桃金娘果实多糖的构造研究（Ⅰ）

桃金娘果实多糖的构造研究（Ⅰ） 桃金娘果实多糖的构造研究(?) ※基础研究髑2005,Vo1.26,No.479 桃金娘果实多糖的构造研究(I) 秦小明?,隋亚君2,宁恩创2 (1.湛江海洋大学食品科技学院,广东湛江524005; 2.广西大学轻工与食品学院,广西南宁530005) 摘要:对新鲜和自然干燥后桃金娘的果实中的水溶性多糖进行了分离和化学构造 初步研究.结果表明桃金娘多 糖是木聚糖,阿拉伯半乳聚糖(AG)或者阿拉伯半乳聚糖糖蛋白(AGP)和果胶等构 成的混合多糖.通过鲜果与干果实 验数据的比较,其水溶性多糖的构成以及各组分含量均有明显变化.水溶性多糖分 离纯化所得到的H3和H4组分 的构成单糖表明,它们可能是含有较多毛发区域(鼠李半乳糖醛酸聚糖为主链) 的果胶多糖. 关键词:桃金娘;多糖;阿拉伯兰乳聚糖糖蛋白;鼠李半乳糖醛酸聚糖 StructureResearchonthePolysaccharidesofRhodomyrtustomentosaFruit(I) QINXiao—ming,SUIYajun,NINGEn—chuang (1.CollegeofFoodScienceandTechnology,ZhanjiangOceanUniversity,Zhanjiang524005,China: 2.LightIndustryandFoodEngineeringInstitute,GuangxiUniversity,Nanning530005,China) Abstract:Isolationandcharacteridcstructureofwater-solublepolysacchaddesinRhodomyrtustomentosawerestudied.The resultssuggestedthatitcontainedtheconstitutentsofseveralpolysaccharidesconsistingofxylan,arabinogalactan(AG)or arabinogalactan— protein(AGP),pectinandotllers.Bycomparingthefreshwithair-driedfruit.theobviousdiffe renceof polysaceharideconstituentandtheircontentcouldbefound.TheresultsofsugaranalysisofH 3andH4indicatedthatthereWaS probablyaspecialpectinpolysaceharidehavingahairlyrcgionwithitsbackbonearhamnogal acturonan. Keywords:Rhodomyrtustomentosa;polysaccharides;arabinogalactan-protein(AGP):rha mnogalacturonan 中图分类号:TS201.2文献标识码:A文章编号:1002.6630(2005)04-0079.04 桃金娘(Rhodomyrtustomentosa),又名稔子,山 稔,当梨子(广东),唐莲(福建),是桃金娘科桃金娘属 常绿多花小灌木.广泛分布于我国福建,台湾,湖南, 广东,海南,广西,贵州,云南等省,印度,日 本,菲律宾等东南亚国家也有分布….桃金娘的果实完 全成熟时极甜,略有涩味,汁液呈诱人的紫红色,富含 多糖,蛋白质,单宁,黄酮类,花青素,氨基酸,有 机酸以及花青素等多种化学成分【2】,我国民间素有将桃 收稿日期:2004.02.25 作者简介:秦小明(1964-),男,副教授,博士,研究方 向为食品化学成分的分离,纯化,构造解析, 农产品贮藏与加工. 金娘果实泡酒饮用的习惯.据《纲目拾遗》记载,桃 金娘果实有"养血,明目";《本草求原》中记载 有"止痢,赤血带,生肌止血"的功效【3—1.因此, 它是一种目前尚未进行规模开发利用的药膳同源新资源, 具有较高的学术研究价值和开发利用价值. 