兔角膜内皮细胞载体的体外培养及移植的研究

25卷 5期 2006年 10月 中 国 生 物 医 学 工 程 学 报 Chinese Journal of Biomedical Er,gineering Vo1．25 No．5 October 2oo6 兔角膜内皮细胞载体的体外培养及移植的研究 位晓娟 刘万顺 韩宝芹 陈列欢 杨朝忠 (中国海洋大学海洋生命学院，青岛 266003) (青岛东方眼科医院，青岛 266021) 摘 要 ：以特定曲率的壳聚糖一硫酸软骨素共混膜为载体 ，构建兔角膜内皮。研究了共混膜的透光性、体外酶降解 性以及兔角膜内皮细胞在载体上的细胞贴附性、细胞形态及膜强度等性质。结果表明，共混膜的透光率达 90％以 上 ，生物降解性 良好。该共混膜有良好的细胞贴附性及机械强度 ；兔角膜内皮细胞可在共混膜上长成良好的单层 ， 细胞形态较好，并贴附牢固，振荡后细胞无脱落，膜片保持完整。将培养好的载体植入到去除内皮层的兔角膜中， 术眼在 56天内基本保持透明，说明体外构建的内皮可执行角膜内皮层的部分功能。 关键词 ：角膜内皮细胞；载体；培养；移植 In vitro Culture and Transplantation of Rabbit Corneal Endothelial Cells Car：t ier WEI Xiao—Juan2 LIU Wan—Shun HAN Bao—Qin CHEN Lie—Huan YANG Chao—Zhong (College ofMarine蜘 Science，Ocean University ofChiru~，Qingdao 266003) (Dong；fang Hospital ofOphthalmology，Qir,：gdao 266021) Abstract：The chitosan—chondrotion sulfate blend film，which had special curvature，was used to construct rabbit corneal endothelium n vitro．Its tmnsparence and biodegradability were favorable for a scaffold of corneal endothelial cells．The attachment and growth of rabbit corneal endothelial cells On the blend film was studied by cell culture． Rabbit corneal endothelial cells seeded on the membrane could form a good monolayer with good shape．The blend film showed good attachment to cells，which cmffirm ed the possibility of transplantation．The cultured cartier was transplanted into the rabbit’S eye，which was scraped of corneal endothelium．The eye cornea maintained clear for 56 days after surgery．which indicated that the carrier had carried out some functions of corneal endothelium． Key words：corneal endothelial cell； 中图分类号 R318 文献标识码 引言 cartier；culture；transplantation A 文章编号 0258—8021(2006：105—0590—06 角膜的高度透明性和光学性是正常发挥生理功 能的 必要 条件之 一，而角膜 内皮 细胞 (corneal endothelial cell，CEC)在维持角膜的正常生理功能方 面起重要作用⋯。