牛附睾和附睾液分析与牛附睾尾精子在模拟附睾液中存活试验

牛附睾和附睾液分析与牛附睾尾精子在模拟附睾液中存活试验 牛附睾和附睾液分析与牛附睾尾精子在模 拟附睾液中存活试验 新疆农业科学2011,48(5):937—941 XinjiangAgriculturalSciences 牛附睾和附睾液分析与牛附睾尾精子 在模拟附睾液中存活试验 倪建宏,刘长彬,张宾,GrahamWKay2 (1.新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室,新疆石河q-832000;2.林肯大学生命科学系,新西兰基督城) 摘要:【目的】新鲜精液在离开生殖腺后存活时间很短.相关研究表明副睾液为精子的存活提供了特殊的环 境.试验探讨和研究牛附睾精子在体外模拟附睾液中的存活试验的各因素的影响.【方法】试验对公牛附睾 头部和尾部的摩尔渗透压和蛋白质浓度进行了分析,牛附睾尾部精子在不同蛋白浓度的CEP一2溶液中,在 4?条件下孵育120h.每24h做一次精子活力检测.【结果】5d后精子活力仍然超过6o%.附睾头,尾部的 渗透压分别为(287.0?13.7)mOsm和(310.8?17.0)mOsm.蛋白浓度分别为(37.43?12.55)mr/mL和(50. 58?11.08)mr/mL.【结论】附睾尾精子在蛋白浓度为40mr/mL,渗透 压为345mOsm时,精子存活率最高. 关键词:牛;附睾尾部精子;CEP一2稀释液 中图分类号:$823.34文献标识码:A文章编 号:1001—4330(2011)05—0937—05 Medium—-termSurvivalofBovineCaudalEpididymalSpermunderConditions BasedonEpididymalFluidCharacteristics NIJian—hong,LIUChang—bin,ZHANG—bin,GrahamW.Kay2 (1.TheKeySheepBreedingBiologicalTechnologyLaboratoryofXinjiangConstructionCorps,Shihhotze Xinjiang832000,China;2.AgriculturalandLifeSciencesDiv~ion,LincolnUniversity,Christchurch,New Zealand) Abstract:【Objective】 Freshsemenhasaverylimitedlifespanafteritleavesthegonad.Therelativeresearch showedthattheepididymalplasmaprovidesaspecialenvironmenttospermatozoaforsurviva1.Inthisstudy,the osmolarityandproteinconcentrationofcaputandcaudalbullepididymiswereanalyzed.【Method】Bovinecaudal epididymalspermwasincubatedindifferentproteinandsorbitolcombinationsofCEP一2diluentsat4oCfor120h andspermviabilitywasassessed.【Result】 Undertheseconditions,spermviabilitywasstillmorethan60%after5 days.Theosmolarityofcaputandcaudalepididymiswere(287.0土 13.7)mOsmand(310.8?17.0)mOsm respectively.Theproteinconcentrationofcaputandcaudalepididymiswere(37.43?12.55)mg/mland(50.58土 11.08)mg/mLrespectively.Thismayhaveanapplicationintheanimalproductionindustry.【Conclusion】e highestviabilityoffreshextractedcaudalepididymalspermwasinthemodifiedCEP——2diluentwith40mg/ml proteinconcentrationand345mOsm. Keywords:bovine;epididymalsperm;CEP一2diluents 0引言 【研究意义】在家畜生产过程中人工授精技术是非常重要的环节. 多数情况下使用的是冷冻精液, 需要特殊的装置和设备储存和运输.在冷冻状态下,精子可以存活很 长时问;而非冷冻的精子存活时问 较短,在实际工作中应用有一定的局限.运用简单的方法处理精子,延 长非冷冻精子的寿命应该具有经 济优势.【前人研究进展】哺乳动物的精子在睾丸内产生后,储存于 副睾尾部,精子在此转移过程中获得 活力和受精能力[1l.为了保存用于授精的能量,精子在副睾尾部停留, 保持静止状态[.