近年来的研究结果表明,中草药中的一些多糖成分 被证实具有一系列的生理功能【5】,为了研究桃金娘果实 的多糖成分与生理功能的关联性,本文对新鲜桃金娘果 实和药店销售的干燥桃金娘果实的多糖成分进行了提取 分离和纯化,分别对其物理性质和化学结构进行了初步 的探讨. 1材料与方法 【6】邹祥,章克昌.姬松茸深层培养条件的研究【J】.药物【8】张惟杰.复合 多糖生化技术【M】.上海:上海科技出版社, 生物技术,2002,13(6):36.39. 【7】邹祥,章克昌.富锌培养对姬松茸生长代谢的影响【J】.无 锡轻工大学,2003,19(2):95.98. 1987. 【9】李欧平.红桂木凝素糖蛋白的特征及其糖肽键性质分析 . 广西医科大学,1999,2O(3):16-19. 802oo5.VoL26,No.4※基础研究 1.1材料 新鲜桃金娘果实(2002年8月采集于广西南宁市武鸣 县),桃金娘干燥果实(2002年10月购于广西南宁市中药 店),供本实验研究使用. 1.2实验方法与仪器条件 1.2.1糖,半乳糖醛酸,蛋白质含量的测定总糖含 量,半乳糖醛酸含量分别采用苯酚.硫酸法【】,咔唑.硫 酸法I,】和Biuret法Is】测定,分别使用阿拉伯糖,半乳糖, 半乳糖醛酸和牛血清蛋白(均为Sigma公司产品)作为标准 物质制作标准曲线计算样品中的含量. 1.2.2构成糖分析在糖样品(约5rag,使用螺旋耐压 试管)中加入2ml0.25mol/L硫酸后密封,于100"(2下加热 分解16h,用碳酸钡粉末中和,离心分离后按Blakeney 法【,】制备成各单糖的全乙酰化糖醇衍生物进行气相色谱 (GLC)分析f岛津GC.17A,柱温200?,Nz流速23ml/ rain),分离柱为岛津公司的毛细管柱DB.1(0.25mmx 30m). 2结果与讨论 2.1多糖的提取 称取桃金娘果实f鲜果355g,干果102g),分别加 入5倍量的三氯甲烷和甲醇(1:1,V,V)的混合溶剂,于 65,70?加热回流脱脂1h.抽滤后得到的残渣再加入上 述混合溶剂重复操作2次.将脱脂后的残渣,置于通风 橱中风干,使残留的有机溶剂挥发.在脱脂后的果实中 分别加入5倍量的冷水(4?左右)搅拌3h然后进行离心分 离(8000r/min,30min),取出上清液.残渣重新加入冷 水反复抽提,直至抽提得到的上清液用Molisch反应【lo] 检查呈阴性为止.将多次抽提所得上清液合并,得到 冷水抽提液:然后,将冷水抽提过的果实残渣加入5倍 体积的水,置于高压锅内,在121?条件下反复抽提, 直至抽提液的Molish反应呈阴性:将多次抽提液合并, 得到热水抽提液.将两种抽提液分别浓缩到约200ml 后,利用Sevage法ixl】除去部分蛋白质:然后加入3倍 量的95%的乙醇沉淀多糖.离心分离(8000r/rain,30rain) 得到的多糖沉淀用乙醇多次洗涤,然后重新加水溶解在 流动水中透析2d(截留分子量3000),将透析内液分别进 行冻结干燥得到冷水抽提粗多糖(CWpl,2)和热水抽提粗 多糖(HWp1,2). 上述操作所得的冷水,热水抽提粗多糖均为纤维状 棕褐色固体,它们的得率和部分化学组成如表1所示. 其中新鲜果实中的总水溶性多糖含量为3.3%(相对于脱脂 风干后的果实,此时水分含量为45%),而干燥果实为 9.2%(相对于脱脂风干后的果实,此时水分含量为8%). 把水分含量的影响除去,干燥果实与新鲜果实相比,总 水溶性多糖的含量减少了约45%.我们推测,其原因可 能在于果实干燥过程中,有一半左右的水溶性多糖被果 实自身的带有的酶类(如果胶酶等),微生物酶类(如纤维 素酶)等分解从而导致多糖含量下降. 从新鲜和干燥的桃金娘果实粗多糖中的构成糖分析 结果(表1)可知,冷水抽提出来的多糖含有大量的半乳糖 醛酸(CWp1:54%:CWp2:38.4%),表明抽提物可 能含有果胶多糖;而中性构成糖主要是阿拉伯糖和半乳 糖,它们的构成比例均为2:I(CWpl:47.1/20.6=2.2:1: CWp2:39.5121.4=1.9:1),另外,它们均含有少量的蛋 白质(表1).