角膜内皮细胞是角膜后层的单层 细胞，构成了后弹力层和房水之间的物理屏障，通过 离子“泵”功能调节角膜中离子浓度和水分，维持角 膜的半脱水状态，保证 角膜 的正 常厚度和透明 度 。一旦角膜内皮细胞功能出现紊乱，常导致 角膜水肿而使角膜部分甚至完全失去透明性 研究 证明 ，脊椎动物的角膜内皮在胚胎期具有有丝 分裂能：匀，但出生后细胞停滞在 Gf ／G．期，分裂活动 停止。： 多数灵长类动物(包括人)的角膜内皮细胞 属终末分化细胞，几乎无有丝分裂能力，并且随年龄 的增长细胞密度以 0．3％ ～0．6％的速率逐渐减少。 角膜对外界因素的影响极为敏感，眼科疾病、药物、 眼科手术、创伤等均能导致内皮损伤，从而使细胞减 收稿日期：2005．03—17，修回日期：2006-07—05。 基金项目：国家“十五”863(200IAA625050)和国家自然科学基金(30070220)资助项目。 *通讯作者。E—mail：wanshunliu@hotmail．COB 维普资讯 http://www.cqvip.com 5期 位晓娟等：兔角膜内皮细胞载体的体外培养及移植的研究 少的速度加快 ¨。角膜 内皮损伤后，临近细胞扩 张、移行，很快覆盖受损区域，但当内皮损伤达到某 一 临界值时，残存内皮的代偿难以维持角膜内皮单 层的完整，就会造成功能失代偿 ，导致角膜基质层水 肿、角膜混浊，严重时将致盲 目。每年全世界有 100 万以上的患者因角膜内皮细胞功能失代偿而导致失 明。目前，穿透性角膜移植术是取代病变或受损的 内皮细胞恢复角膜透明性的惟一方法，虽然手术成 功率高，但是受到供体来源的短缺、供体的老龄化及 术后并发症等现状的制约。因此 ，寻求可用于移植 的角膜，扩大供体来源，成为急需解决的问题 ¨ 。 1972年 Mauriee首次提 出了将组织培养的角膜 内皮 细胞移植到内皮细胞不健康的角膜上的设想，开辟 了角膜内皮细胞移植这一崭新 的研究领域 。自 二十世纪七十年代末 Gospodarowicz等 ¨首 次将培 养的牛角膜内皮细胞种植于异体角膜片载体上行同 种异体 CEC移植后，已进行了大量有关 CE细胞载 体培养及移植的实验 ¨ 。近 20年来，随着组织 工程的兴起，利用组织工程技术构建活性人工角膜 成为诸多学者关注的热点。活性人工角膜的核心是 体外构建角膜的等效物，达到永久性修复和重建损 伤角膜的目的，彻底解决角膜供体的来源及质量问 题。迄今为止，被作为角膜细胞培养贴附载体的材 料包括：异体角膜片，明胶薄膜，水凝胶膜以及后弹 力层膜等 。 ，并且，以以上材料为载体构建角膜上 皮、基质层已见报道 ’ ，尽管它们有良好的生物相 容性，但降解速度过慢或过快 ，机械强度不足等问 题 ，制约了其临床应用。 本实验以体外培养的兔角膜细胞为材料，以本 实验室研制的可生物降解的壳聚糖一硫酸软骨素共 混膜(Chitosan—Chondroitin Sulfate Blend MembraBe，Ch— Cs共混膜 )为角膜内皮细胞 贴 附载体 ，进行 了兔角 膜 内皮细胞在载体上的细胞形态 、贴 附牢 固度及膜 强度等方面的研究，并就兔角膜内皮细胞载体的植 入做了初步的探讨 ，结果如下 ： 1 材料 与方法 1．1 材料 新西兰白兔，约 1kg体重；DMEM，F12细胞培养 基(Gibco)；胎牛血清(中国医学科学院生物工 程研 究所)；青霉素钠，硫酸链霉素(石家庄制药集团有限 公司)；bFGF(暨南大学周长忍教授提供)；壳聚糖， 硫酸软骨素(本实验室制备并纯化)；海洋生物活性 提取物(N一乙酰氨基葡萄糖，壳寡糖，CM．壳寡糖，本 实验室制备并纯化，纯度分别为 99．82％，99．9l％， 99．80％)。 1．2 主要仪器 HF Safe 760S超净工作台(上海力申科学仪器有限 公司)；HF90 c01细胞培养箱(上海力申科学仪器有限 公司)；Olympus I3(70倒置式系统显微镜(日本)。 1．3 方法 1．3．1 细胞培养液的配制 基本培养基为 DMEM—F12(1：1)，按本实验室常 规配制。使用时加胎牛血清及双抗液，其浓度分别 为：胎牛血清 20％，硫酸软骨素 2．5％，青霉素钠 100F／mL，硫酸链霉素 50F／mL，bFGF 100ng／mL，海洋 生物活性提取物 100Fg／mL。 1．3．2 兔角膜内皮细胞的制备 取 50天的新西兰大 白兔 ，耳缘静脉空气栓塞处 死。