一旦射精后, 收稿13期:201l—o4—06 基金项目:国家科学技术部”863”计划引导子课题”羊分子细胞工程育种技术创新与优势性状新品系培育”(2008AA101011) 作者简介:倪建宏(1969一),男,上海人,副研究员,硕士,研究方向为家畜繁殖,(E—mail)xjshznjh@163.COB ? 938?新疆农业科学48卷 精子离开生殖腺,无论在体内还是体外其寿命都很短.对于人工授精而言,精液必须在数小时内必须用 完或进行低温保存,冷冻后的精子可以存活很长时间.在自然状态下,精子很少能存活很长时间.一个 例证是蝙蝠的精子可以在母蝙蝠的生殖道内存活几个月.另一个例子是动物死亡后,其副睾尾部所储 存的精子可以存活几周时间L3.4J.以公牛为例,在正常的精子发生过程中,精子在副睾液中浸泡10d左 右,牛副睾尾部可以储存精子达数周而不减少其授精能力l-2.5J.许多研究表明:独特的副睾液为精子的 成熟和储存提供了较低的pH值和含氧量_6;较高的摩尔渗透压和蛋白浓度环境E7].普通体液和细胞 质的摩尔渗透压为300mOsmoles左右,而在某些物种中副睾液的摩尔渗透压是血液中的3—5倍J.这 些条件或许对延长附睾精子的寿命有作用.同时也为精子在高摩尔渗透压和低pH值条件下的液态非 冷冻保存提供了可能.【本研究切入点】尽管到目前为止体外模拟附睾条件的研究做得很少,但是有研 究表明不同物种的精子在冷却的附睾中保存数天后仍具有一定的受精能力.然而用冷却附睾方法保存 精子并不切实可行.【拟解决的关键问题】对附睾头和附睾尾的附睾液的特性进行研究并把附睾尾部收 集到的精子放人人工模拟的附睾液中进行保存,观测其体外存活能力. 1材料与方法 1.1睾丸和附睾液的收集 睾丸从新西兰基督城的屠宰场收集后,进行整体称重,将附睾剥离并称重,附睾头部和尾部分开并 称重.附睾头和附睾尾分别用手术刀划破,使得附睾液流出,再用移液器将其收集.为便于检测,将附 睾液用12000r/min离心2min,吸取上清液留作分析.在做附睾尾精子保存试验时,附睾液的收集同 上,用改进过的CEP一2液稀释,10000r/min离心20S,显微镜下检查精子活力. 1.2头部和尾部附睾液的摩尔渗透压和蛋白浓度的测量 使用菲斯克2400型摩尔渗透压计(FiskeAssociates美国产)测量附睾 液摩尔渗透压.标样的摩尔渗 透压分别为50,290和850mOsm.标样和样品量都是20皿.蛋白浓度测量使用Dc蛋白分析仪 (BioRad德国产).将牛血清白蛋白BSA20mg/mL溶解成0—5mg/mL不同浓度的标样.Bio—Rad染液 (目录#500—0006)4倍溶解于水.附睾液样品在分析前100倍溶解于水.每20蛋白溶液加入1000 染液,在595nm下检测标样和样本的OD值. 1.3溶液 商 药品来自 Sigma(StLouis,Missouri,US),LifeTechnologies,GibcoBRL.products(Gait hersburg,MD USA),BDHLaboratorySupplies(Poole,England)和LIVE/DEADSpermViabilityKit.溶液基于不含蛋白 质和山梨醇的CEP一2溶液.表1 表1改良CEP一2溶液的成分 Table1CompositionofmodifiedCEP—-2diluent ComponentConcentration(aM) 在l6×6的实验组基液中添加牛血清白蛋白(BSA;250mg/mL)和山梨醇(670mM)使其蛋白浓度范 围由0mg/mL逐渐升高至70mg/mL,渗透压由270mOsm逐渐升高至 520mOsm.在预实验中,附睾尾精 子在此36个不同蛋白浓度和渗透压的溶液中孵育5d,并做活力检测. 1.4精子生存能力评价 使用死活精子试剂盒(LIVE/DEAD@SpermViabilityKit)对精子生存能力进行评价,此试剂盒包括两 798 ?O舛 巧 砌 一一一一, 5期倪建宏等:牛附睾和附睾液分析与牛附睾尾精子在模拟附睾液中存活试验.939. 种染料SYBR一14和PI(Propidiumiodide)[63.SYBR一14用DMSO稀释l0倍制成A液,染色前将A液用 PBS稀释2.5倍制成B液,同时PI用PBS稀释5倍制成C液.20L精子样本中加入1.5L的B液,在 34~C的水浴中染色10min,再加入C液后34?的水浴中染色5min.将8L染好的样本在50X20nlrfl的 盖玻片上涂片,风干15min后滴一滴甘油压上载玻片.染色后的精子样本在荧光显微镜(LEICADM IRB)下观察计数,红色为死精子,绿色为活精子. 2结果与分析 2.1牛附睾和附睾液分析 牛睾丸整体和分离后的附睾.睾丸和附睾平均重分别为(430.5?87.1)g和(44.4?7.3)g.附睾 头平均重为(21.4?4.O)g,占整个睾丸重的4.9%;附睾尾平均重为(16.3?3.8)g,占整个睾丸重的 3.8%.图1 精索 附睾头 Caputregion 附睾尾 图1牛睾丸整体(左)和分离后的附睾(右) Fig.1Intactbulltestis(1eft)andisolatedepididymis(right) 牛附睾不同部位提取液的渗透压和蛋白浓度.