研究正在进行中，我们期待出 现更加科学客观的循证依据。 2　心脏自身干细胞成为研究新宠 相比其他组织来源的成体干细胞，心脏自 身干细胞（cardiac stem cell，CSC）的心脏组织 分化能力无疑更加令人信服。基于使用促红细胞 生成素可以促进骨髓前体细胞向红细胞分化的事 实，促进心脏前体细胞的分化、进而促进心脏自 我修复潜力是未来研究的一个重要方向。2011年 Porrello等[2]将刚1周龄小鼠15%的心脏切除，发现 3周内受损心脏重新完好地修复。表明在出生后的 一段窗口期内，哺乳动物心肌再生是有可能的。 “新生哺乳动物的心脏能够自我修复”的概念为 治疗人类心脏病提供了新的思路，研究者有可能 通过药物、基因或者其他方法以唤醒成年老鼠乃 至成人的心肌再生能力。我们的研究 [3]发现使用 Urantide阻断Urotensin Ⅱ受体能够通过增加心脏侧 群细胞（SP），提高心脏修复能力，改善损伤后 小鼠心脏功能。 利用CSC的另外一种方法是移植到受损心 19 ●院士论坛 ●《中国医学前沿杂志（电子版）》2012年第4卷第12期 肌。CSC可从活检心肌组织中分离扩增，具有较 大自身移植潜力。在胚胎干细胞临床试验意外终 止（2011年11月美国杰龙生物医药公司意外终止 胚胎干细胞治疗急性脊髓损伤临床试验）、诱导 多能干细胞（induced pluripotent stem，iPS）分化 效能有待提升、骨髓细胞临床试验结果差强人意 的背景下，业内人士对CSC寄予厚望。在大量动 物实验基础上，CSC移植目前已快速推进到Ⅰ期 临床试验阶段：TICAP研究（NCT01273857）和 ALCADIA研究（NCT00981006）正在进行中， SCIPIO研究[4]和CADUCEUS研究[5]结果均发表在 新近Lancet杂志。SCIPIO和CADUCEUS研究的结 果证明CSC移植治疗心肌梗死是安全的，为下一 步开展更大规模的Ⅱ期研究提供了基础。SCIPIO 试验发现LVEF明显改善，梗死面积显著降低；而 CADUCEUS试验发现细胞组整体心脏功能无明显 改善；但活力心脏面积增加，局部心肌收缩功能 改善。尽管两个试验结果不尽相同，但毕竟为近 期低迷的干细胞心肌修复领域注入一注强心剂。 但我们不曾忘却，数年前骨髓细胞临床试验刚登 场时万民齐庆的场景，然而数年间忽然降温。曾 有前车之鉴，足为后事之师，我们需要更多的 样本量和更长时间的随访，以验证CSC的真正疗 效。 3　细胞重编程技术编织未来蓝图 谱系重编程技术指成熟体细胞可以通过外源 转录因子的导入，直接重编程为其他类型的体细 胞或祖细胞。在干细胞领域以iPS技术为代表。 2007年11月美国和日本科学家分别独立宣布，将 成体组织皮肤成纤维细胞经过病毒载体直接转 导4个干细胞相关基因（如Oct3/4、Sox2、Klf4、 c-Myc）后可以转化成为具有胚胎干细胞（ESC） 特性的诱导式多能性干细胞。iPS的诱导成功是 干细胞研究领域里程碑式的进展，被《自然》和 《科学》杂志分别评为2007年第一和第二大科学 进展。目前，iPS俨然成为干细胞领域的研究最热 点之一。 成纤维细胞是健康心脏组织的支持性细胞。 心肌梗死后成纤维细胞转移至损伤部位并大量增 殖，形成瘢痕参与心肌重构，避免心脏破裂。常 规细胞治疗是将干细胞或祖细胞移植入损伤部 位，或促进局部前体细胞分化。能否利用心脏内 业已存在并与邻近细胞紧密结合的大量成纤维细 胞库呢？基于谱系重编程的理念和iPS的研发经 验，我们曾提出新的假设：能否将若干关键基 因转导入成纤维细胞，跳过iPS阶段，使其直接 “转分化”为心肌细胞？换言之，能否将心肌瘢 痕组织直接转换为心肌工作细胞？基于国内实 验室条件限制，我们将该假设发表于2010年Med Hypotheses [6]杂志。出人意料的是，国外研究很 快初步验证了我们的设想。美国圣地亚哥心血管 疾病格拉斯顿研究所主任Srivastava等[7]将Gata3、 MefZc和Tbx5三种基因转移进成纤维细胞，直接成 功地培育出具有收缩功能的心肌样细胞；随后他 们将这3种基因编码的病毒载体直接注入新近心肌 梗死小鼠的瘢痕组织，证实成纤维细胞可分化为 心肌样细胞。 另一项具有异曲同工之妙的原始概念验证 研究来自microRNAs。microRNAs是一种小的寡 聚核苷酸链，能够调节细胞内数百种基因的表 达。杜克大学的Mirotsou等[8]发现4种microRNA 分子（miRNA-1，miRNA-133，miRNA-208和 miRNA-499）能将在盘碟中触发形成瘢痕组织的 心脏成纤维细胞转化为心肌样细胞，进而发现 microRNAs注入到小鼠体内也能实现这种转化。