无菌摘取眼球，生理盐水冲洗干净后，置于硫酸 庆大霉素生理盐水(1．6×10。U／mL)中浸泡 20min。 将眼球移至无菌培养皿中，在超净工作台上沿角膜 缘 内侧 环形剪 下全层 角膜 ，D—Hank’S轻轻 漂洗两 次 。手术显微镜下撕取后弹力层和角膜 内皮细胞 ， 置白瓷板上，加几滴细胞培养液浸泡 。眼科剪将带 有角膜 内皮细胞的后 弹力层剪成 7块 ～8块 ，内皮 面向下平铺于细胞培 养瓶 中，加少量 细 胞培 养液 ， 37℃，5％CO，细胞培养箱倒置培养 2．5h，待组织块 贴附牢 固之后 ，轻轻翻转培养瓶 ，37℃ ，5％CO，细胞 培养箱继续培养。24h后 ，补 足细胞培 养液 至 2mL， 72h后 ，细胞半换液。 24h后 ，可见细胞呈 圆形或多角 形从组织块边 缘伸展迁出，胞浆丰富，透明度好。5d后细胞长成 单层，细胞近六角形，呈“铺路石子”状，与天然角膜 内皮细胞极 为相似。 1．3．3 兔角膜内皮细胞的传代培养 待细胞长满皿底彼此紧密连接成单层时，吸弃 细胞培养液， Hank’S液冲洗两次，加入 0．25％胰 蛋白酶液消化，显微镜下可见胞质回缩，细胞变圆， 吸去消化液，加细胞培养液终止消化，轻轻吹打离散 细胞，以5×10 个／mL细胞数移至培养瓶中继续培 养。培养条件及方法同原代培养。 1．3．4 Ch—Cs：共混膜的制备及处理 已纯化的壳聚糖和硫酸软骨素按一定配比加入 2％的醋酸溶液中，流延成膜。膜经 0．1mol／L NaOH 溶液中和后，三蒸水洗至中性，干燥。眼科环钻制成 适宜大小的圆片，经交联剂处理，特制压膜模具上压 制成一 定 曲率，再依 次用三蒸 水、75％乙醇、D． 维普资讯 http://www.cqvip.com 中 国 生 物 医 学 工 程 学 报 Hank’s液处理，最后置细胞培养液中，4℃保存备用。 1．3．5 Ch．Cs共混膜的透光性测定 将膜片剪成宽度为 1．0cm的小块，贴于比色皿 的内壁，加水。以不贴膜的比色皿加水为对照。测 定膜片在特定波长 (400nm、500nm、600nm、700nm、 800nm)下的透光率。 1．3．6 Ch．Cs共混膜的溶菌酶降解试验 溶菌酶以0．05mol／L的磷酸缓冲液(pH=6．6)，配 成20000u／mL浓度，加入数支试管中，每管 5mL。共 混膜裁成直径 10mm圆片，水充分浸泡后于 100℃干 燥 2小时，称重。每支试管加入 3个膜片，置于37℃ 的恒温水浴中，酶水解膜片，每 3d更换一次酶液，并 观察膜片的降解情况。若膜片完整还能取出，则用水 浸泡，100~C烘干2h，称重，计算膜片的降解百分率。 1．3．7 兔角膜内皮细胞在 ch．cs膜上的培养 1．3．7．1 细胞悬液的制备 取2代 ～4代的兔角膜内皮细胞，处理方法同 兔角膜内皮的传代培养。调整细胞悬液的浓度至约 5×10 个／mL～1 X 10。个／mL，备用。 1．3．7．2 细胞在 Ch—Cs共混膜上的培养 无菌48孔板用 D—Hank’8液冲洗后，将处理好 的膜片轻轻铺于孔中，待膜片贴附牢固后，轻轻加入 细胞悬液，每孔 150~L。37℃，5％cO 细胞培养箱中 培养 。 1．3．7．3 Ch．Cs共混膜上细胞的形态观察 倒置显微镜下观察细胞在 ch．cs共混膜上的增 殖状况及形态特点 ，摄像。 1．3．7．4 Ch．Cs共混膜上细胞贴附牢 固度及共混膜 强度的检查 细胞在膜上长成单层后，分别在第 l天、5天、 l0天、15天、20天，用眼科镊取出膜片，于 D．Hank’S 液中轻轻振荡冲洗，倒置显微镜下观察，检查细胞有 无脱落现象 ，以评价细胞在膜上 的贴附牢固度。检 查膜片有无脆裂现象，以评价膜片在 37℃细胞培养 条件下的机械强度，为活性细胞载体膜片的植入可 行性提供依据。摄像纪录振荡前后的结果。 1．3．8 兔角膜内皮细胞载体的移植 取新西兰大白兔 12只 ，养一周观察无异常。移 植前准备好载有内皮细胞的 ch．cs共混膜片载体 (供体)。动物麻醉后，将直径为7．7ram的环钻转入 角膜基质层，制作前部角膜片，后部角膜用 5．5ram 的环钻切取，制成角膜塞，取下角膜塞。刮去内皮 层，将载有内皮细胞的 ch．cs共混膜片植片植入到 角膜内皮位置，载有细胞的一面靠近房水。