表2 表2牛附睾不同部位提取液的渗透压和蛋白浓度 Table2.Mean(?SEM)osmolarityandproteinconcentrationsoffreshlyextra ctedfluid fromdifferentpartsofthebovineepididymis 2.2附睾尾精子在人工附睾液中的存活试验 在预备试验中,附睾尾精子置于0,70mg/mL的蛋白浓度和0,201mM的山梨醇的改良CEP一2溶 液中.不同量的蛋白质和山梨醇对改良CEP一2溶液渗透压的影响.不添加蛋白和山梨醇时改良CEP 一 2的渗透压为281mOsm;仅添加山梨醇至201mM则渗透压升至463mOsm;而仅添加蛋白浓度至70 mg/mL则渗透压为291mOsm;在70mg/mL蛋白和210mM山梨醇浓度时改良CEP一2的渗透压为509 mOsm.在这些条件下,新鲜提取的附睾尾精子在4~C下培养120h仍有20%的存活.图2 根据前期的试验,在蛋白浓度从0,70mg/mL,山梨醇浓度为67134mM时,改良CEP一2的渗透 压变化范围为312—433mOsm.在此条件下,新鲜提取的附睾尾精子在4~C条件下培养120h,每24h采 样一次,每次样品染色做死活精子测定.图3 蛋白浓度由0增至40mg/mL时,附睾精子经120h保存仍有60%,70%的存活率.继续增加蛋白 浓度则活率下降至40%,50%.山梨醇浓度变化从67134mM对存活率影响不大.有最佳存活率的 改良CEP一2液的蛋白浓度为40mg/mL,山梨醇浓度为67mM,此时的渗透压为345mOsm.图4 ? 940?新疆农业科学48卷 图2添加不同量蛋白质和山梨醇对改良CEP一2渗透压的影响 Fig.2EffectofadditionofproteinandsorbitolontheosmolanityofmodlifiedC EP一2 图3经过SYBR一14和PI染色的活精子(绿色)和精子(红色) Fig.3Live(green)anddead(red)spemstained,vithSYBR一14andpropidiumiodiderespectively 图4附睾尾精子在4~C条件下不同渗透压下的改良CEP一2溶液中孵育5d的活力 Fig?4viabilityofcaudalspemincubatedfor5daysat4~CinmodifiedCEP一2containing variousproteinandsorbitolconcentralionsgivingdifferentfinalosmolarities 3讨论 3.1实验中,在模拟附睾环境的溶液中保存精子5d后仍有60%的精子存活.附睾尾精子从附睾提取 后在蛋白浓度为40mg/mL,在4?条件下保存120h仍有活力,超过一半的精子仍然可以选择性的转运 5期倪建宏等:牛附睾和附睾液分析与牛附睾尾精子在模拟附睾液中存活试验?941? SYB’R一14.然而,即使在较低的蛋白浓度(0rng/mL)或较高的蛋白浓度(70mg/mL)精子的活力仍然高 于40%.40mg/mL的蛋白浓度与测得的附睾头溶液蛋白浓度一致,而略低于附睾尾.试验使用的蛋白 浓度与其他研究者在CEP一2液中所使用的蛋白浓度相对比较高J,而后者则在其中使用了卵黄. 3.2渗透压似乎在延长培养附睾尾精子寿命的过程中并未起到显着作用.试验中的精子相当能耐受 高渗透压.在渗透压为345mOsm,蛋白浓度为40mg/mL时精子存活率最高.这个渗透压值相比在附 睾尾液中测得的310mOsm要高.最佳渗透压值相比标准CEP一2液中的320mOsm要高J.Pommer等 (2002)报道马的精子同样可以耐受极端的渗透压. 3.34~C条件下,在改良的CEP一2液中培养120h,超过一半的附睾尾精子依然存活.实验中使用的是 附睾尾精子,如果射出的精子在同样的条件下能有相似的存活率,那么就有可能开发可以保存射出精子 的保存液,便于精子在低技术条件下保存和运输,而无需使用精子冷冻设备. 3.4实验数据显示,附睾头溶液的渗透压高于附睾尾.在从附睾头至尾的移动过程中,精子所承受的 渗透压增长为23mOsm,与c.H.Yeung[J报道的数据相吻合.有假设认为高渗环境可以延长精子寿 命[引.研究发现,牛的附睾头溶液的蛋白浓度显着高于附睾尾.其他物种(如猪)则恰恰相反l7j.平均 睾丸重为430g与正常性成熟的公牛一致-1?.附睾头占睾丸总重的4.9%,附睾尾占3.8%.在屠宰过 程中由于对牛进行了电击,实验发现屠体附睾内的精子较少.如果在 电击前就取得睾丸则可以获得较 多的精子和附睾液. 4结论 这些前期的研究工作表明:精子可以在类似附睾液的条件下得以保 存活力,通过进一步的研究和对 保存液的改进,可以找到一种简易的技术方法对动物的精子进行保 存. 致谢:VictoriaBarrell博士,新西兰基督城AllianceSockbum屠宰场的 员工,中国留学基金委,新西兰林肯 大学基础部. 参考文献: [1]Cooper,T.G.,Epididymis.In:Neill,J.D.,Knobil,E.(Eds.),EncyclopediaofRepreduction[J].AcademicPress,SanDiego,1998:1—17. 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