相 比于在体内很难掌控的基因方法或干细胞移植， 利用microRNA实现组织再生有潜在的优势，如 mciroRNA方法不会产生基因突变，也可避免干细 胞的伦理争议。 细胞重编程技术是一项巨大的突破，其应用 前景极富梦幻色彩：心肌梗死患者无需接受开胸 手术，只需导入特定基因或microRNAs，成纤维细 胞将直接转化生成健康的心肌细胞。事实上，各 系统的终末期疾病几乎均与纤维化相关联，如肝 硬化、肾小球硬化等，如能在原位将成纤维细胞 转为各脏器相应的实质性细胞，无疑将改变整个 医学实践策略。当然，能否真正实现这种梦幻般 的跨越尚待验证。 20 ●院士论坛 ● 《中国医学前沿杂志（电子版）》2012年第4卷第12期 4　移植策略稳步推进 4.1　移植途径的探索　干细胞移植途径包括经静 脉、经冠状静脉、经心外膜、经心内膜和经冠状 窦注射等[9,10]。静脉移植创伤最小，但大量细胞潴 留于肺组织。经心外膜或心内膜心肌内注射创伤 较大，但可确保损伤局部有足够的细胞量。心肌 梗死后，经导管冠脉内注射是首选方法，也是临 床试验中最常用的方法，可使细胞尽量弥散分布 于损伤心肌，但细胞在心脏的停留率较低。经冠 状窦途径注射时细胞可弥散分布于损伤心肌，最 近已被应用于临床试验[11]。最近进展较快的是以 生物可降解为基础的组织工程贴片法[12,13]， 但贴片厚度和降解物质毒性等问题有待进一步研 究。 4.2　促进归巢研究　无论何种移植途径，最终都 需将干细胞最大限度地整合至损伤心肌，即移植 细胞靶向归巢是再生医学发挥疗效的前提。不管 采用何种移植途径，真正分布到心脏的移植细胞 数量都极其有限，仅占0%～6%。AMI后，心肌组 织局部细胞因子增加，包括干细胞趋化相关因子 如SDF-1、MCP-3、GDF-15、bFGF、GRO-1等[14]，诱 导干细胞优先向心脏归巢。但许多归巢因子表达 时间窗短暂，如研究最多的归巢因子SDF-1，损 伤心肌表达仅有1周时间[15]；MCP-3不足10天[16]。 在动物实验中，将归巢因子通过转基因手段整合 入移植细胞可增加细胞归巢[17]。譬如，通过细胞 为基础的基因治疗[15]、基因转导或直接使用SDF-1 蛋白[18]均可促进干细胞归巢，进而改善血管新生 和心脏功能。增加干细胞表面SDF-1受体CXCR4 的表达并在心肌梗死后24小时内移植也能达成类 似效果[19,20]。但归巢涉及的“细胞-细胞外基质-细 胞因子”网络极其复杂，其中的调控机制仍不清 楚。尽管近年来以归巢细胞因子为靶点的相关研 究获得了一些进展，但短期内尚无应用于临床试 验的可能性[14]。寻找新的、有效的促进归巢的方 法是当前干细胞移植的难点和热点之一[21,22]。 4.3　促进细胞的存活和植入　移植细胞的存活 和植入是目前干细胞研究的瓶颈之一。蛋白酶、 黏附分子和整合素等信号调控分子能诱导干细胞 向损伤心肌迁移，并调节局部微环境，促进干细 胞植入 [14,23]。SDF-1等因子能诱导基质金属蛋白 酶MMP-2和MMP-9分泌[24,25]。中性粒细胞弹性蛋 白酶、组织蛋白酶G和MMP-2/9等蛋白溶解酶可 通过裂解SDF-1的N-末端或裂解CXCR4而抑制细 胞迁移[25,26]。在干细胞机械运动过程中蛋白溶解 酶呈现时空依赖性改变，介导干细胞的招募和植 入。整合素是干细胞黏附、滚动和渗出内皮组织 的关键因子，造血干细胞（HSCs）可表达包括多 种整合素在内的一些黏附因子。整合素迟现抗原 4（VLA4）和血管细胞黏附分子1（VCAM-1）的 相互作用（VLA4/VCAM-1通路）可能在HSCs植 入过程中发挥关键作用，研究发现，用抗体阻断 VLA-4或VCAM-1后显著减少移植HSCs的植入[27]。 只有表达CD18的内皮祖细胞（EPCs）才能和内 皮细胞表面ICAM-1相互作用，CD18中和抗体能 显著抑制AMI小鼠移植干细胞的植入[28]。上述研 究提示针对相关因子进行干细胞基因修饰可能增 强细胞的招募和植入。其他增加植入和存活的策 略有发现新的介导因子、移植前预分化干细胞、 激活生长因子（FGF-2、IGF-1a）和抗凋亡因子 （p-Akt、SDF-1、BCl-1和PDGF）等[17,29]。在这方 面，我们在硫化氢预处理干细胞[30]、侧支循环微 环境[31]、基质弹性微环境[32]对细胞植入、分化的 作用等方面做了一些研究。 我们相信，损伤心肌的细胞修复是心脏病学 领域的一个圣杯，是未来心脏病学发展的重要方 向，在争议声中干细胞研究将继续蓬勃发展，恰 如过去十多年的历程。 参考文献 [1] Clifford DM, Fisher SA, Brunskill SJ, et al. 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