再将前 25卷 部角膜片缝合回位。术后 1％地塞米松和氯霉索滴 眼液滴术眼，每天4次，观察记录术眼情况 。 2 结果 2．1 Ch．Cs曲率膜片照片 图 1 Ch．Cs共混膜 照片(侧面观 ) Fig．1 Light micrograph of Ch-Cs blend mm (side view) 图 2 Ch—Cs共混膜 照片(正面观 ) Fig．2 Light micrograph of Ch—Cs blend film (obverse view} 2．2 Ch．Cs共混膜的透光·陛 共混膜中高分子间的相容性与形成膜的透光性 有直接关 系，若相容性差 ，则在两相界面发生光的散 射或反射，膜的透光率低。从图 3中可以看出共混 膜片在 500nm以上可见光范围内的透光率均大于 90％，表 明该膜片有 良好 的透光性 ，膜中的壳聚糖和 硫酸软骨索达到了较好的相容。 2．3 共混膜的溶菌酶降解试验结果 酶水解 48 h后，膜片变薄，酶液中有细小颗粒， 随着时间延长 ，颗粒增多，酶液变混浊，膜片透光性 变差。9d时降解百分率为 29％，18d时为 58．3％， 21d后膜片降解成碎片，无法取出称重。 2．4 免角膜内皮细胞在 Ch．Cs共混膜上生长形态 的显微镜观察结果 细胞接种到膜上24h后，伸出伪足紧密贴附在 膜上，呈多角形或短梭形，胞浆丰富，胞体透明。72h 后，细胞问以伪足相连接，出现“拉网”现象 ，细胞密 维普资讯 http://www.cqvip.com 5期 位晓娟等：兔角膜内皮细胞载体的体外培养及移植的研究 400 500 600 700 800 900 Wavelengh(nm) 图 3 Ch-Cs共混膜的透光翠 Fig．3 Transparence of Ch-Cs blend脚m 集区域细胞连接成片，聚集生长。10天后，细胞长 成良好单层，细胞呈近六角形或多角形，细胞问排列 紧密。此时已无法观察到膜片的结构。结果表明兔 角膜内皮细胞与 Ch．Cs共混膜有很好的生物相容 性，并能在共混膜上形成细胞单层。 图 4 兔角膜 内皮细胞在 Ch．Cs共混膜上 (24h)100× Fig．4 Corneal endothefial cells seeded on the Ch-Cs blend film (24h)100× 图5 兔角膜 内皮细胞在 Ch-Cs共 混膜上 (10d)100 X Fig．5 Corneal endothelial cells seeded on the Ch-Cs blend film (10d)100 X 2．5 Ch-Cs共混膜上细胞贴附牢固度及共混膜强 度的检查结果 振荡前，细胞在膜上已长成良好单层，膜片无碎 裂。振荡后，细胞在膜上仍为完整的单层，很少有细 胞脱落，细胞形态 良好。膜片仍保持完整。结果表 明兔角膜内皮细胞在 Ch．Cs共混膜上有很好的贴附 牢固度，膜片本身也具有较强的机械强度，为活性角 膜内皮细胞载体移植提供了可行性。 图6 振荡前 Ch．Cs共混膜上的细胞(15d，100×) Fig．6 Corneal endothefial cells on the Ch-Cs blend film before surging(15d。100×) 图 7 振荡后 Ch-Cs共 混膜 上的细胞 (15d，100×) Fig．7 Corneal endothelial cells on the Ch-Cs blend film after surging(15d。100 x) 2．6 兔角膜内皮细胞载体移植的结果 术后对动物跟踪观察 发现 ，在第 14天所有术 眼角膜保持透明，无明显水肿，无新生血管生成，如 图7昕示。第 28天、56天时术眼角膜基本保持透 明，缝线在原位。80天左右时出现眼部感染，眼睑 出现较多分泌物，角膜手术部位有新生微血管生长， 并且有“云”状物产生 ，角膜透明度逐渐降低。 图 8 术后 14天 Fig．8 14 days after the surgery ∞ 如 ∞ 加 ∞ ∞ ∞ 如 加 m O 维普资讯 http://www.cqvip.com 中 国 生 物 医 学 工 程 学 报 图 9 术后 28天 Fig．9 28 days after the surgery 图 lO 术后 56天 Fig．