根据已经报道的文献资料[nn,12],我们推测 它们可能是由木聚糖,阿拉伯半乳聚糖(AG)或者阿拉伯 半乳聚糖糖蛋白(AGP)和果胶多糖等构成的多糖混合物. 热水抽出多糖HWp1组分含有较高的半乳糖醛酸 (72.9%),但HWp2则含有较低的半乳糖醛酸(24.7%): 从它们的主要构成单糖分析结果(表1)可以看出,阿拉伯 糖和半乳糖构成的比例约为1:I(HWpl:40.5/35.7=1.1:l: HWp2:30.6125.0=1.2:1),同时还含有大量的其他单糖 例如木糖和葡萄糖和鼠李糖等.因此,可以推测它们 可能是由果胶多糖,阿拉伯半乳聚糖(AG)或者阿拉伯半 乳聚糖糖蛋白(AGP)等多糖构成的混合物. 2.2粗多糖的分离,纯化 由于冷水可溶性粗多糖的得率比较低,因此我们首 先对热水抽出多糖HWp1和HWp2组分进行了研究探 讨.从前面的推测可知,HWp1和HWp2可能是由一 种或者数种杂多糖等构成的混合多糖.构成糖分析结果 表明,除了中性单糖例如木糖,阿拉伯糖,甘露糖, 鼠李糖,葡萄糖等外,同时还含有大量的半乳糖醛酸 (表1).根据这一组成特点,我们参考TsumurayatHI等 学者的方法,采用离子交换法尝试除去多糖以外的杂 质,同时对桃金娘的多糖成分进行分离纯化.用经过 HCO处理后的填充剂DEAE—Cellulose装好层析柱(2.5× 36cm),再按照下行法水洗12h,使层析柱平衡安定化. 分别称取HWpl和HWp2样品各100mg,加水10ml充 分溶解后上柱.首先用200ml蒸馏水进行洗脱,然后依 次用0.1,0.2,0.3,0.4和0.5mol/L的碳酸氢铵溶液进 行洗脱.流速控制在45ml/h,以3ml/管用自动收集器 收集,并跟踪测定总糖,半乳糖醛酸以及蛋白质含量. 如图1所示,在水,0.1,0.2,0.3和0.4mol/L处,两 个试样都出现了5个峰:HWp1_0,.1,一2,.3,.4 和HWp2.0,一1,.2,.3,一4(图1).结果表明,无 论是新鲜果实还是干燥果实均可能含有五种多糖成分, 但是各组分的峰面积高低不同,即含量不同.最明显 的区别在于:新鲜果实粗多糖由来的HWpl一4组分的峰 面积最大(即含量最多);而干燥果实粗多糖由来的 HWp2—0组分的峰面积最大(即含量最多).这个结果说明 ※基础研究2005,VoL26,No.481 在桃金娘果实的自然干燥过程中,其多糖成分的组成比 例(含量)发生了变化. 表1果实中粗多糖的化学组成和单糖构成 Table1Somepropertiesandsugarcomposi~onofcrude polysaccharidesextractedfromthefruitofRhodomyrtustomentosa 注:a以脱脂风干后的果实重量计(YiMdtothedriedfruit);b以冷冻升 华干燥后的干物质重计(Percenttodry-weightbasis);C气相色谱图 中的峰面积Lt(Mo1%). 将每个峰相对应的组分分别收集,浓缩,透析, 最后进行冷冻干燥得到了10个多糖组分.它们的得率, 一 般化学组成和构成单糖的分析结果如表2所示.从图 1和表2中不难看出,随着洗脱液碳酸氢铵浓度的升高, 样品的半乳糖醛酸的含量也呈升高的趋势,这个结果说 明,我们利用样品中含有的半乳糖醛酸和阴离子交换法 进行粗多糖的分离的设想是成功的.另外,无论是新 鲜还是干燥果实,H3和H4组分的半乳糖醛酸含量均在 50%以上(表2),同时构成糖中还含有大量的中性单糖. 因此,可以断定,H3和H4组分属于果胶多糖.由于 新鲜由来的H3和H4组分比干燥果实多,即意味着新鲜 果实比干燥果实含有更多的果胶多糖,在桃金娘果实的 自然干燥过程中,其多糖成分所发生的变化主要是由于 桃金娘本身所含有的果胶多糖的分解(被酶或者微生物大 1.O O-8 0.6 j 04 O.2 O 1.O O.8 0.6 釜0.4 O.2 O 010020o3004OO50o600 洗脱体积OmV管) Fractionnumber 图1HWpl和HWp2在DEAE-cellulose(HCO~型)层析柱上的洗脱曲 线 Fig.1EiutionprofilesofthepofysacchafidesHWplandHWp2OR aDEAE-cellulose(HCOform) 量分解或利用)造成的. 