10 56 days after the surgery 图 ll 术后 81天 Fig．11 81 days after the surgery 3 讨论 角膜疾患是致盲的主要因素之一，但角膜材料 的严重匮乏制约了角膜病的治疗。我国约有 100万 角膜盲患者，而每年能进行的同种异体角膜移植仅 为 3000例左右。角膜内皮盲患者约占角膜盲总人 数的 1／3～1／4，因而扩大角膜内皮的供体来源迫在 眉睫。自 Griffith成功培养出人体角膜等效物 以 来0 ，组织工程角膜的研究成为众人关注的热点。 利用组织工程技术构建人工角膜，是解决角膜供体 来源及质量的最彻底途径，并且有可能避免术后免 25卷 疫排斥反应。尽管在人工角膜的研究方面取得了一 些进展，但还存在不少问题。 理想的角膜内皮细胞载体是组织工程化角膜急 需解决的关键问题之一。良好的生物相容性、生物 降解速度的可控性以及其降解速度和角膜内皮形成 速度的匹配性是对载体材料性质的基本要求。目前 的组织工程角膜尚未达到此种要求。尽管利用异体 角膜后弹力层、羊膜、胶原、壳聚糖等材料体外构建 角膜内皮、上皮已见报道，并且动物试验也有一些进 展 ，但离临床应用的要求还相差甚远。 壳聚糖是一种天然多糖，具有无毒、无刺激、无 免疫源性、无热源性、无致突变性，又有 良好的组织 相容性：和生物可降解性 ，在医用材料领域应用前景 广阔 。运用壳聚糖已成功构建了人工骨、软骨、 皮肤等各种组织，但用壳聚糖构建兔角膜内皮细胞 载体尚未见报道。本实验将 ch．cs共混膜制成特定 曲率，初步研究了透光性和体外生物可降解性，结果 表明该膜透光率达 90％以上，溶菌酶降解良好。以 此共混膜为载体培养兔角膜内皮细胞，进行了细胞 形态、细胞贴附性 、膜强度 等方 面的研究，并将 已长 成良好细胞单层的角膜内皮细胞载体进行了植入研 究，裂隙灯追踪观察术后反应。体外培养的兔角膜 内皮细胞在 ch．cs曲率膜上 10天后便可长成单层， 细胞间连接紧密 ，呈近六角形或多角形 ，与天然角膜 细胞的形态极为相似，说明 ch．cs共混膜适合兔角 膜内皮细胞的生长条件 ，与角膜 内皮细胞有 良好 的 相容性：。细胞在膜上长成单层后，不同的时间取出 膜片在 D。Hank’s液中轻轻振荡，显微镜下观察细胞 几乎无脱落现象，膜片本身无脆裂现象，证明细胞与 膜的贴附强度良好，而膜片在经过 37℃细胞培养条 件的孵育后也保持了较好的机械强度，为内皮细胞 活载体膜的移植提供了依据。通过去除兔角膜内皮 层，制备内皮缺损动物模型，将 ch—cs共混膜植入到 角膜内皮部位以期代替天然内皮层的功能。对动物 进行实验观察发现，术眼在 56天内基本保持透明， 无明显水肿，说明植入的内皮载体己经部分地发挥 内皮功能，能调节营养物质进出和新生代谢产物的 释放。在 80天左右角膜眼睑处出现分泌物增多，手 术部位微血管生长，并产生“云”状物，角膜透明度逐 渐下降，其原因有待于进一步深入研究。 参考文献 [1] 耿燕，杨朝忠．角膜内皮细胞载体培养及移植的研究进展．中 国实用眼科杂志『J]．2004，22(2)：92—94． 维普资讯 http://www.cqvip.com 5期 位晓娟等：兔角膜内皮细胞载体的体外培养及移植的研究 595 [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [12] [13] [14] [15] Nancy C，Joyce Proliferative capacity of the corneal endothelium [J]．Progress in Retinal and Eye Research．2003，(22)：359—389 Vincentr P．T，Hoppenreijs，Elisabeth Pels，Gijs F．J M，Vrensen． Corneal endothelium and growth factors[J]．Survey of ophthalmology．1996，41(2)：155—163． 罗小玲．角膜内皮细胞移植术的新进展[J]．国外医学眼科学 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