从新鲜果实由来的各多糖组分的构成糖分析结果(表 2)看,H0,H1和H2组分的主要构成单糖为阿拉伯糖和 半乳糖,它们的构成比例约为2—4:I(H0:50.6/22.5=2.2: l;H1:38.7/23.3=1.7:l,H2:53.8119.8=2.7:1),同时 含有木糖,甘露糖和葡萄糖等多种单糖以及一定量的半 乳糖醛酸(10%以下),另外还含有少量的蛋白质(10%以 下,见表2).经过与已报道过的文献进行比较[12,13},我 们推测它们可能属于一种复合多糖:阿拉伯半乳聚糖糖 蛋白(AGP).近年来的研究结果表明,AGP具有提高人 表2HWpl和HWp2由来的各多糖组分的化学组成和构成单糖 Table2SomepropertiesandsugarcompositionofeachfractionsisolatedfromHWplandHW p2 注:a以冷冻升华干燥后的}Pl和HWp2重计(YieMtothedriedHWPlandI-lWp2)b以冷冻升华干燥后的干物质重计(Percenttodry—weightbasis): C气相色谱图中的峰面积I:L(MoI%). 822005,Vo1.26,No.4食品重※基础研究 体免疫力,抑制肿瘤生长和细胞突变,延缓衰老,改 善人脑功能,提高机体工作能力抗遗传损伤,维护正常 细胞发育,提高脱氧核糖核酸损伤后的修复能力等多种 生理功能[12,14].至于在同一种植物果实中同时存在数种 具有生理功能的复合多糖AGP的可能性,Tsumuraya[】 和Saulnier[16]曾经报道过在葡萄,油菜籽,胡萝b中同 时存在2,3种具有生理功能的AGP;笔者在枸杞子多 糖的分离纯化研究中也有过类似的发现【l7~-.从以上的实 验结果看,桃金娘果实中也可能存在数种与AGP在组成 和结构上类似的复合多糖,如果通过进一步的实验将它们 进行分离纯化和构造解析,证实它们确实属于AGP,将 为说明桃金娘具有多种生理功能提供理论依据. 至于干燥果实由来的H0,H1和H2组分,它们的 构成单糖仍然十分复杂.H0组分仍然属于多糖混合物 的可能性很大,它可能是由阿拉伯半乳聚糖糖蛋白 (AGP),木聚糖和葡聚糖组成的混合物;Hl和H2组分 的构成单糖也十分复杂,?同时含有一定量的半乳糖醛 酸,我们推测它们可能是果实干燥过程中果胶多糖的被 分解后的产物.下一步我们将采用分离效果更好的硼酸 型DEAE:Cellulose层析柱进行实验来证实这些推测.另 外,我们还注意到,被推测可能属于果胶多糖的H3和 H4组分,除了含有大量的半乳糖醛酸(50%以上)外,同 时还含有较多的鼠李糖(表2).根据最新研究文献[20,21】, 我们推测它们可能是一个含有较多毛发区域(鼠李半乳糖 醛酸聚糖为主链)的果胶多糖.目前已确定结构的鼠李 半乳糖醛酸聚糖(RG)有两种:RG.I和RG—II,桃金娘中 的RG到底是属于哪一种,还有待于进一步的研究. 参考文献: 【1】原色中国本草图鉴编辑委员会.原色中国本草图鉴2【M】. 雄浑社,1982.405—4O7. 【2】桃金娘果酒的研制【J】.广西林业科学,1997,26(3):119- 122. 【3】王宗训.中国资源植物利用手册【M】.中国科技出版社, 1989.1334. 【4】中药大辞典(2)【M】.上海科技出版社,小学馆,1985.960- 961. 【5】田庚元.植物多糖的研究进展们.中国中药杂志,1995,20 (7):441444. 【6】DuboisMGilles,KAHamilton,JKRebers,eta1. 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